Tesis presentada para optar al grado de Doctor en Bioquímica / El Síndrome de Down se define como un desorden del desarrollo causado por la presencia de una copia extra del cromosoma 21, que va acompañado de anomalías multisistémicas principalmente a nivel del sistema nervioso central, generando una discapacidad cognitiva. Se ha descrito que el gen dscam, que codifica para la Molécula de Adhesión Celular del Síndrome de Down (DSCAM), presente en el cromosoma extra, actúa como una molécula de adhesión en el establecimiento y maduración de sinapsis y formación de nuevas redes neuronales a través de quinasas relacionadas directamente en procesos fisiológicos neuronales denominadas PAKs. Estas juegan un rol central en los mecanismos de señalización celular mediante LIMK1, la cual a su vez regula a Cofilina que reordenan el citoesqueleto en particular los filamentos de actina. En esta tesis se trabajó con líneas neuronales trisómicas de corteza cerebral de fetos de ratones Ts16, llamada CTb, y líneas control derivadas de un ratón normal de la misma camada llamada CNh, donde se desconocía la relación DSCAM-PAK sobre parámetros morfológicos neuronales. En este trabajo hipotetizamos que el aumento en la expresión de la proteína DSCAM en la línea celular CTb, en comparación con la línea normal CNh, produce una hiperactivación de PAK y sus efectores río abajo en la vía de señalización, lo que se traduce en una disminución del número y longitud de neuritas. El objetivo general fue determinar los niveles de expresión del gen dscam y su acción sobre la activación de PAK, analizando parámetros morfológicos en la línea neuronal CTb, utilizando como control a la línea CNh. Los objetivos específicos fueron: 1) Cuantificar los niveles de expresión de DSCAM. 2) Estudiar parámetros morfológicos, número y longitud de neuritas. 3) Determinar el nivel de expresión de las proteínas PAK y su estado de activación. 4) Determinar la activación de blancos moleculares río abajo de la vía PAK como LIMK1 y Cofilina. Se encontró en la línea CTb: 1) Un aumento en la expresión de DSCAM en comparación a la línea CNh, en condiciones basales de proliferación y diferenciación celular. 2) Menor complejidad neuronal, en cuanto al número y largo de sus neuritas en comparación a la línea normal. El knockdown para DSCAM en la línea CTb revirtió de manera parcial el fenotipo normal observado en CNh. 3) Las quinasas PAK se expresan de manera similar en ambas líneas celulares, con una mayor activación temporal de PAK1 en la línea CTb con respecto a CNh, tras activar DSCAM a través de su ligando específico, Netrina. La reducción de los niveles de DSCAM en la línea CTb a niveles comparables a aquellos de CNh, revierten la mayor activación de PAK1 inducida por Netrina. 4) Al igual que la activación temporal de LIMK1 y Cofilina. En conclusión, en esta tesis se demuestra que DSCAM se encuentra sobrexpresado en la condición trisómica, lo que lleva a una mayor sensibilidad de efectores transduccionales de la vía PAK, traduciéndose finalmente en una menor capacidad de extensión de procesos. Por lo tanto, en este trabajo identificamos un circuito regulador clave dentro de la patología del Síndrome de Down, donde PAK juega un rol relevante como potencial blanco terapéutico específico / Down syndrome is defined as a developmental disorder caused by the presence of an extra copy of chromosome 21, which is accompanied by multisystem anomalies mainly in the central nervous system, which translates into a feature cognitive impairment. A gene that has many implications for development is dscam, which encodes for the Down Syndrome Cell Adhesion Molecule (DSCAM), which is present in the triplicated chromosome and acts as an adhesion molecule in the establishment and maturation of synapses, formation of new neural networks through kinases called p21-activated kinases (PAKs). PAKs play a central role in cell signaling mechanisms by LIMK1, which in turn regulates Cofilin, that reorganizes the cytoskeleton in particular by governing actin filament dynamics. In this thesis, we worked with trisomic neural lines from cerebral cortex of fetal Ts16 mice, called CTb, and control lines derived from the same tissue of a euploid littermate called CNh, where DSCAMPAK relationship on neural morphological parameters was unknown. In this work we hypothesized that the increased expression of DSCAM protein in the cell line CTb, compared to that of the normal line CNh, produces a hyperactivation of PAK and its effectors downstream in the signaling pathway, resulting in a decreased number and length of neurites. The overall objective was focused on determining the expression levels of dscam gene and its effect on the activation of PAK, in terms of morphological parameters regulating the latter, in neuronal line CTb using as controls CNh line. The specific objectives were: 1) Quantification of DSCAM expression levels. 