Thèse de doctorat : Biologie moléculaire végétale : Strasbourg 1 : 2008. / Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. p. 126-140.

Das Herz ist physiologisch auf einen fein regulierten und ausgeglichenen bioenergetischen Energiehaushalt angewiesen, um auf akute Belastungssituationen adäquat reagieren zu können und oxidativen Stress zu vermeiden. Ca2+ reguliert zentral sowohl die zyklischen Kontraktions-/Relaxationsprozesse (ECC) als auch unmittelbar den mitochondrialen Metabolismus. Der ECC liegt in den Kardiomyozyten die Ca2+- Freisetzung durch die RyR2 zu Grunde; die IP3 Rezeptoren des sarkoplasmatischen Retikulums (SR) führen davon unabhängig zu einer Ca2+ Freisetzung aus dem SR. Diese IP3R vermittelten Signale werden in den räumlich nahe gelegenen Mitochondrien zum Teil über den mRyR1 in die mitochondriale Matrix aufgenommen und stimulieren dort langfristig die oxidative Phosphorylierung und den Erhalt der antioxidativen Kapazität. Die enge räumliche Nähe zwischen SR und Mitochondrien wird durch Strukturproteine wie Mitofusin 2 (Mfn2) ergänzt, die das SR mit der äußeren Mitochondrienmembran koppeln und so die Ca2+-Interaktion beeinflussen. Ziel der Arbeit war, den Effekt von Mfn2 Defizienz auf die IP3 induzierte mitochondriale Ca2+-Regulation in Kardiomyozyten zu evaluieren. Dazu erfolgten Fluoreszenzfärbungen an adulten isolierten Ventrikelkardiomyozyten kardiospezifischer Mfn2 Knock-Out (KO) Mäusen bzw. deren wildtypischen Geschwistertieren (WT). Erhobene Parameter umfassten das mitochondriale Ca2+, das mitochondriale Membranpotenzial, die mitochondriale Superoxidbildung und mitochondriale ATP-Gehalt. Die Ergebnisse bestätigten eine Signalachse, bei der die Stimulation von isolierten murinen Kardiomyozyten mit dem IP3 Agonisten ET-1 zu einer mitochondrialen Ca2+ Aufnahme führte, dem Erhalt des mitochondrialen Membranpotenzials diente und der ATP Gehalt stiegt. Bei induzierter kardiospezifischer Ablation von Mfn2 geht diese SR-mitochondriale Interaktion verloren, und es entstand ein energetisches Defizit sowie eine verminderte Superoxidbildung. Bei beta-adrenerger Stimulation mit Isoproterenol (ISO) resultierte in WT zwar eine mitochondriale Ca2+-Aufnahme, allerdings ein Abfall des ATP-Gehaltes. In den Mfn2 defizienten Kardiomyozyten zeigte sich eine Steigerung des ATP-Gehaltes auch auf beta-adrenerge Stimulation, die einen energetischen Kompensationsmechanismus in den Mfn2 KO Tieren vermuten lässt. Dies identifiziert Mfn2 als kritische Strukturkomponente für die basale bioenergetische Adaptation der durch IP3R-mRyR1 vermittelten Signalachse unter physiologischen Bedingungen. / Under physiological conditions the heart needs a finely tuned bioenergetic adaptation system to adequately match sudden changes in the workload and to avoid oxidative stress. Ca2+ regulates the excitation-contraction-coupling (ECC) as well as the mitochondrial metabolism. The ECC is based on the release of Ca2+ via the RyR2 while the IP3 receptor (IP3R) releases Ca2+ independently from the sarcoplasmatic reticulum (SR). The signals from the latter are taken up by the surrounding mitochondria via the mRyR1 channel to stimulate both the basal oxidative phosphorylation and the antioxidative capacity. The close functional relationship between mitochondria and SR is affected by membrane-coupling proteins like mitofusin 2 (Mfn2) that may influence the Ca2+ transmission. This work aimed at evaluating the effect of Mfn2 deficiency on the IP3-induced mitochondrial calcium regulation in cardiomyocytes. Mitochondrial Ca2+ uptake, membrane potential, redox state and ATP generation were monitored in isolated ventricular cardiomyocytes of cardio-specific mitofusin 2 Knock-out (KO) mice and their wildtype littermates (WT) via fluorescent staining using laser scanning confocal microscopy. The results show that stimulation with the IP3 agonist ET-1 led to mitochondrial calcium uptake, ATP generation and maintained mitochondrial membrane potential. The cardio-specific loss of the tethering protein Mfn2 resulted in an energetic deficit and decreased levels of superoxide. Beta adrenergic receptor activation with isoproterenol (ISO) in WT resulted in a mitochondrial calcium uptake but decreased ATP content, while leading in Mfn2 KO cardiomyocyte to increased levels of ATP, pointing probably towards an energetic compensatory mechanism. Taken together these results propose Mfn2 as a critical structural component that affects under physiological conditions the privileged SR-mitochondrial metabolic feedback mechanism via IP3R and mRYR1 to maintain normal cardiac function and bioenergetics.

