La souris est un modèle animal souvent utilisé lors d’études du métabolisme et de la toxicité de molécules, c’est pourquoi nous avons voulu identifier les principaux tissus et enzymes impliquées au niveau de la glucuronidation chez cet animal. Le foie et le rein des souris mâles, ainsi que le foie des souris femelles ont démontré une forte activité de conjugaison des androgènes, tout comme le foie, la vésicule biliaire et les tissus du système digestif pour le BPA. Les Ugt2b1 et 2b5 sont les principales enzymes responsables de la conjugaison des androgènes, tandis que ce sont les Ugt2b1 et Ugt2b34 pour le BPA. La représentativité des mécanismes chez la souris par rapport à l’homme comme modèle dans le contexte de la glucuronidation des androgènes et du BPA sera discuté à la lumière de ces expériences tout au long de ce mémoire. / Mice are frequently used as a model in studies of metabolism and molecules toxicities. Therefore, we wanted to identify the tissues and enzymes involved in the glucuronidation process in this animal. The liver and kidney in the case of males and liver only in females were the tissues with the highest conjugation activity for androgens and the liver, gallblader and intestinal tissues for BPA. Ugt2b1 and 2b5 were the principal enzymes responsible for the conjugation of androgens, whereas Ugt2b1 and 2b34 were involved in the conjugation of BPA. The transposition of glucuronidation mecanisms from mice to human will be discussed in the light of these results throughout the text.

L'alvéolite allergique extrinsèque (AAE) est une maladie pulmonaire inflammatoire causée par l'inhalation répétée d'antigènes environnementaux. L'AAE se caractérise par une réponse immune exacerbée et une infiltration de lymphocytes dans les poumons. Seulement un faible pourcentage des individus exposés va développer la forme active de la maladie. Le rôle des cellules dendritiques (CD) dans le développement de cette maladie et dans la tolérance aux antigènes responsables est mal connu. Le but de cette étude était de vérifier si les fonctions des CD étaient altérées chez les sujets asymptomatiques. Pour ce faire, des souris ont été traitées pendant 12 semaines avec un agent responsable de l'AAE, Saccharopolyspora rectivirgula (SR), et les CD ont été isolées et caractérisées. Cette étude a permis de déterminer que les CD de souris exposées au SR étaient faiblement matures, n'induisaient pas la prolifération des lymphocytes T, exprimaient activement l'indoléamine 2,3-dioxygénase (IDO) et exprimaient moins de Toll-like receptors (TLRs), des caractéristiques reliées à l'induction de la tolérance. Les CD pourraient donc avoir un rôle important dans le phénomène de tolérance observé chez les sujets exposés asymptomatiques.

Nous avons mené une étude à deux volets sur la préparation du tronc cérébral isolé du poisson rouge (Carassius auratus; Linnaeus). Le premier volet porte sur la chémosensibilité centrale du poisson rouge. Nos résultats nous révèlent qu’une diminution de la PO2 dans le superfusat engendre une augmentation de la fréquence des décharges respiratoires tandis qu’une diminution du pH du superfusat, suite à l’augmentation de sa PCO2, n’influence pas le rythme respiratoire. Le deuxième volet porte sur l’importance relative de l’inhibition réciproque chlore-dépendante dans la rythmogenèse respiratoire. Ici, nos résultats nous indique que la perturbation de ce mécanisme via 1) la superfusion du tronc cérébral isolé avec un superfusat sans ion chlorure aboli le rythme respiratoire, 2) l’activation des récepteurs GABAergiques avec du GABA exogène diminue la fréquence des décharges respiratoires et 3) l’inactivation simultanée des récepteurs GABAergiques et glycinergiques à l’aide d’antagonistes augmente la fréquence et l’amplitude des décharges respiratoires. / We conducted a two-part in vitro study on the isolated brainstem preparation of the goldfish (Carassius auratus; Linnaeus). In the first part, we investigated the central chemosensibility of the goldfish. Our results indicate that decreasing the PO2 of the superfusate increases the frequency of the fictive respiratory bursts. However, decreasing the pH of the superfusate by increasing its PCO2 had no effect on the respiratory rhythm. In the second part, we investigated the relative importance of GABA- or glycine-mediated Cl--dependent reciprocal inhibition for respiratory rhythmogenesis by disrupting this mechanism with three different treatments. Here, our results indicate that 1) bathing the brainstem in a Cl--free superfusate abolishes the respiratory rhythm, 2) activating GABA receptors with exogenous GABA decreases the frequency of the fictive respiratory bursts and 3) simultaneously inactivating GABA receptors and glycine receptors with antagonists increases both the frequency and the amplitude of the fictive respiratory bursts.