2) Study of morphological parameters, number and length of neurites. 3) Determination of the expression levels PAK proteins and their activation state; and 4) to determine the activation of downstream molecular targets of the PAK pathway, LIMK1 and Cofilin. We found in line CTb: 1) An increase in the expression of DSCAM, compared to the CNh line at both basal proliferation and differentiation conditions. 2) Exhibits lower neuronal complexity by Sholl analysis, expressed in a reduced number as well as length of their neurites compared to the normal line. DSCAM knockdown, partially reversed to the normal phenotype observed in CNh cells. 3) PAK kinases were expressed similarly in both cell lines, but there is a greater temporal PAK1 activation in CTb line compared to on CNh cells, in response to DSCAM activation by its specific ligand Netrin. Upon knockdown-induced reduction of DSCAM levels in the CTb to levels comparable to those of CNh cells, the Netrin-induced activity of PAK1 is reduced to levels similar to those of CNh. 4) Similarly to the temporal activation way of LIMK1 and Cofilin. In conclusion, this thesis shows that DSCAM is overexpressed in the trisomic condition, which in turn leads to an increased translational activation of effectors of PAK pathway, finally resulting in a lower capacity to extend processes. Therefore, we have identified a specific key regulator circuit in Down Syndrome pathology, where PAK could play an important role as a potential therapeutic target / Conicyt; Fondecyt / 31 de diciembre de 2017

La dermatitis atòpica (DA) és l'expressió clínica d'un procés al.lèrgic en la pell que es manifesta en individus atòpics que entren en contacte amb un al.lergè en front al qual són hipersensibles. La DA es manifesta en l'home i en el gos per l'aparició sobtada de picor i de lesions cutànies immediates (fase primerenca o EAR). A més a més, en un percentatge elevat de pacients, la malaltia evoluciona cap a una fase tardana (LAR) que es sustenta en un procés inflamatori responsable possiblement dels símptomes crònics de la malaltia. En la DA humana i canina la inflamació es constitueix majoritàriament de cèl.lules dendrítiques i limfòcits T. En ambdues espècies s'ha demostrat que la resposta immunitària és inicialment de tipus Th2 i a mesura que la malaltia es fa crònica esdevé de tipus Th1. Durant el reclutament de les cèl.lules inflamatòries, s'activen entre d'altres, les molècules d'adhesió. Probablement en aquesta activitat participen els mastòcits (MC) de la dermis. La població mastocitària es col.loca en un lloc privilegiat per a coordinar el procés inflamatori per la seva situació anatòmica pròxima als vasos sanguinis i pel seu contingut en mediadors pro-inflamatoris. El coneixement dels mecanismes d' instauració de la inflamació en la DA és fonamental per a establir estratègies terapèutiques encaminades a reduir-la. Ens proposàrem estudiar l'expressió de la selectina P, l'ICAM-1 i el TNF-a en la DA, així com la contribució dels MC a la seva inducció en models canins in vitro i in vivo.Es van seleccionar gossos amb DA espontània en l'Hospital Clínic Veterinari de la Universitat Autònoma de Barcelona i es van tractar amb antibiòtics. Mitjançant immunohistoquímica, en les lesions cutànies es va observar una major expressió de selectina P que en les zones no lesionades. Aquest augment es correlacionava amb una adherència incrementada dels leucòcits a l'endoteli vascular. A més a més, mitjançant estudis in vitro amb línies cel.lulars de MC canins i cèl.lules endotelials de caròtida canina, vam demostrar que els mediadors mastocitaris són capaços d'induir l'expressió de selectina P endotelial. Això suggereix una relació funcional entre els MC i les cèl.lules endotelials de la dermis en la DA durant l'establiment del procés inflamatori, i pot reflexar la importància de la selectina P en les fases inicials de la inflamació al.lèrgica. Es va avaluar també l'expressió