Thèse ou mémoire avec insertion d'articles. / L'endothélium cornéen est la couche cellulaire la plus postérieure de la cornée. Elle a pour rôle de maintenir la cornée en déturgescence nécessaire à sa transparence. À cette fin, les cellules endothéliales cornéennes agissent comme une barrière pour limiter l'entrée de liquide et, à l'aide de pompes Na⁺/K⁺ ATPases, expulsent les liquides du stroma cornéen vers la chambre antérieure. La dystrophie endothéliale cornéenne de Fuchs (FECD) est une maladie de la cornée qui compromet le rôle de l'endothélium menant à des pertes de vision. La pathologie est caractérisée par une perte de cellules endothéliales accélérée et la formation d'excroissances de matrice extracellulaire appelées les guttaes. La perte de l'intégrité de l'endothélium cornéen provoque des infiltrations de liquide dans le stroma menant à une perte de la transparence de la cornée. Le seul traitement curatif pour la FECD est la transplantation de cornée pour laquelle la quantité de greffons est limitante. Les causes de la FECD ne sont pas encore bien comprises. Toutefois il existe des évidences d'une implication des mitochondries et du stress oxydatif. Ces deux éléments seraient liés dans un cercle vicieux où les dommages mitochondriaux causés par le stress oxydatif mèneraient à une augmentation de la production d'espèces réactives de l'oxygène. L'effet de ce cercle vicieux sur la fonction mitochondriale et comment cela affecte la progression de FECD reste peu connu et c'est à ce niveau que les travaux de cette thèse sont contributoires. En prenant en compte la démonstration de variation dans la masse mitochondriale entre les cellules endothéliales FECD réalisée précédemment dans notre équipe, nous avons tout d'abord lié la masse mitochondriale à des marqueurs de santé mitochondriale et d'état de la cellule. Ceci a permis de lier ces marqueurs à la progression de la pathologie. En effet, nous avons montré que le statut apoptotique et oxydatif ainsi qu'un niveau de calcium et de potentiel membranaire mitochondrial des cellules de l'endothélium provenant de patients FECD variaient en fonction de leur masse mitochondriale. Nous avons émis l'hypothèse que les variations de masse mitochondriale observées sont liées à des évènements dans la progression de la FECD liée à une surutilisation mitochondriale qu'on a appelé le «burnout mitochondrial». Nous avons ensuite lié la présence des guttae aux différents indicateurs du «burnout mitochondrial». En mesurant l'aire des guttae en conjonction avec les marqueurs de santé mitochondriale et d'état cellulaire, il a été possible de montrer que la présence des guttae est liée à un bilan négatif pour la santé mitochondriale et le statut apoptotique et oxydatif des cellules endothéliales des patients FECD. Nos travaux montrant que l'endommagement des mitochondries par la FECD jouait un rôle central dans la progression de la pathologie nous ont permis de soulever l'hypothèse que l'ajout de mitochondries saines dans les cellules endothéliales ralentirait la progression de la pathologie. Pour tester cette hypothèse, nous avons transplanté des mitochondries via la co-incubation avec des endothélia de patients FECD. Nous avons ensuite évalué l'effet de la transplantation de mitochondries sur les différents marqueurs cellulaires de progression de la FECD. Une amélioration de la santé mitochondriale, autant au niveau du potentiel mitochondrial que du calcium mitochondrial et de la mitophagie, a été observée à la suite de la transplantation. Nous avons également observé une amélioration de l'état cellulaire par la diminution du stress oxydatif et une perte du statut apoptotique pour la majorité des cellules endothéliales. Les travaux de cette thèse mettent en lumière une chronologie des évènements de la FECD liés à la progression de la pathologie ainsi que l'apparition de guttae. Ces travaux présentent aussi une nouvelle avenue de traitement pour la FECD en utilisant la transplantation mitochondriale. Cela pourrait permettre de diminuer, voire d'abolir, le besoin de greffons de cornée pour traiter la pathologie. / The corneal endothelium is the most posterior cell layer of the cornea. Its role is to maintain the cornea in deturgescence which is necessary for its transparency. To this end, corneal endothelial cells act as a barrier to limit fluid entry and, with the help of Na⁺/K⁺ ATPase pumps, expel fluids from the corneal stroma to the anterior chamber. Fuchs corneal endothelial dystrophy (FECD) is a corneal disease that compromises the role of the endothelium leading to loss of vision. The pathology is characterized by accelerate dendothelial cell loss and the formation of extracellular matrix growths called guttae. The loss of integrity of the corneal endothelium causes fluid infiltration into the stroma leading to a loss of corneal transparency. The only curative treatment for FECD is corneal transplantation for which the quantity of grafts is limited. The causes of FECD are not well understood yet, however there is evidence of the involvement of mitochondria and oxidative stress. These two elements appear to be linked in a vicious circle where mitochondrial damage caused by oxidative stress leads to an increase in the production of reactive oxygen species. The effect of this vicious circle on mitochondrial function and how it affects the progression of FECD remains unknown and it is at this level that the work of this thesis is contributory. Considering the demonstration of variation in mitochondrial mass between FECD endothelial cells made previously in our team, we first linked mitochondrial mass to markers of mitochondrial health and cell status. This made it possible to link these markers to the progression of the pathology. Indeed, we showed that the apoptotic and oxidative status as well as a level of calcium and mitochondrial potential of endothelial cells from FECD patients varied according to their mitochondrial mass. We hypothesized that the observed mitochondrial mass variations are related to events in the progression of FECD related to mitochondrial overuse that we have named "mitochondrial burnout". Then, we linked the presence of guttae to different indicators of "mitochondrial burnout". By measuring the area of guttae in conjunction with markers of mitochondrial health and cellular state, it was possible to show that the presence of guttae is linked to a negative outcome for mitochondrial health and the apoptotic and oxidative status of cells. endothelial disease of FECD patients. Our work shows that the damage of mitochondria by FECD plays a central role in the progression of the pathology, we raised the hypothesis that the addition of healthy mitochondria to endothelial cells would slow down the progression of the pathology. To test this hypothesis, we transplanted mitochondria via co-incubation to FECD patient endothelium. We then evaluated the effect of mitochondria transplantation on the different cellular markers of FECD progression. An improvement in mitochondrial health, both in terms of mitochondrial potential and mitochondrial calcium and mitophagy, was observed following transplantation. We also observed an improvement in the cellular state by the reduction of oxidative stress and a loss of apoptotic status for a majority of endothelial cells. The work of this thesis sheds light on a chronology of FECD events related to the progression of the pathology as well as the appearance of guttae. This work also presents a new avenue of treatment for FECD using mitochondrial transplantation. This could reduce or even eliminate the need for corneal grafts to treat the pathology.