Les séléno-glutathion peroxydases (SeGPx) sont des antioxydants qui présentent un dimorphisme sexuel dans différents tissus de rongeurs et d'humains adultes. Il a été démontré que les hormones sexuelles telles que la testosterone et 1'estradiol modulent l'expression des SeGPx. Les souriceaux peuvent être utilisés comme modèle de prématurité pulmonaire humaine car ils naissent avec des poumons immatures et des niveaux hormonaux relatifs similaires à l'humain. Nous avons découvert chez les souriceaux un dimorphisme sexuel unique favorisant les femelles jusqu'à 5 jours après la naissance dans l'expression d'une SeGPx, la GPx-1. Cette différence sexuelle, si elle s'extrapole chez l'humain, pourrait notamment expliquer la plus grande susceptibilité des garçons à la dysplasie bronchopulmonaire et autres complications respiratoires.

L'ataxie de Friedreich (FRDA est la plus fréquente ataxie neurodégénérative invalidante. Elle est une maladie héréditaire récessive progressive qui touche sévèrement le système nerveux et cardiaque. La FRDA pose non seulement un défis de thérapie curative mais aussi celui du modèle animal reproduisant la symptomatologie. Dépendant du nombre de répétitions GAA, les souris modèles, telles que les souris YG8sR contenant entre 250-300 GAA, présentent un phénotype plus ou moins sévère. Notre étude a pour but d'accentuer le phénotype des souris YG8sR en utilisant des short hairpin ARNs (shARNs) ciblant l'ARNm de la frataxine pour réduire l'expression de cette protéine. Nous avons pu, après un test d'efficacité des shARNs in vitro dans les cellules HeLa et HEK 293T, choisir 2 shARNs parmi les 4 testés capables de réduire le taux de frataxine. Nous avons sélectionné les shARN6 et shARN1 qui étaient capables après la transfection dans les cellules à 2 µg d'ADN de réduire respectivement de 40% et 70% le taux de frataxine dans les cellules. Lorsque nous avons injecté en intraveineuse 1.2X10¹² ou 2.4X10¹² copies d'AAV-PHP.B codant pour ces shARNs, nous avons observé une perte de poids, des troubles de la motricité et de la coordination, ainsi qu'une diminution de la force motrice chez les souris YG8sR ayant reçu du shARN1 à 1.2X10¹². Nous avons donc développé un modèle amélioré de souris (Imp-YG8sR) en réduisant davantage l'expression de la frataxine avec cette dose de shARN1. Le phénotype plus sévère de ces souris est plus proche de celui des patients atteints de l'ataxie de Friedreich que le modèle original YG8sR utilisé sans les shARNs. Notre modèle de souris Imp-YG8sR sera donc bénéfique pour des tests de thérapies géniques actuellement en développement. / Friedreich's ataxia (FRDA) is the most common disabling neurodegenerative ataxia. It is a progressive recessive inherited disease that severely affects the nervous and cardiac systems. FRDA poses not only a challenge of curative therapy but also that of the animal model reproducing the symptomatology. Depending on the number of GAA repeats, mouse models, such as YG8sR containing between 250-300 GAA, exhibit a more or less severe phenotype. Our study aims to enhance the phenotype of YG8sR mice by using short hairpin RNAs (shRNAs) targeting the frataxin mRNA to reduce the expression of this protein. We were able, after an in vitro efficacy test of the shRNAs in HeLa and HEK 293T cells, to choose 2 shRNAs among the 4 tested, to reduce the frataxin level. We selected shARN6 and shARN1 which were able to reduce the frataxin level by up to 40% and 70%, respectively in cells, when injected intravenously at 1.2X10¹² or 2.4X10¹² copies of AAV-PHP.B encoding these shRNAs. We observed a loss of weight, a disturbance of the motor skills, a reduced coordination and force in the YG8sR mice, which received the shRNA1 at 1.2X10¹². We have therefore developed an improved mouse model (Imp-YG8sR) by further reducing the expression of frataxin with this dose of shRNA1. The more severe phenotype of the Imp-YG8sR is closer to that of patients with Friedreich's ataxia than the original model used without the shRNAs. Our Imp-YG8sR mouse model will therefore be beneficial for gene therapies currently in development.