de TNF-a i ICAM-1 en gossos amb DA espontània. No es va observar un augment significatiu de cap d'aquestes dues molècules en las zones lesionades, però les dades suggereixen que existeix una tendència a la sobre-expressió d'ambdues. També es va observar que en la pell canina els MC són la font fonamental de TNF-a i es va comprobar mitjançant estudis in vitro que el TNF-a mastocitari és capaç d'induir l'expressió d'ICAM-1 endotelial. De nou s'estableix una relació funcional de l'eix MC / TNF-a / ICAM-1 endotelial que pot ser important en la patogènia de la inflamació al.lèrgica en la DA, encara que es requereix de nous experiments per a determinar la seva contribució al procés inflamatori. Les dificultats que impliquen els estudis en gossos amb DA natural i l'interés per avaluar el paper dels MC en aquest procés in vivo, ens va portar a contribuir a la caracterització d'un model caní de dermatitis al.lèrgica: el gos hipersensible a Ascaris suum. La injecció intradèrmica d'antigen (Ag) purificat d'Ascaris indueix una reacció immediata (pàpula) de la que són responsables majoritaris els MC. Vam observar que, a més, es produeix una inflamació en la dermis molt similar a la que s'observa en l'home. En l'establiment del procés inflamatori en aquest model juga un paper important la selectina P, de la que probablement els MC en siguin els inductors.En pell lesionada de gossos amb DA els MC poden ser els responsables de l'expressió de selectina P i d'altres molècules d'adhesió com l'ICAM-1 mitjançant l'alliberació de mediadors pro-inflamatoris com el TNF-a. Un procés inflamatori similar en el que probablement també participen els MC s'observa en el model de gos hipersensible a Ascaris en fer la injecció intradèrmica d'Ag. Aquest model suposa per tant un sistema biològic idoni per a caracteritzar la inflamació al.lèrgica en DA i mitjançant el protocol de sensibilització primària transcutània que hem establert hi haurà més accessibilitat a aquest model d'al.lèrgia cutània canina. / Atopic dermatitis (AD) is an allergic skin condition occurring in predisposed atopic individuals upon contact with an allergen. AD develops in humans and dogs, and appears clinically as an immediate cutaneous lesional reaction and pruritus, the so-called early allergic reaction (EAR). In many individuals, this evolves towards a late allergic reaction (LAR) with an underlying inflammatory process. In both species, human and canine, the primary cells in the inflammatory infiltrate are dendritic cells and T lymphocytes. Also the process switches from a Th2 to a Th1 response along the course of the disease. The cell recruitment is conducted by adhesion molecules and other pro-inflammatory cytokines possibly released by the dermal mast cells (MC) because of their prvivileged location close to the endothelial cells were this migration process takes place. The understanding of the mechanisms leading to allergic inflammation is of outmost relevance to establish future therapeutic strategies. We proposed to study the expression of P-selectin, ICAM-1 and TNF-a in AD and to assess the contribution of MC in canine in vitro and in vivo models.Dogs with spontaneous AD were selected at the Veterinary Teaching Hospital of the Universitat Autònoma de Barcelona. Immunohistochemistry revealed that lesional skin from these dogs had an over-expression of P-selectin when compared to non-lesional skin. This was paralleled by an increased adherence of leukocytes to the vascular endothelium. We also demonstrated in in vitro studies that canine MC were able to up-regulate P-selectin on the carotid endothelial surface. Altogether, this suggests a functional relation between MC and endothelial cells that might be relevant to P-selectin up-regulation in AD. We also assessed the expression of ICAM-1 and TNF-a but no over-expression was detected under our conditions. However, given that the counting showed a higher expression in the lesional sites, we concluded that there is a trend towards an increased expression of both pro-inflammatory molecules. We also observed that MC are the primary soruce of TNF-a in the skin and that, in vitro, such TNF-a is the main inductor of the up-regyulation of ICAM-1 in canine carotid endothelial cells. This in turn suggests a functional relation of the axis MC/TNF-a/ICAM-1 that might be important in the inflammatory process underlying AD. Given the problems associated to the study of