Résumé : L'un des problèmes les plus difficiles auquel les technologies liées aux nanomatériaux font face est l'impact qu'elles ont sur la santé humaine et l'environnement. Il est donc primordial d'étudier les effets toxicologiques de ces technologies dont l'utilisation est très répandue dans divers domaines d'application. Par conséquence, dans ce projet, la cytotoxicité des matériaux présents dans la synthèse de nanotubes de carbone mono-parois (SWCNTs) par plasma thermique inductif (des matières premières au produit final) a été évaluée. Tout d'abord, l'influence du procédé plasma thermique inductif sur les propriétés physico-chimiques et cytotoxiques des matières premières (les catalyseurs commerciaux Co, Ni, Y203, Mo et le noir de carbone) a été déterminée. Un effet cytotoxique plus important a ainsi été révélé pour le Co commercial. De plus, bien que le procédé de plasma affecte les propriétés physico-chimiques de chaque catalyseur, seule la cytotoxicité du Ni a augmenté. La comparaison des particules de Ni après traitement par plasma avec les nanoparticules de Ni commerciales, a révélé que ces particules ayant pourtant une surface similaire avaient des cytotoxicités différentes. De plus, la toxicité des catalyseurs n'était pas principalement due à la libération d'ions. Afin d'évaluer la capacité du procédé de plasma thermique inductif à synthétiser des SWCNTs de haute qualité en utilisant des catalyseurs non toxiques, les effets du type et de la quantité de trois mélanges de catalyseurs (Ni-Y203, Ni-Co-Y203, et Ni-Mo-Y203) sur la production de SWCNTs ont été examinés. Les calculs thermodynamiques, en phase gazeuse et dans la phase de solution liquide, ont également été réalisés. Les résultats ont montré que le type de catalyseur affecte la qualité des SWCNTs et une qualité similaire peut être produite lorsque la même quantité de Co a été remplacée par le Ni. L'influence des SWCNTs produits avec trois mélanges de catalyseurs sur le comportement des préostéoblastes marins MC3T3-E I a été évaluée. Les SWCNTs ont été ajoutés sur les cellules attachées ou les cellules ont été ensemencées sur des plaques recouvertes de SWCNTs. Les SWCNTs ajoutés sur les cellules attachées affectent considérablement la viabilité cellulaire. Toutefois, la viabilité des cellules ensemencées sur les SWCNTs a seulement légèrement diminué à 24 h, même pour celles ensemencées sur les SWCNTs produits avec Ni-Co-Y203. De plus, les cellules peuvent proliférer en présence des SWCNTs dans les 48 h. Ainsi, sauf perturbation mécanique membranaire, ces SWCNTs ne semblent pas induire de cytotoxicité sévère sur les préostéoblastes. Les SWCNTs ont donc été purifiés et leur influence sur la prolifération des préostéoblastes, l'activation de la voie des BMPs ou Smad et la différenciation ostéoblastiques induites par l'addition de BMP-2 et BMP-9 a été étudiée. Le prétraitement des cellules par des SWCNTs pendant 24 h a accéléré l'activation des Smad1/518 induite par les BMPs. Après 72 h d'incubation avec BMP-2 ou BMP-9, les préostéoblastes prétraités avec des SWCNTs exprimaient des gènes codant pour des marqueurs ostéogéniques comme ostérix et octéocalcine et présentaient une forte activité de la phosphatase alcaline. Fait intéressant, la BMP-9 a favorisé la différenciation des préostéoblastes prétraités avec les SWCNTs de manière plus importante que la BMP-2. Par conséquent, la combinaison de la BMP-9 avec les SWCNTs semble être une voie prometteuse pour ta régénération osseuse. // Abstract : One of the most challenging issues that the technologies related to nanomaterials face is the impact they have on human health and environment. It is therefore of great importance to investigate the toxicological impacts of these technologies prior to their widespread utilization in different fields of application. Therefore, in this study, the cytotoxicity of the materials present throughout the process of single-walled carbon nanotubes (SWCNTs) synthesis by induction thermal plasma (from the feedstock materials to the final product) was evaluated. First of all, the influence of the induction thermal plasma process on the physico-chemical and cytotoxic properties of feedstock materials (i.e. commercial Co, Ni, Y203, Mo catalysts and carbon black) was investigated. The strongest cytotoxicity was observed for commercial Co compared to other catalysts. Although the thermal plasma process affected the properties of all catalysts, only the cytotoxicity of Ni was increased. Comparing the properties and cytotoxicity of the plasma treated Ni particles with commercial Ni nanoparticles revealed that the particles with similar surface area had different cytotoxicities. Plus, the observed cytotoxicity of the catalysts was not mainly due to the release of ions. In order to evaluate the capacity of the RF induction thermal plasma process to produce high quality SWCNTs using non-toxic catalysts, the effects of the type and quantity of three catalyst mixtures (Ni-Y203, Ni-Co-Y203, and Ni-Mo-Y203) on SWCNTs synthesis were examined. Thermodynamic calculations, in gas and particularly in liquid solution phases, were also performed. The results showed that catalyst type affected the quality of the SWCNT final product and similar quality SWCNTs was produced when the same amount of Co was replaced by Ni. Then, to investigate the cytotoxicity of the SWCNTs produced with the three catalyst mixtures, their effect was evaluated on the behavior of murine MC3T3-E1 preosteoblasts. Either SWCNTs were added on the attached cells or cells were seeded on the SWCNT-covered culture plates. SWCNTs which were added on the attached cells reduced cell viability drastically in a dose-dependent manner. However, the viability of the cells seeded on SWCNTs was only slightly decreased at 24 h, even on those produced with Ni-Co-Y203. Moreover, cells could proliferate within 48 h. Thus, except mechanical membrane disturbance, thermal plasma grown SWCNTs seemed to induce no severe cytotoxicity on MC3T3-El preosteoblasts. Consequently, SWCNTs were purified and their influence on the viability and proliferation of MC3T3-El preosteoblasts was determined. The impact of SWCNTs on Smad activation and cell differentiation induced by BMP-2 and BMP-9 was also studied. SWCNTs pm-treatment accelerated the Smadl/5/8 activation induced by both BMP-2 and BMP-9. It did not reduce the viability of preosteoblasts but slightly affected their proliferation at 48 h. Furthermore, after 72 h incubation with BMP-2 or BMP-9, preosteoblasts pm-treated with SWCNTs for 24 h could express genes encoding osteogenic markers such as osterix and osteocalcin and showed high alkaline phosphatase activity. Interestingly, BMP-9 favored the differentiation of preosteoblasts pre-treated with SWCNTs more remarkably than BMP-2. Therefore, combination of BMP-9 with SWCNTs seems to be a promising avenue for bone regeneration. [symboles non conformes]

Les chloroéthylurées (CEUs) sont de nouveaux agents antinéoplasiques dont l'effet sur les bicouches lipidiques dépend fortement de la nature de leur substituant R et est corrélé avec leur action pharmacologique. De plus, il a été démontré que certaines CEUs ont un effet sur la protéine VDAC (voltage-dependent anion channel). Nous avons étudié l'interaction entre sept CEUs et trois membranes modèles reproduisant les membranes mitochondriales externes et internes et la membrane du réticulum endoplasmique. Les résultats obtenus indiquent que les CEUs ont un effet important sur les membranes modèles. De plus, le positionnement des CEUs à l'intérieur de bicelles isotropes a été étudié par RMN du ' H en solution. Finalement, la protéine VDAC a été extraite et purifiée avec succès à partir de mitochondries et son insertion a été tentée dans le système modèle reproduisant la membrane mitochondriale externe. Les résultats démontrent que l'insertion dans la membrane modèle est inefficace.