La poly(ADP-ribose) polymérase (PARP) est une enzyme nucléaire capable de catalyser la formation de polymères d'ADP-ribose sur plusieurs protéines acceptrices en utilisant le NAD comme substrat. Cette modification post-traductionnelle est notamment impliquée dans la régulation de la réparation, de la transcription et de la réplication de l'ADN. L'enzyme responsable de l'hydrolyse du polymère d'ADP-ribose se nomme la poly(ADPribose) glycohydrolase (PARG) et son action est essentielle afin de permettre aux protéines modifiées de regagner leurs fonctions. Toutefois, la régulation de la dégradation du polymère et les rôles précis de la PARG ne sont pas très bien connus. Ce projet de recherche décrit pour la première fois une caractérisation détaillée des deux gènes qui codent pour des PARG chez C. elegans, soient pme-3 et pme-4. Via un essai PARG, nous avons d'abord prouvé que le ver était capable d'hydrolyser le polymère et que les enzymes responsables de cette dégradation étaient PME-3 et PME-4. Une expérience de RT-PCR a démontré que ces gènes sont exprimés dans tous les stades de développement du ver, un résultat qui fut confirmé par l'utilisation de plasmides recombinants de fusion GFP. De plus, ces plasmides recombinants ont également été utilisés pour montrer que PME-3 semble être exprimée principalement dans les cellules neuronales ainsi que dans l'intestin et qu'elle se retrouve en grande majorité au noyau. PME-4 est également exprimée dans les cellules neuronales mais sa localisation sous-cellulaire semble exclusivement cytoplasmique. L'inactivation de pme-3 et pme-4 via l'interférence à l'ARN indique que ces enzymes sont importantes dans la réponse aux dommages à l'ADN. En effet, les vers dont l'expression de ces gènes est réduite montrent un taux de survie significativement plus faible que les vers contrôles suite à une induction de dommages à l'ADN. Via des expériences de double hybride de levure, nous avons effectué un criblage afin de trouver des partenaires protéiques de PME-3 et PME-4. Nous avons identifié un partenaire à PME3, soit la protéine de fonction inconnue MATH-41, mais aucun partenaire pour PME-4. Le patron d'expression de MATH-41 semble indiquer que cette protéine est principalement exprimée dans l'intestin du ver. Ces résultats montrent que les PARG semblent avoir un rôle dans la réponse aux dommages à l'ADN et dans la survie. De plus, ils constituent d'importants avancements dans l'étude des rôles que pourraient jouer les PARG dans plusieurs événements métaboliques.

La maladie de Parkinson (MP) est le trouble neurodégénératif de la fonction motrice le plus fréquent qui est susceptible d'augmenter en raison du vieillissement de la population. Il n'existe pas de remède pour cette maladie et aucun médicament modifiant la progression de la maladie n’est disponible. Une incidence plus élevée de la MP est observée chez les hommes suggérant un possible effet neuroprotecteur des stéroïdes sexuels féminins. Dans des modèles animaux de la MP, des effets protecteurs bénéfiques des estrogènes et de la progestérone, ont été rapportés tandis que les stéroïdes gonadiques androgènes ont montré peu ou pas d’activité neuroprotectrice. Nous avons donc exploré l'activité neuroprotectrice des médicaments agissant sur la synthèse des stéroïdes. Le dutasteride et le finasteride sont des inhibiteurs de l'enzyme 5α-réductase utilisés chez l'homme pour traiter divers troubles endocriniens. Dans le modèle murin de la MP lésé au 1-méthyl-4-phényl-1,2,3,6-tétrahydropyridine (MPTP), nous avons démontré que le dutasteride, mais pas le finasteride, présente une activité de neuroprotection de marqueurs associés à la neurotransmission de la dopamine (DA) du cerveau. Les mécanismes d'action des effets neuroprotecteurs de dutasteride ont été étudiés chez les souris intactes et lésées au MPTP. L'analyse du comportement moteur de ces souris a montré que les traitements avec le MPTP et MPTP + dutasteride