the natural disease in dogs, we further characterized a canine model of AD that can provide insights on the relevance of MC to its pathogenesis: the Ascaris suum hypersensitive dog. In this model, the Ag i.d. injection triggers the release of MC vasoactive mediators responsible for the early wheal reaction. In addition, we observed an inflammatory process similar to the one in humans. P-selectin appears to contribute to such process as for the expression in the lesional skin revealed by immunhistochemistry.All this points at a potential role of MC in the LAR through the release of pro-inflammatory mediators such as TNF-a that do up-regulate the expression of adhesion molecules. Among these, P-selectin appears to bear a leading role in the induction of inflammation in AD and should be foreseen as a target when considering new management approaches. This was confirmed by our studies in the Ascaris suum hypersensitive canine model. The potential of such unique model increased in particular since we also propose a way to induce it rather than select the hypersensitive animals.

La listeriosis murina experimental se caracteriza por la rápida llegada de leucocitos, especialmente neutrófilos (PMNNs) y macrófagos a los órganos diana de la infección, hígado y bazo. El rápido reclutamiento de estas células a los focos de infección es vital para el control inicial de la infección. Las lesiones nerviosas en la listeriosis murina experimental se caracterizan por la afluencia masiva de PMNNs hacia las meninges y al sistema ventricular. Sin embargo, de la misma manera que el rápido reclutamiento de estas células a los focos de infección es vital para el control inicial de la infección, no se puede excluir la posibilidad de que el reclutamiento de PMNNs en el sistema nervioso central contribuya al desarrollo de las lesiones nerviosas mediante la liberación de mediadores inflamatorios y/o participando a la vehiculación y diseminación de la listerias. Uno de los objetivos principales de este trabajo doctoral fue el estudio de la expresión de las moléculas de adhesión endotelial E-selectina, P-selectina e ICAM-1 en el transcurso de la listeriosis murina experimental y determinar la correlación entre la expresión de dichas moléculas y las lesiones inflamatorias observadas. Asimismo, se intentó elucidar la importancia de los PMNNs en la patogenia de las lesiones nerviosas mediante la utilización del anticuerpo monoclonal RB6-8C5, el cual depleciona específicamente la población de PMNNs in vivo .La estandarización de las técnicas inmunohistoquímicas para la detección de las moléculas de adhesión endotelial E-selectina, P-selectina e ICAM-1 en tejidos de ratón fijados en formol e incluidos en parafina fue llevada a cabo mediante la caracterización de su expresión en ratones normales y en un modelo de activación endotelial por lipopolisacárido bacteriano. E-selectina fue únicamente detectada tras activación endotelial en la mayoría de los órganos. ICAM-1fue detectada de forma constitutiva en células endoteliales de todos los órganos estudiados y su expresión fue sobre-regulada tras activación con lipopolisacárido. Estos resultados están en concordancia con los resultados obtenidos previamente por otros autores en tejidos congelados.En el modelo murino de listeriosis, tanto P-selectina como ICAM-1 fueron inducidas y/o sobre-expresadas rápidamente tras la infección. E-selectina fue detectada únicamente de forma espóradica en este modelo. Tras esta primera fase de activación endotelial inespecífica, la sobre-expresión de estas moléculas estuvo asociada a la presencia de lesiones inflamatorias en los órganos diana de la infección, especialmente hígado, órganos linfoides secundarios y SNC. En el hígado, la aparición de las lesiones inflamatorias está correlacionada con la expresión de ICAM-1 en los sinusoides hepáticos y de P-selectina e ICAM-1 en las venas centrolobulillares y en los vasos situados en el espacio porta. La lesiones esplénicas estuvieron asociadas a la expresión de ICAM-1 en la zona marginal de la pulpa blanca. En los linfonodos inflamados, P-selectina e ICAM-1 fueron detectadas en las venas de endotelio alto. En el SNC, las lesiones iniciales consistieron en una leptomeningitis purulenta asociada a una fuerte expresión endotelial de P-selectina e ICAM-1 en vénulas del espacio subaracnoideo, especialmente en aquellas situadas en la fisura del hipocampo. La aparición de