Sous le terme de maladies mitochondriales, on désigne des maladies multi-systémiques ou à expression tissu-spécifique dues à un déficit de la phosphorylation oxydative qui est assurée par le fonctionnement de 5 complexes protéiques enzymatiques (chaîne respiratoire) parmi lesquelles 13 sous-unités sont codées par le génome mitochondrial, les autres par le génome nucléaire. Ces pathologies recouvrent donc en pratique des maladies génétiques par mutation de l’ADN mitochondrial (ADNmt) mais aussi des maladies génétiques à hérédité mendélienne classique. Dans les cytopathies mitochondriales liées à des mutations de gènes nucléaires, il existe deux sortes de gènes (i) à effet direct correspondant à des gènes codant pour les sous-unités protéiques de la chaîne respiratoire ou leur assemblage, et (ii) à effet indirect correspondant à des gènes codant pour des protéines impliquées dans le maintien et la réplication de l'ADN mitochondrial. Des mutations dans cette dernière classe de gènes peuvent s'accompagner d'anomalies quantitatives ou qualitatives de l'ADNmt : déplétion de l'ADNmt (réduction majeure du nombre de molécules d'ADNmt) et délétions multiples.Après des dosages enzymatiques de l’activité des complexes respiratoires mitochondriaux chez les patients, le ou les types de complexes altérés sont connus. Un grand nombre de gènes mutés responsables de pathologies mitochondriales ont été identifiés, tous codant des constituants des différents complexes de la chaîne respiratoire. Ces dernières années, le groupe d’Agnès Rötig (Hôpital Necker, Paris) a identifié de nouveaux gènes grâce à une approche gènes candidats ou grâce à des tours de génome de familles consanguines de patients qui permettent de délimiter une région chromosomique portant la mutation à l’état homozygote. La validation de l’effet délétère de la mutation identifiée se fait en général en utilisant des organismes modèles d’étude comme les cellules humaines en culture ou bien la levure. Cependant, il reste un grand nombre de cas où la mutation n’a pas pu être identifiée, soit parce que le déficit de tel ou tel complexe ne met pas en jeu un des composants connus de ce complexe ou bien plusieurs complexes de la chaîne respiratoire sont déficitaires mettant en jeu, dans un grand nombre de cas, le maintien de l’ADN mitochondrial pour lequel peu de gènes sont connus.Au laboratoire d’Orsay, nous disposons de deux organismes modèles d’étude, la levure S. cerevisiae et le nématode C. elegans. La levure S. cerevisiae est l’organisme modèle de choix pour étudier les fonctions mitochondriales grâce à ses caractéristiques comme la respiration facultative, mais aussi et surtout par la puissance de sa génétique et le fait que les mitochondries peuvent être transformées. Cependant de par sa respiration facultative et sa division clonale, elle ne se prête pas facilement à des études sur la stabilité de l’ADNmt. En effet, S. cerevisiae perd très facilement son ADNmt après inactivation d’un grand nombre de gènes impliqués dans pratiquement toutes les voies de la biogenèse mitochondriale. Cette levure ne peut donc pas être utilisée de façon simple pour l’étude de la transmission de l’ADN mitochondrial. C’est pourquoi nous nous sommes alors intéressés à l’autre organisme modèle développé au laboratoire, le nématode C. elegans dont ses caractéristiques en font un excellent modèle complémentaire à la levure. / Mitochondrial respiratory chain diseases of nuclear origin represent one of the major causes of metabolic disorders. These diseases are characterized by a huge clinical and genetic heterogeneity which is a major problem in identifying the disease causing gene. Although several gene mutations have already been found in some patients or families, the disease causing gene of the majority is yet to be determined. The overall structure and gene content of the mitochondrial genome and the proteins required for mtDNA transactions are largely conserved from yeast to human offering the opportunity to use animal models to understand the molecular basis of mitochondrial dysfunctions. To expand the number of human candidate genes of mitochondrial diseases involved in mtDNA maintenance, we have developed in this study, the nematode Caenorhabditis elegans as a model organism to identify new proteins involved in mtDNA maintenance by combining RNAi and ethidium bromide exposure. We have developed a large-scale screening method of genes required for mtDNA maintenance in the worm and initially indentified four new C. elegans genes (atad-3, dnj-10, polrmt, phi-37 and immt-1) involved in mtDNA stability. The human homologs of these genes (ATAD3, DNAJA3, POLRMT and ATP5A1) can be now considered as candidate genes for patients with quantitative mtDNA deficiencies. Using our screening design we have begun to screen all the C. elegans genes encoding mitochondrial proteins. Of the 721 estimated C. elegans mitochondrial genes homologous to human genes, we have tested 185 genes and found that 41 genes are required for the maintenance of the mitochondrial genome in post mitotic cells. These genes fall into three main functional categories of metabolism, protein synthesis and oxidative phosphorylation. Finally, in this study, we investigated the reversibility of mtDNA depletion with drugs to counteract POLG dificiency. Three molecules, Chlorhexidine, Resveratrol and Bezafibrate, have been tested to restore normal mtDNA content and worm life cycle. These experiments hold promise for future work using C. elegans as a pharmacological model for mitochondrial diseases.Altogether, the data generated in this work is a starting point for promising advances in the mitochondrial field, showing the relevance of the nematode as a model organism to study fundamental processes as well as human health research.