n'ont pas affecté la fonction motrice comme prévu à l'aide d'une faible dose de MPTP induisant une lésion modérée modélisant les stades précoces de la maladie. Nos résultats suggèrent que le dutasteride présente des effets neuroprotecteurs sur les neurones dopaminergiques et des propriétés anti-inflammatoires au niveau du cerveau. Ces résultats proposent le dutasteride comme médicament thérapeutique prometteur pour la neuroprotection dans un contexte de MP durant les premiers stades de la maladie. Nous avons précédemment rapporté une neuroprotection par la progestérone de la DA striatale chez des souris MPTP lorsqu'elle est administrée avant la toxine ou 1 heure après. Les résultats présentés ici suggèrent que la progestérone peut favoriser la récupération des neurones dopaminergiques lorsqu'elle est administrée à un stade précoce (24h) mais pas à un stade tardif (5 jours) après la lésion chez les souris mâles via notamment l’atténuation de la neuroinflammation et l’induction du BDNF. Ces données mettent en évidence la nécessité de développer des thérapies modifiant la maladie mais aussi de fournir des traitements personnalisés selon le sexe. Ainsi, les options de traitement spécifiques à chaque sexe peuvent être imaginées telles que l'utilisation du dutasteride chez les hommes et des thérapies à base de médicaments comme la progestérone pour les deux sexes. Cependant, des études supplémentaires sont nécessaires pour optimiser ces thérapies afin d’obtenir des traitements sûrs personnalisés selon le sexe et qui permettrait de retarder, prévenir ou traiter la maladie. / Parkinson’s disease (PD) is the most common neurodegenerative movement disorder and is likely to increase due to the aging population. There is no cure for PD and no disease-modifying drug available. A higher incidence of this disease is observed in men suggesting a possible neuroprotective effect of female sex steroids. In animal models of PD, beneficial protective effects of estrogen and progesterone have been reported while the androgenic gonadal steroids showed little or no neuroprotective activity. We explored the neuroprotective activity of drugs acting on the synthesis of steroids. Dutasteride and finasteride are inhibitors of 5α-reductase enzyme used in humans to treat various endocrine disorders. In the mouse model of PD injured with 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP), we found that dutasteride but not finasteride exhibits neuroprotective activity on dopamine (DA) neurotransmission of the brain. The mechanisms implicated in the neuroprotective effects of dutasteride have been further studied in intact and MPTP-lesioned mice. The analysis of motor behavior of these mice showed that treatment with MPTP, MPTP + dutasteride did not affect the motor behavior as expected with a low dose of MPTP to induce moderate injury modeling early stages of the disease. Our results suggest that dutasteride has neuroprotective effects on dopaminergic neurons and anti-inflammatory properties in the brain. These results suggest dutasteride as promising therapeutic drug for PD neuroprotection in the early stages of the disease. We have previously reported neuroprotection by progesterone on striatal DA in MPTP mice when administered before or 1 hour after the toxin. The results presented here suggest that progesterone can promote recovery of dopaminergic neurons when administered at an early stage (24h) but not at a late stage (5 days) after injury in male mice including through mitigation of neuroinflammation. These data highlight the need to develop disease-modifying therapies but also to provide personalized treatments by gender. Thus, the specific treatment options for each sex can be imagined such as the use of dutasteride in men and progesterone-based therapies for both sexes. However, additional studies are needed to optimize these therapies to get safer personalized treatments that would delay, prevent or treat PD.

