Made available in DSpace on 2016-08-10T10:53:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 LEANDRO DOBRACHINSKI.pdf: 1309361 bytes, checksum: 9ed7a6a6c3ff40cb207d958b59532e76 (MD5) Previous issue date: 2012-03-13 / Venomous snakes have a real cocktail of pharmacological active substances and drugs that act powerfully against microorganisms. The objective of the present study was to evaluate in vitro the potential cytotoxic activity of Caudisona durissa terrificus venom in mononuclear cells (MNC) of peripheral human blood. After obtaining MNC for cell culture, the cytotoxic effect of different concentrations of crude venom was evaluated. The peripheral blood MNC were separated using a density gradient and were incubated (2x105 cells/well) with different venom concentrations (50, 5, 0,5, 0,05, 0,005 e 0,0005 µg/mL) for different times (1, 3, 6, 24, 48 e 72h) and in different substrates (PHA, IL lly examining the plates after 24, 48 and 72 hours. Was also observed with different concentrations of crude venom induced ADN fragmentation in MNC. We observed that the toxicity of crude C. d. terrificus venom varies proportionally with concentration, i.e., the higher the concentration, the higher its cytotoxicity. For this reason the 0.0005µg/mL concentration of crude Caudisona durissa terrificus venom presented the lowest cytotoxic activity in peripheral human blood MNC and that the fragmentation of cellular ADN was not seen in this study. Thus, it is suggested to employ two or more different assays to confirm the induction of cell death is occurring through apoptosis. / Serpentes peçonhentas produzem uma variedade de toxinas altamente citotóxicas. Possuem um verdadeiro coquetel de substâncias farmacológicas, tornando-se uma , que atualmente vem sendo utilizados por inúmeros pesquisadores, para o desenvolvimento de novos fármacos com potente ação contra microorganismos. O presente estudo visou avaliar a potencial atividade citotóxica da peçonha de Caudisona durissa terrificus em células mononucleares (CMN) do sangue periférico humano, in vitro. Após a padronização da obtenção de CMN para cultivo celular, foi realizada a avaliação do efeito citotóxico de diferentes concentrações do veneno bruto. As CMN do sangue periférico foram separadas por meio gradiente de densidade e incubadas (2x105 células/poço) com diferentes concentrações do veneno (50, 5, 0,5, 0,05, 0,005 e 0,0005 µg/mL), em diferentes tempos (1, 3, 6, 24, 48 e 72h) e substratos (PHA, IL 2). A avaliação da atividade citotóxica do veneno foi realizada, por meio da leitura das células em câmara de neubauer, após 24, 48 e 72 horas. Em conclusão, foi possível identificar que a citotoxicidade do veneno bruto de C. d. terrificus varia de forma proporcional à concentração, ou seja, quanto maior a concentração do veneno, maior a sua citotoxicidade. Com isso, a concentração de 0,0005µg/mL do veneno bruto de Caudisona durissa terrificus, neste experimento, apresentou uma baixa atividade citotóxica em CMN de sangue periférico humano e que a fragmentação do DNA celular não foi visualizada neste estudo. Desta forma, sugere-se empregar dois ou mais ensaios distintos para confirmar se a indução da morte celular está ocorrendo por meio de apoptose.

Made available in DSpace on 2016-08-10T10:53:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MARILISSA MACIEL MAINERI.pdf: 1118474 bytes, checksum: eb4934dbea4478c904915745c3e64da5 (MD5) Previous issue date: 2012-03-22 / Venomous snakes have a real cocktail of pharmacological active substances and drugs that act powerfully against microorganisms. The objective of the present study was to evaluate in vitro the potential cytotoxic activity of Caudisona durissa collilineata venom in mononuclear cells (MNC) of peripheral human blood. After obtaining MNC for cell culture, the cytotoxic effect of different concentrations of crude venom was evaluated. The peripheral blood MNC were separated using a density gradient and were incubated (2x105 cells/well) with different venom concentrations (50, 5, 0,5, 0,05, 0,005 e 0,0005 µg/mL) for different times (1, 3, 6, 24, 48 e 72h) and in different substrates (PHA, IL visually examining the plates after 24, 48 and 72 hours. Was also observed with different concentrations of crude venom induced ADN fragmentation in MNC. We observed that the toxicity of crude C. d. collilineata venom varies proportionally with concentration, i.e., the higher the concentration, the higher its cytotoxicity. For this reason the 0.0005µg/mL concentration of crude Caudisona durissa collilineata venom presented the lowest cytotoxic activity in peripheral human blood MNC and that the fragmentation of cellular ADN was not seen in this study. Thus, it is suggested to employ two or more different assays to confirm the induction of cell death is occurring through apoptosis. / Serpentes peçonhentas produzem uma variedade de toxinas altamente citotóxicas. Possuem um verdadeiro coquetel de substâncias farmacológicas, tornando-se uma , que atualmente vem sendo utilizados por inúmeros pesquisadores, para o desenvolvimento de novos fármacos com potente ação contra microorganismos. O presente estudo visou avaliar a potencial atividade citotóxica da peçonha de Caudisona durissa collilineata em células mononucleares (CMN) do sangue periférico humano, in vitro. Após a padronização da obtenção de CMN para cultivo celular, foi realizada a avaliação do efeito citotóxico de diferentes concentrações do veneno bruto. As CMN do sangue periférico foram separadas por meio gradiente de densidade e incubadas (2x105 células/poço) com diferentes concentrações do veneno (50, 5, 0,5, 0,05, 0,005 e 0,0005 µg/mL), em diferentes tempos (1, 3, 6, 24, 48 e 72h) e substratos (PHA, IL 2). A avaliação da atividade citotóxica do veneno foi realizada, por meio da leitura das células em câmara de neubauer, após 24, 48 e 72 horas. Em conclusão, foi possível identificar que a citotoxicidade do veneno bruto de C. d. collilineata varia de forma proporcional à concentração, ou seja, quanto maior a concentração do veneno, maior a sua citotoxicidade. Com isso, a concentração de 0,0005µg/mL do veneno bruto de Caudisona durissa collilineata, neste experimento, apresentou uma baixa atividade citotóxica em CMN de sangue periférico humano e que a fragmentação do DNA celular não foi visualizada neste estudo. Desta forma, sugere-se empregar dois ou mais ensaios distintos para confirmar se a indução da morte celular está ocorrendo por meio de apoptose.