Le VDAC (Voltage-Dependent Anion-selective Channel) est un canal ionique de la membrane externe de la mitochondrie. Il est caractérisé par une haute conductance (4nS dans du KCl 1M) à des faibles différences de potentiel et des fermetures vers des niveaux de conductance inférieurs suite à l’application de voltages élevés. La selectivité de l’état de haute conductance est anionique alors que celle du principal état de faible conductance est fortement cationique. La structure secondaire et la fonction est bien conservée chez les animaux, les plantes et les champignons alors que les séquences sont très différentes (moins de 30% d’identités). Au sein des différents groupes, quelques isoformes coexistent.<p>La première partie du travail consiste à étudier l’évolution des isoformes de VDAC, à déterminer le nombre et les propriétés des isoformes. Nous montrons que les végétaux possèdent plus d’isoformes que les mammifères et que celles-ci sont également moins bien conservées. Nous avons défini trois classes d’isoformes sur base de leur charge nette :faiblement, moyennement ou fortement chargées. Les VDAC fortement exprimés et très bien conservés chez les champignons, les plantes et les animaux sont moyennement chargés. A l’opposé, les isoformes portant les plus hautes charges nettes sont très divergentes et peu exprimées. Ces particularités permettent pour la première fois de comparer les isoformes de groupes évolutivement distants.<p>Ensuite, pour relier la structure et la topologie du VDAC à sa fonction, nous avons construit un modèle topologique. Il consiste en feuillet bêta de 18 brins antiparallèles reployés de manière à former un tonneau transmembranaire présentant une courte hélice alpha à son extrémité aminoterminale. Le modèle est compatible avec les séquences de VDAC fongiques, végétaux et animaux. Il rend compte des résultats expérimentaux obtenus par spectroscopie infrarouge et par microscopie électronique de cristaux 2D. Enfin, les résultats d’études topologiques et fonctionnelles publiées dans la littérature supportent également notre modèle.<p>Nos travaux concernant le VDAC32 de Phaseolus coccineus a permis d’améliorer le protocole de purification et d’en obtenir la séquence. La structure et la stabilité du VDAC32 a été étudiée par spectroscopie infrarouge. L’étude de l’orientation du VDAC à l’aide de lumière infrarouge polarisée se base sur des modèles définissant deux angles, alpha et bêta correspondant à l’inclinaison de l’axe du tonneau par rapport à la normale à la membrane et l’inclinaison des brins par rapport à l’axe du tonneau. Nous proposons que l’angle alpha dépend également de l’asymétrie de la protéine. Nos mesures en spectroscopie infrarouge indiquent que la présence du VDAC diminue la température de transition de la membrane et que la structure protéique est sensible à la transition de phase des lipides membranaires. Enfin, nous montrons que la structure du VDAC est modifiée quand le rapport lipides/protéines diminue. L’orientation des brins bêta se rapproche de l’axe et les chaînes latérales des tyrosines deviennent moins ordonnées.<p>Les VDAC sont insérés dans la membrane mitochondriale qui contient environ 5% de stérols. Certains auteurs ont détecté le VDAC dans les membranes plasmiques. Ces dernières sont beaucoup plus riches en stérols. Nous montrons dans ce travail que le VDAC possède la même fonction dans des membranes contenant 0% ou 5% de stérols alors que sa structure est légèrement modifiée. Par contre, en présence de hautes concentrations en stérols, la fonction du VDAC est sensiblement altérée. Ces résultats suggèrent que le VDAC a des propriétés différentes dans la membrane plasmique et dans l’enveloppe de la mitochondrie.<p> / Doctorat en sciences agronomiques et ingénierie biologique / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Contrairement à la vision classique des ARNms eucaryotes qui ne contiendrait qu’une seule séquence codante, de nombreuses évidences expérimentales montrent que ces ARNms contiennent plusieurs séquences codantes qui permettraient l’expression de plusieurs protéines différentes. Les ARNms sont donc multicodants et contiennent des cadres de lectures alternatifs (AltORFs pour alternative open reading frames). Ces ORFs alternatifs sont présents dans les régions non-traduites (UTRs) ou chevauchant le RefORF (cadre de lecture ouvert de référence) dans les cadres de lectures non-canoniques +2 et +3. Le protéome est donc plus complexe que ce que l’on pense. Toutefois, le rôle et la fonction de ces nouvelles protéines restent à être investigués. Au cours de mon projet de recherche à la maîtrise, j’ai commencé la caractérisation de la protéine alternative AltMiD51, codée dans le 5’UTR du gène bicistronique MIEF1/SMCR7L/MID51 et co-exprimée avec sa protéine de référence MiD51. Par des approches variées de biologie moléculaire, cellulaire et biochimique, j’ai d’abord démontré et confirmé la localisation cellulaire de la protéine AltMiD51 à la mitochondrie. Par la suite, j’ai pu démontrer que la présence d’AltMiD51 affecte significativement la morphologie mitochondriale en fragmentant celle-ci. De plus, j’ai pu davantage cibler la région qui contient l’information de sa localisation ainsi que son effet de fragmentation, soit seulement les 23 premiers acides aminés de sa séquence. J’ai également observé que cette région Nterminale (a.a.23) est encore plus efficace pour induire la fragmentation des mitochondries. J’ai pu démontrer que le motif protéique L-Y-R est essentiel pour l’activité de fragmentation. J’ai également validé l’interaction in vivo de AltMID51 avec sa protéine partenaire ACPM (Acyl carrier protein) dans des foci mitochondriaux. En conclusion, mes travaux à la maîtrise ont permis de mettre en évidence que la protéine AltMiD51 est un nouveau facteur impliqué dans la fission mitochondriale. Ces résultats ouvrent de nouvelles perspectives en ce qui concerne la caractérisation de nouvelles protéines alternatives et par leur contribution dans la biologie moléculaire de la cellule. / Abstract : Challenging the dogma that eukaryotic mRNAs contain a single coding sequence, an ever-growing number of studies highlight the possibility for these mRNAs to have several coding sequences, and thereby code for multiple proteins. Thus, eukaryotic mRNAs are multicoding and present alternative open reading frames (AltORFs). These alternative ORFs are present in the non-translated region (UTRs), and within or overlapping the RefORF (reference open reading frame) in non-canonical frames (+2 and +3). The proteome is indeed more complex than we initially thought. However, the role and biological function of these proteins remain to be elucidated. Over the course of my MPhil, I started characterizing the alternative protein AltMiD51, encoded in the 5’UTR of the bicistronic MIEF1/SMCR7L/MID51 gene, and coexpressed with its reference protein (MiD51). Using a wide range of molecular biology, cellular and biochemistry assays, I first demonstrated AltMiD mitochondrial localisation. I then proved AltMiD51 expression alters mitochondrial dynamics, enhancing a fragmented morphology. Moreover, I further characterized the sequence region responsible for AltMiD51 localisation and mitochondrial fragmentation, namely the first 23 amino acids. I also observed that this N-terminal region alone presents a stronger phenotype of mitochondrial fragmentation. In addition, I proved the L-Y-R domain is essential for AltMiD51 fragmentation activity, and I validated AltMiD51 in vivo interaction with ACPM (Acyl Carrier Mitochondrial Protein) within mitochondrial foci. Eventually, the work presented here highlighted AltMiD51 as a novel factor involved in mitochondrial fragmentation. These results shed light on new perspectives regarding the characterisation of alternative proteins and their contribution to the cellular metabolism.