La tyrosinémie héréditaire de type 1 (TH1) est un désordre autosomique récessif causé par la déficience en fumarylacétoacétate hydrolase (FAH), la dernière enzyme du sentier catabolique de la tyrosine. Cette maladie métabolique sévère est caractérisée principalement par des dysfonctions hépatiques et rénales, dues à l’accumulation de métabolites toxiques. Par ailleurs, les dommages créés au niveau du foie peuvent mener jusqu’au développement d’un carcinome hépatocellulaire (CHC). Le seul traitement disponible est un apport quotidien en NTBC combiné avec une diète restrictive faible en tyrosine et phénylalanine. Alors que ce traitement augmente l’espérance de vie des patients, le risque de développer un CHC demeure. Les objectifs généraux du travail sont de définir les variations physiopathologiques du phénotype de la TH1 ainsi que les mécanismes moléculaires impliqués dans la transformation cellulaire et la progression de la dysfonction hépatique dans un modèle murin. Des souris fah-/- ont été soumises à une interruption du NTBC afin d’étudier l’implication des voies de signalisation à différentes étapes de la maladie. Le retrait du NTBC induit une dégénérescence des conditions physiologiques générales. L’analyse histologique a dévoilé une distorsion de la morphologie du foie avec des lésions hépatocellulaires accompagnées d’inflammation et de nodules stéatosiques. Les résultats d’immunobuvardage ont démontré une modulation progressive et chronique des voies de signalisation en réponse au stress et liées à la survie et la prolifération cellulaire. À ce stade, aucun cancer n’a été diagnostiqué, mais une importante activation des voies de signalisation du réticulum endoplasmique a été démontrée durant la progression de la TH1. Cette modulation peut jouer un rôle central lors de la dégénération des cellules hépatiques en créant un microenvironnement propice à l’éventuelle croissance et invasion du CHC. / Hereditary tyrosinemia type 1 (HT1) is an autosomal recessive disorder caused by deficiency of fumarylacetoacetate hydrolase (FAH), the last enzyme of the tyrosine catabolic pathway. This severe metabolic disease is mainly caracterized by liver and kidney dysfuntion, due to the accumulation of toxic metabolites. Moreover, injuries inflicted on the liver could lead to the development of hepatocellular carcinoma (HCC). Actually, the only treatment is a daily intake of NTBC combined with a restrictive diet low in tyrosine and phenylalanine. While this treatment increases the life expectancy of patients, the risk of developing HCC remains. The general objectives of this work are to determine the pathophysiological changes of the HT1 phenotype and the molecular mechanisms involved in cell transformation and progression of liver dysfunction in a mouse model. fah-/- mice were subjected to NTBC withdrawal to investigate the signaling pathways involved in various stages of the disease. The interruption of NTBC induced a degeneration of general physiological conditions. Histological analysis revealed a distortion of the liver’s morphology with hepatocellular lesions, inflammation and steatotic nodules. Western blotting results have shown a chronic and progressive modulation of signaling pathways related to cell survival and proliferation in response to stress. At this point, no cancer has been diagnosed, but a significant activation of the endoplasmic reticulum signaling pathways has been demonstrated during the progression of TH1. This modulation may play a central role in the degeneration of liver cells by creating a microenvironment suitable for future HCC growth and invasion.

Lors d'études antérieures, l'analyse du transcriptome des cellules micro gliales à l'aide de micropuces à ADN nous a permis d'identifier le récepteur transmembranaire GPR84. Dans la présente étude, nous avons testé l 'hypothèse que la transcription du GPR84 est augmentée dans la microglie durant l'inflammation. Plus précisément, nous avons étudié la régulation du GPR84 dans le cerveau durant une endotoxinémie et une encéphalomyélite autoimmune expérimentale (EAB) . Nos résultats ont montré une augmentation de l'expression du GPR84 au cours de ces deux conditions inflammatoires, et ce uniquement dans la microglie. Nous avons ensuite tenté d'identifier le rôle du GPR84 en testant l 'hypothèse selon laquelle ce récepteur modulerait le développement des symptômes dûs à l'inflammation. À l'aide de souris déficientes en GPR84, nous avons évalué l'influence de ce récepteur durant une EAB, une endotoxinémie et une encéphalite induite par le virus de l 'herpès simplex de type 1. Nous n'avons observé aucune influence du GPR84 dans ces modèles. Nous concluons que le GPR84 est exprimé non spécifiquement dans plusieurs conditions neuroinflammatoires, mais qu'il n'y exerce pas toujours un effet significatif et que son rôle reste inconnu.