ventriculitis y/o coroiditis purulentas en nuestro modelo fue un fenómeno posterior a la presencia de meningitis y está asociado a una intensa expresión de ICAM-1 las células epiteliales coroideas y en las células ventriculares así como en el endotelio de vasos periventriculares. La depleción de PMNNs mediante la administración del anticuerpo monoclonal RB6-8C5 durante la listeriosis murina experimental facilitó la multiplicación de Listeria monocytogenes en el SNC pero aparentemente no previno o interfirió su acceso al encéfalo. Estas observaciones sugieren que los PMNN tienen una función esencial en la prevención del acceso y/o la multiplicación de L. monocytogenes en el SNC. / Systemic murine listeriosis is characterized by the rapid influx of leukocytes, especially neutrophils but also macrophages, into the site of initial bacterial replication, especially the liver and spleen. Neutrophils play a critical role in reducing the bacterial burden in these organs. Neutrophils are also the main inflammatory cell present in meningitis, ventriculitis/choroiditis and rombencephalitis that develop during the course of human and experimental murine listeriosis. Recruited neutrophils are thought to contribute to the elimination of L. monocytogenes, although they could also be involved in the development of progressive brain injury via the release of harmful mediators and/or participating in the dissemination of Listeria . The aim of this study was to detect by immunohistochemistry the expression of the endothelial adhesion molecules E-selectin, P-selectin and ICAM-1 during the course of experimental murine listeriosis and to determine if correlation existed between the expression of these adhesion molecules and the inflammatory infiltrate in the target organs. In addition, the role of neutrophils in the development of the lesions in the central nervous system (CNS) was studied by the in vivo administration of the neutrophil-depleting antibody RB6-8C5. Immunohistochemical techniques to detect ICAM-1, P-selectin and E-selectin in formalin-fixed, paraffin embedded tissues were developed using standard antigen unmasking protocols. The distribution and pattern of expression of E-selectin and ICAM-1 in normal and lipopolysaccharide-stimulated mice was described. No constitutive expression of E-selectin was found in any of the normal tissues investigated. In stimulated animals, E-selectin expression was detected on endothelial cells in most evaluated organs. ICAM-1 was constitutively expressed, and was upregulated in all the organs after LPS inoculation. The results paralleled previous studies where immunohistochemistry on frozen sections was used. During the course of experimental murine listeriosis, a strong up-regulation of P-selectin and ICAM-1 occurred rapidly after the infection. E-selectin was faint and inconstantly detected in all the studied organs. The expression of these adhesion molecules was correlated with the recruitment of leukocytes, especially to the liver, lymphoid organs and CNS. In the liver, typical lesions of murine listeriosis were related to the expression of ICAM-1 on sinusoidal endothelial cells, and to the de novo expression of P-selectin in hepatic portal vessels. Inflammation in the spleen was related to the expression of ICAM-1 on red pulp sinusoidal cells, especially in the marginal sinus. High endothelial venules of inflamed lymph nodes also expressed P-selectin and ICAM-1. In the CNS, the expression of P-selectin and up-regulation of ICAM-1 in meningeal vessels, especially in those located in the hippocampal sulcus, was associated with the initial meningeal inflammation and suggest that neutrophils probably reach the CNS through these vessels during experimental murine listeriosis. Leptomeningitis was followed by the presence of ventriculitis, which was related to the up-regulation of ICAM-1 on choroid plexus epithelial cells, periventricular vessels and ependimal cells.Administration of the neutrophil-depleting antibody RB6-8C5 during experimental murine listeriosis enhanced or facilitated multiplication of L. monocytogenes as well as lesion formation in the CNS of infected mice. Thus, neutrophils not only play a key role in host defense against L. monocytogenes infection in the limiting early bacterial multiplication in the liver and the spleen, but they are also crucial in eliminating bacteria that gain access to the CNS compartment.