Le remodelage cardiaque est un élément central dans le développement et la progression de l'insuffisance cardiaque, une cause majeure de morbi/mortalité dans le monde. Il est défini par les changements structurels, métaboliques et fonctionnels du ventricule gauche qui se manifestent cliniquement par des modifications de taille et de forme du cœur dans diverses situations pathologiques telles que l'hypertension, l'infarctus du myocarde ou l'obésité. Il s'agit donc d'un procédé complexe et dynamique qui implique une hypertrophie des cardiomyocytes, une production massive de radicaux libres (ROS) et une perte importante de cardiomyocytes par apoptose/nécrose. Cette perte cellulaire induit l'activation des fibroblastes cardiaques et le développement progressif d'une fibrose interstitielle conduisant à l'insuffisance cardiaque. Mon projet de thèse est centré sur l'étude du rôle de la kinase PIKfyve dans le remodelage ventriculaire et l'insuffisance cardiaque. PIKfyve est une lipide kinase conservée au cours de l'évolution qui régule de nombreuses fonctions cellulaires fondamentales. Par des approches in vitro et in vivo sur des modèles murins d'insuffisance cardiaque, mes travaux de thèse identifient PIKfyve et son produit le phosphatidylinositol 5-phosphate comme acteurs clés de l'altération du statut cardiométabolique et de l'intégrité mitochondriale en conditions pathologiques. L'inhibition pharmacologique et épigénétique de l'enzyme préserve l'intégrité mitochondriale, réduit le stress oxydant, l'apoptose cardiomyocytaire, et culmine par l'amélioration des fonctions cardiaques dans un modèle d'insuffisance cardiaque liée à l'obésité. De plus, mes travaux identifient un nouveau mécanisme de régulation de la réponse au stress cellulaires par PIKfyve qui implique une voie de la désacétylase mitochondriale SIRT3.[...] / Cardiac remodeling is a key process in the development and the progression of heart failure, one of the leading causes of morbi/mortality in modern societies. It is defined as a combination of structural, metabolic and functional modifications that clinically manifest as changes in size and shape of the heart, and under the influence of risk factors such as hypertension, myocardial infarction and obesity. Cardiac remodeling is a complex and dynamic process characterized by cardiomyocyte hypertrophy, excessive reactive oxygen species (ROS) generation leading to a massive loss of cardiomyocytes by apoptotic/necrotic cell death. Altogether, these events trigger the differentiation of cardiac fibroblasts into myofibroblasts and the progressive development of interstitial fibrosis leading to cardiac dysfunction. My thesis work focuses on the role of the lipid kinase PIKfyve in cardiac remodeling and heart failure. PIKfyve is the product of an evolutionary conserved single-copy gene and is known to regulate pleiotropic cellular functions. Combining in vitro and in vivo studies in mouse models of cardiac remodeling, my work identifies PIKfyve and its product phosphatidylinositol 5-phosphate as master regulators of the cardiometabolic status and mitochondrial integrity under pathological conditions. Pharmacological or epigenetic inhibition of the enzyme preserves mitochondrial integrity, reduces oxidative stress, myocyte apoptotic death and culminates with improved cardiac function in a mouse model of obesity induced heart failure. These effects are mediated by the mitochondrial deacetylase SIRT3. My work also demonstrates that PIKfyve is a necessary factor in the differentiation of cardiac fibroblasts into myofibroblasts during cardiac remodeling, regulating the TGF-beta/Smad pathway. Altogether, my thesis work unravels a novel role for PIKfyve in myocardial remodeling and paves the way for alternative therapies as a new molecular target for the treatment of cardiometabolic and fibrotic diseases.

The cell cycle is an orchestrated mechanism ensuring cell division and differentiation to form multicellular organisms as well as to promote tissue homeostasis and regeneration. To secure correct cell division end ensure genome integrity for the next cell generation, the cell cycle must be strictly controlled. As part of this control cells have to adequately respond to the intra- and extracellular environment. Among the key molecules mediating the exchange of information from the surrounding environment are reactive oxygen species (ROS). ROS are small oxygen species, which control cellular signaling pathways through reductive-oxidative (redox) reactions with cellular proteins. For instance, mitogen signaling is sustained through ROS production by the NADPH oxidases in order to pass the information to proliferate or not to proliferate onto downstream cascades. Furthermore, cellular processes enabling proliferation and thus cell cycle progression require a level of high energy. Here, the cell cycle machinery meets mitochondria. Mitochondrial metabolism is the basis of aerobic respiration, the mechanism which supplies cells with energy and metabolites important for protein and DNA synthesis. By-products of mitochondrial metabolism as a result of incomplete reduction of oxygen are ROS molecules. Whether produced as metabolic by-product by mitochondria or as a growth factor stimulant by NADPH oxidases, many studies have demonstrated the broad influence of ROS on signaling pathways. When looking at ROS in context of cell division, ROS levels have been proposed to oscillate as cells progress through individual cell cycle phases. Perturbations of the cellular redox environment affect cell cycle progression and depending on the perturbation, may promote proliferation, cell cycle arrest or cell death. Thus, the interplay between redox mechanism and the cell cycle appears to be key to cell cycle decision making. Although the mechanisms of how ROS regulate proliferation-related proteins such as growth factor receptors or protein tyrosine phosphatases are known, the mechanisms of how ROS influence the cell cycle core machinery remain to be fully uncovered. To investigate the interplay between redox signaling and the cell cycle, I took advantage of approaches that allowed me to visualize and study changes in both systems at the same time. I visualized ROS dynamics in physiological and unperturbed conditions in non-transformed cells using redox specific dyes and indeed, observed that the levels of ROS oscillate during the cell cycle. ROS changes are characterized by basal levels in G1 phase and increased levels in S and G2 phases. My data provide evidence