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2013-2014. / Dans la recherche de traitement efficace contre les maladies neurodégénératives, des stratégies d’immunisation active et passive, visant la clairance des agrégats protéiques ont été proposées. Les immunoglobulines pour injection intraveineuse (IgIV) sont des préparations pharmaceutiques d’immunoglobulines G isolées du plasma de milliers de donneurs sains. Puisque des auto-anticorps naturels contre des protéines pathologiques ont été identifiés dans ces préparations, elles ont été proposées comme alternatives aux immunothérapies et font l’objet d’études cliniques dans le traitement de la maladie d’Alzeimer (MA). Le but de mon projet de doctorat était d’évaluer l’efficacité et d’analyser les mécanismes d’action des IgIV dans des modèles animaux de la MA et de la maladie de Parkinson (MP), afin d’identifier des cibles potentielles pour le développement d’alternatives pharmacologiques dans le traitement de ces maladies. La biodisponibilité des IgIV et leur capacité à atteindre des cibles thérapeutiques au cerveau sont inconnues. Dans la première partie du projet, nous avons quantifié le passage des IgIV par la barrière hémato-encéphalique (BHE). Nos résultats fournissent des évidences quantitatives du passage à la BHE et de la biodisponibilité cérébrale des IgIV en absence de la perméabilisation de la barrière hématoencéphalique et en quantité suffisante pour interagir avec des cibles thérapeutiques. Dans un modèle tritransgénique de la MA (3xTg-AD) qui reproduit à la fois les pathologies amyloïde et tau, des injections d’IgIV semblent améliorer les performances cognitives dans le test de reconnaissance d’objet et réduire les comportements anxieux. Malgré des effets limités sur la pathologie tau, les IgIV modulent la réponse immunitaire centrale (IL-5/IL-10) et périphérique (CX3CR1+ et lymphocytes T), et réduisent le ratio Aβ42/Aβ40 soluble de 22% et la concentration d’oligomères de 56 KDa d’Aβ de plus de 60%. Ces effets des IgIV sur la cognition, l’immunité et la pathologie Aβ supportent les oligomères Aβ, les lymphocytes T effecteurs et le sentier des fractalkines comme cibles pharmacologiques potentielles. Finalement, des injections d’IgIV dans un modèle murin d’intoxication au MPTP ne parviennent pas à démontrer d’effets neurorestaurateurs des IgIV sur la voie nigrostriée et suggèrent même des effets néfastes des IgIV sur le système dopaminergique dans ce modèle de la MP. Ces données précliniques soulignent l’importance de procéder prudemment dans l’initiation d’études cliniques avec les IgIV dans la MP. / In the search of therapeutic solutions to neurodegenerative diseases, active and passive immunization strategies have been proposed for the clearance of protein aggregates. Intravenous immunoglobulin (IVIg) is a pharmaceutical preparation of over 98% immunoglobulin G prepared from the plasma of thousands of healthy donors. Since natural autoantibodies against pathological proteins have been identified in IVIg, it has been proposed as an alternative to immunotherapy and clinical trials in Alzheimer’s disease (AD) patients are underway. The aim of my PhD project was to evaluate the efficacy, analyze the mechanisms of action of IVIg in animal models of AD and Parkinson’s disease (PD), and identify potential targets for the development of pharmacological alternatives. The bioavailability of IVIg and its ability to reach therapeutic targets in the brain are unknown. In the first part of the project, we quantified the passage of IVIg through the blood-brain barrier (BBB). Our results provide quantitative evidence of BBB transport and brain bioavailability of IVIg in the absence of permeabilization and in sufficient amount to interact with therapeutic targets. In a triple transgenic mouse model of AD (3xTg-AD) that reproduces amyloid and tau pathologies, IVIg injections have improved the cognitive performance and reduced anxiety-like behaviors of treated mice. Despite limited effects on tau pathology, IVIg modulated the central (IL-5/IL-10 ratio) and peripheral (CX3CR1 + and T cells), and reduced the ratio of soluble Aβ42/Aβ40 (-22%) and the concentration of 56 kDa oligomers of Aß (Aß*56) by over 60%. This effect of IVIg on cognition, immunity and Aß pathology suggests that Aβ oligomers, effector T cells and the fractalkine pathway are potential pharmacological targets of IVIg in AD. Finally, we studied the effect of an IVIg treatment in a mouse model of PD. In this model of MPTP intoxication, our results did not demonstrate neurorestorative effects of IVIg on the nigrostriatal system and even suggested adverse effects of IVIg on the dopaminergic system. These preclinical data highlighted the importance of proceeding cautiously in the initiation of clinical trials with IVIg to treat PD patients.