La acumulación leucocitaria es una característica de los primeros estadios de la lesión aterosclerótica, de infarto agudo de miocardio y de enfermedades renales de diversa etiología. Receptores para Angiotensina-II (Ang-II) han sido hallados en monocitos y Ang-II puede promover la activación y adhesión de estas células. Este proceso podría desencadenar o perpetuar el daño endotelial asociado a aterosclerosis e hipertensión. Los resultados de nuestro estudio demuestran que Ang-II, a dosis subvasoconstrictoras y fisiológicas, presenta propiedades proinflamatorias in vivo a nivel agudo; en concreto, produce acumulación leucocitaria en vénulas de la microcirculación mesentérica de la rata a través del aumento de expresión de P-selectina endotelial, efecto mediado mediante interacción con sus receptores específicos AT1 y AT2. Sin embargo, el hecho más relevante de este trabajo es que al administrar Ang-II de forma subaguda se produce adhesión leucocitaria no sólo a nivel venular sino también a nivel arteriolar, hecho que podría relacionarla directamente con el inicio de la lesión aterosclerótica. Las respuestas leucocitarias inducidas por Ang-II a nivel agudo pueden ser moduladas por antioxidantes, por compuestos capaces de aumentar los niveles de AMPc, GMPc y por estrógenos. Además, en circunstancias de disfunción endotelial producida por falta de vasodilatadores como NO o PGI2, se produce una rápida respuesta inflamatoria la cual está mediada por Ang-II ya que el tratamiento con el antagonista selectivo frente al receptor AT1 inhibió la infiltración leucocitaria y los cambios hemodinámicos debidos a la carencia de estos vasodilatadores. / Leukocyte accumulation in the vascular wall is a hallmark of the early stages of atherosclerotic lesions, myocardial infarction and several renal diseases. Ang-II receptors have been detected on human monocytes and are capable of promoting monocyte adhesion and activation in vitro. Therefore, Ang-II may be the stimulus for the subendothelial infiltration of leukocytes observed in hypertension and atherosclerosis, in both of which conditions plasma levels of this peptide are elevated. In this study, we show that subvasoconstrictor and physiologically relevant doses of Ang-II (0.1 to 1 nmol/L) elicit leukocyte-endothelial cell interactions within the rat mesenteric microvenules. This effect is both AT1 and AT2 receptor-mediated and is dependent on endotelial P-selectin expression. However, the most relevant finding of the present work is that subacute Ang-II administration induces arteriolar leukocyte adhesion, which may directly implicate Ang-II in the onset of atherosclerotic lesions. Acute leukocyte responses induced by Ang-II are modulated by antioxidants, estrogens and compounds that increase the levels of AMPc and GMPc. Eventually, when the vascular balance is disrupted by falling levels of vasodilators such as NO or PGI2, there is a rapid arterial leukocyte adhesion. This adhesion is predominantly Ang-II dependent, as pretreatment with a selective AT1-antagonist receptor inhibits leukocyte infiltration and haemodynamic changes.