that ROS oscillations mainly originate from ROS produced by mitochondria. To investigate cause-consequence relations between ROS and the cell cycle I interfered with the cellular redox environment and studied the effect on cell cycle progression. Firstly, I discovered that the protein levels of NADPH oxidase 4 (NOX4), the enzyme producing ROS in response to mitogens, decrease shortly before cells enter S phase. Because NOX4 is constitutively active and its regulation is not known, this observation suggests that there is a mechanism of cell cycle-dependent NOX4 regulation that is important for entry into S phase. Secondly, I showed that reduction of ROS production by decreasing metabolites important for their production slowed proliferation due to prolonged S phase. This allowed me to establish that the main S phase regulator Cdk2 is a redox regulated cell cycle protein. Precisely, full phosphorylation of threonine 160 (T160) in the activatory segment of Cdk2, which is required for full Cdk2 activity was promoted by ROS derived from mitochondria. Furthermore, using a chemo-selective probe for cysteine oxidation I showed that Cdk2 is directly oxidized by ROS. Mutating the only surface exposed cysteine of Cdk2, C177, resulted in a change of Cdk2 binding to KAP, the phosphatase responsible for removing T160 phosphorylation. I found that only in reductive conditions KAP bound to Cdk2 resulting in Cdk2 dephosphorylation and thus reduced activity. In contrast oxidative conditions abolished the interaction between KAP and Cdk2. Thus, I propose a model of redox-dependent regulation of Cdk2 whereby the increase of mitochondrial ROS during S phase negatively regulates the Cdk2-KAP interaction to enable full activation of Cdk2 necessary for cells to rapidly progress through S phase. Altogether, in my thesis I investigated the link between mitochondrial ROS production and the cell cycle machinery and identified a mechanism of how increased levels of ROS drive the cell cycle. Furthermore, I outlined a potential cell cycle-dependent regulation of the NOX4 protein, which might provide a step towards understanding of its regulation. Thus, my thesis provides new views on the interplay between the redox system and the cell cycle machinery.:1. Introduction 1.1 Reactive oxygen species (ROS) 1.1.1 ROS and signal transduction 1.1.2 Antioxidant systems 1.1.3. Redox homeostasis, oxidative and reductive stress 1.2 ROS producing mechanisms 1.2.1 Mitochondria 1.2.2 NADPH oxidases 1.3 The cell cycle 1.4. ROS and the cell cycle 1.5 Aims of the thesis 2. Results 2.1 CellRox, a ROS sensitive dye, reveals redox changes during the cell cycle progression 2.2 Investigating the role of NADPH oxidases in cell cycle progression 2.2.1 General NOX inhibition causes defect in proliferation and suggests G1 phase delay 2.2.2 NOX4 and NOX1 specific inhibition causes a G1 delay or arrest 2.2.3 Specific down-regulation of NOX4 might have a negative impact on cell proliferation 2.2.4 NOX4 over-expression affects proliferation 2.2.5 NOX4 expression drops at G1 and S phase transition 2.3 Cell cycle dependent ROS oscillations correlate with mitochondria ROS production 2.4 Interference with mtROS decreases proliferation on the level of S phase 2.4.1 MitoTempo negatively affects proliferation and decreases population of EdU positive cells 2.4.2 Genetic interfering with mtROS production results in affected Cdk2 activation 2.5 Redox dependent Cdk2 activation via KAP binding 2.5.1 BTD labeling reveals Cdk2 as a direct target for oxidation 2.5.2 Preventing Cdk2 oxidation of cysteine 177 results in a drop of T160 phosphorylation 2.5.3 KAP binds to Cdk2 in a redox dependent manner 3. Discussion 3.1 ROS levels oscillate during the cell cycle in physiological cell culture conditions 3.2 Expression levels of NOX4 might determine the entry into S phase 3.3 Mitochondria are the main source of redox oscillations during the cell cycle 3.4 mtROS production contributes to Cdk2 activation and thus drives S phase progression 3.5 KAP phosphatase contributes to redox dependent regulation of Cdk2 3.6. Model of interconnection between the cellular redox environment and cell cycle regulation 4. Materials and methods 4.1 Cell culture 4.1.1 Cell lines 4.1.2 Cell treatments 4.1.3 Plasmids and cell line generation 4.1.4 RNA interference (RNAi) 4.1.5 EdU incorporation assay 4.2 Quantitative PCR (qPCR) 4.3 Protein studies 4.3.1 Cdk2-KAP/CAK interaction 4.3.2 Cdk2 sulfenylation by BTD labeling 4.4 SDS-PAGE and Western blot analyses 4.4.1 Total lysate preparation 4.4.2 SDS-PAGE 4.4.3 Western blotting 4.5 Flow cytometry analysis (FACS) 4.6 Hypoxia experiments 4.7 Microscopy 4.8 Automated image and data analysis 4.9 Statistical methods 5. Contributions 6. Bibliography 7. Acknowledgements 8. Appendix / Der Zellzyklus ist ein komplexer Mechanismus, der Zellteilung und Differenzierung in mehrzelligen Organismen, sowie die Homöostase und die Regeneration von Geweben gewährleistet. Um eine korrekte Zellteilung zu ermöglichen und die Integrität des Genoms für die nächste Zellgeneration sicherzustellen, muss der Zellzyklus streng kontrolliert werden. Im Rahmen dieser Kontrolle müssen die Zellen angemessen auf die intra- und extrazellulären Umgebungen reagieren. Zu den Schlüsselmolekülen, die den Austausch von Informationen aus der Umgebung vermitteln, gehören reaktive Sauerstoffspezies (ROS). ROS enthalten Sauerstoff und kontrollieren durch reduktiv-oxidative (Redox-) Reaktionen mit zellulären Proteinen viele verschiedene zelluläre Signalwege. So wird beispielsweise die Proliferation aufgrund von Wachstumssignalen durch die Produktion von ROS durch NADPH-Oxidasen ermöglicht, da sie die Information, ob eine Zellteilung stattfinden soll oder nicht, an nachgeschaltete Kaskaden weiterleiten. Darüber hinaus benötigen zelluläre Prozesse, die den Fortgang des Zellzyklus ermöglichen, ein hohes Energieniveau. Hier trifft die Zellzyklusmaschinerie auf die Mitochondrien. Der mitochondriale Stoffwechsel ist die Grundlage der aeroben Atmung, des Mechanismus, der die Zellen mit Energie und Metaboliten versorgt, die für die Protein- und DNA-Synthese notwendig sind. Als Nebenprodukte des mitochondrialen Stoffwechsels entstehen dabei häufig ROS, die aus der unvollständigen Reduktion von Sauerstoff resultieren. Unabhängig davon, ob sie als Nebenprodukte des Stoffwechsels in den Mitochondrien oder als wachstumsfördernde Substanzen in den NADPH-Oxidasen entstehen, viele Studien haben den weitreichenden Einfluss von ROS auf zahlreiche Signalwege gezeigt. Betrachtet man ROS im Zusammenhang mit der Zellteilung, so wird angenommen, dass die ROS-Konzentration mit dem Durchlaufen der einzelnen Zellzyklusphasen schwankt. Störungen der zellulären Redoxumgebung wirken sich auf den Verlauf des Zellzyklus aus und können je nach Störung Proliferation, Stillstand des Zellzykluses oder Zelltod fördern. Das Zusammenspiel zwischen Redox-Mechanismen und dem Zellzyklus scheint also der Schlüssel zur Entscheidungsfindung im Zellzyklus zu sein. Obwohl die Mechanismen, mit denen ROS essentielle Proteine wie Wachstumsrezeptoren oder Protein-Tyrosin-Phosphatasen regulieren, bekannt sind, sind die Mechanismen, mit denen ROS die Kernmaschinerie des Zellzyklus beeinflussen, noch nicht vollständig aufgeklärt. In der hier vorliegenden Arbeit nutzte ich daher Ansätze, die es mir ermöglichten, Veränderungen im Zellzklus, als auch Veränderungen in Redox-Signalen und deren Zusammenspiel gleichzeitig zu untersuchen. Ich habe die Dynamik reaktiver Sauerstoffspezies unter physiologischen und ungestörten Bedingungen in nichttransformierten Zellen mit redox-spezifischen Farbstoffen visualisiert und beobachtet, dass die ROS-Konzentrationen während des Zellzyklus oszillieren. Die Veränderungen der ROSKonzentrationen sind durch einen Grundwert in der G1-Phase und erhöhte Werte in der Sund G2-Phase gekennzeichnet. Meine Daten belegen, dass ROS-Oszillationen hauptsächlich von ROS herrühren, die von den Mitochondrien produziert werden. Um die Ursache-Folge-Beziehungen zwischen ROS und dem Zellzyklus zu untersuchen, habe ich in die zelluläre Redox-Balance eingegriffen und die Auswirkungen auf den Verlauf des Zellzyklus untersucht. Zunächst entdeckte ich, dass die Proteinkonzentration der NADPHOxidase 4 (NOX4), des Enzyms, das ROS als Reaktion auf Wachstumsfaktoren produziert, kurz vor dem Eintritt der Zellen in die S-Phase abnimmt. Da NOX4 konstitutiv aktiv ist und seine Regulierung nicht bekannt ist, deutet diese Beobachtung darauf hin, dass es einen zellzyklusabhängigen Mechanismus der NOX4-Regulierung gibt, der für den Eintritt in die S-Phase wichtig ist. Zweitens konnte ich zeigen, dass die Verringerung von Metaboliten zu einer Verringerung der ROS-Produktion führt, welches die Proliferation aufgrund einer verlängerten S-Phase verlangsamt. Dadurch konnte ich feststellen, dass Cdk2, der wichtigste S-Phasen-Regulator, ein redoxreguliertes Zellzyklusprotein ist. Genauer gesagt wurde die vollständige Phosphorylierung von Cdk2 am Threonin 160 (T160), welche für die volle Cdk2-Aktivität erforderlich ist, durch ROS aus Mitochondrien gefördert. Außerdem konnte ich mit einer chemo-selektiven Probe für Cysteinoxidation zeigen, dass Cdk2 direkt durch ROS oxidiert wird. Die Mutation des einzigen exponierten Cysteins von Cdk2, C177, führte zu einer Veränderung der Bindung von Cdk2 an KAP, die Phosphatase, die für die Aufhebung der T160-Phosphorylierung verantwortlich ist. Ich fand heraus, dass KAP nur unter reduktiven Bedingungen an Cdk2 bindet, was zu einer Dephosphorylierung von Cdk2 und damit zu einer verringerten Aktivität führt. Unter oxidativen Bedingungen hingegen wurde die Interaktion zwischen KAP und Cdk2 aufgehoben. Daher schlage ich ein Modell der redoxabhängigen Regulierung von Cdk2 vor, bei dem der Anstieg der mitochondrialen ROS während der S-Phase die Interaktion zwischen Cdk2 und KAP negativ reguliert, um eine vollständige Aktivierung von Cdk2 und damit eine erfolgreiche S-Phase zu ermöglichen. Insgesamt habe ich in meiner Dissertation die Verbindung zwischen mitochondrialer ROS-Produktion und der Zellzyklusmaschinerie untersucht und einen Mechanismus identifiziert, wie erhöhte ROS-Konzentrationen den Zellzyklus antreiben. Darüber hinaus habe ich die zellzyklusabhängige Regulierung des NOX4-Proteins aufgezeigt, was neue Einblicke zum Verständnis der Zellzykluskontrolle durch ROS gewährt. Somit bietet meine Arbeit neue, interessante Erkenntnisse für das Zusammenspiel zwischen dem Redoxsystem und der Zellzyklusmaschinerie.:1. Introduction 1.1 Reactive oxygen species (ROS) 1.1.1 ROS and signal transduction 1.1.2 Antioxidant systems 1.1.3. Redox homeostasis, oxidative and reductive stress 1.2 ROS producing mechanisms 1.2.1 Mitochondria 1.2.2 NADPH oxidases 1.3 The cell cycle 1.4. ROS and the cell cycle 1.5 Aims of the thesis 2. Results 2.1 CellRox, a ROS sensitive dye, reveals redox changes during the cell cycle progression 2.2 Investigating the role of NADPH oxidases in cell cycle progression 2.2.1 General NOX inhibition causes defect in proliferation and suggests G1 phase delay 2.2.2 NOX4 and NOX1 specific inhibition causes a G1 delay or arrest 2.2.3 Specific down-regulation of NOX4 might have a negative impact on cell proliferation 2.2.4 NOX4 over-expression affects proliferation 2.2.5 NOX4 expression drops at G1 and S phase transition 2.3 Cell cycle dependent ROS oscillations correlate with mitochondria ROS production 2.4 Interference with mtROS decreases proliferation on the level of S phase 2.4.1 MitoTempo negatively affects proliferation and decreases population of EdU positive cells 2.4.2 Genetic interfering with mtROS production results in affected Cdk2 activation 2.5 Redox dependent Cdk2 activation via KAP binding 2.5.1 BTD labeling reveals Cdk2 as a direct target for oxidation 2.5.2 Preventing Cdk2 oxidation of cysteine 177 results in a drop of T160 phosphorylation 2.5.3 KAP binds to Cdk2 in a redox dependent manner 3. Discussion 3.1 ROS levels oscillate during the cell cycle in physiological cell culture conditions 3.2 Expression levels of NOX4 might determine the entry into S phase 3.3 Mitochondria are the main source of redox oscillations during the cell cycle 3.4 mtROS production contributes to Cdk2 activation and thus drives S phase progression 3.5 KAP phosphatase contributes to redox dependent regulation of Cdk2 3.6. Model of interconnection between the cellular redox environment and cell cycle regulation 4. Materials and methods 4.1 Cell culture 4.1.1 Cell lines 4.1.2 Cell treatments 4.1.3 Plasmids and cell line generation 4.1.4 RNA interference (RNAi) 4.1.5 EdU incorporation assay 4.2 Quantitative PCR (qPCR) 4.3 Protein studies 4.3.1 Cdk2-KAP/CAK interaction 4.3.2 Cdk2 sulfenylation by BTD labeling 4.4 SDS-PAGE and Western blot analyses 4.4.1 Total lysate preparation 4.4.2 SDS-PAGE 4.4.3 Western blotting 4.5 Flow cytometry analysis (FACS) 4.6 Hypoxia experiments 4.7 Microscopy 4.8 Automated image and data analysis 4.9 Statistical methods 5. Contributions 6. Bibliography 7. Acknowledgements 8. Appendix