Made available in DSpace on 2016-08-10T10:55:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 JOSE VITELIO RUIZ RIVERO.pdf: 2033176 bytes, checksum: d4ea9284ff8bc2e6c776e40cb6b237fd (MD5) Previous issue date: 2010-12-20 / Snake venoms are biological resources of great pharmaceutical value. Besides presenting a small number of antiviral drugs, a large amount of pathogens develop mechanisms which escape from the action of the drugs, thus causing the growth of resistance. It was demonstrated that biomolecules contained in venoms have high therapeutic values which could be used as antimicrobial agents. The objective of this research is to evaluate the non cytotoxic activity which was isolated from the venom of Bothrops jararacussu in peripheral blood mononuclear cells. In this research, mononuclear cells were separated from healthy donors. After the activation of the cells with phytohemagglutinin and interleukin-2, different concentrations of the poison were added in order to evaluate its non cytotoxic activity. The concentration of the venom at 0.05 mg/mL showed no cytotoxicity, but at 5 and 0.5 mg/mL it was cytotoxic. Our study opens the way to further researches which aim to identify the antimicrobial activities of crude venoms and their fractions. / Os venenos ofídicos são recursos biológicos de importante valor farmacológico. Além do número pequeno de drogas antivirais, numerosos patógenos desenvolvem mecanismos de escape à ação das drogas, resultando no crescimento das taxas de resistência. Foi demonstrado que biomoléculas contidas nos venenos ofídicos apresentam alto valor terapêutico, que poderiam ser usadas como agentes antimicrobianos. O objetivo desta pesquisa é avaliar a atividade não citotóxica do veneno bruto isolado da Bothrops jararacussu em células mononucleares do sangue periférico. Nessa pesquisa foram separadas células mononucleares de doadores sadios. Após ativação das células com fitohemaglutinina e interleucina-2 foram adicionadas diferentes concentrações do veneno para avaliar sua atividade não citotóxica. O veneno na concentração de 0,05 μg/mL não apresentou citotoxicidade, entretanto foi citotóxico nas concentrações de 5 e 0,5 μg/mL. Nosso estudo abre caminho para novas pesquisas voltadas para a identificação das atividades antimicrobianas dos venenos brutos e suas frações.

Nos últimos anos, nosso grupo de pesquisa vem descrevendo vários efeitos da SAA em células do sistema imune no que diz respeito à expressão e liberação de citocinas pró-inflamatórias. Neste estudo centramos nossa atenção na verificação dos efeitos da SAA sobre células mononucleares. Para isto, usamos três modelos experimentais. Em murinos, descrevemos a habilidade da SAA induzir a produção de NO por macrófagos peritoneais e, com uso de animais knockout para TLR4, sugerimos que SAA seja um ligante endógeno do TLR4. Em células mononucleares de sangue periférico humano, a SAA induz a expressão e liberação de CCL20, uma quimiocina importante na transição da resposta imune inata para adaptativa, bem como a expressão dos fatores M-CSF e VEGF. Em células THP-1, mostramos a cinética de fosforilação de proteínas tirosina quinases promovida pela SAA e comparamos com LPS, um estímulo pró-inflamatório clássico. Ainda em células THP-1 mostramos que a SAA induz a fosforilação de duas proteínas importantes no processo inflamatório por induzirem a ativação de NFκB; a p38 e a ERK1/2. Com este estudo contribuímos com o conhecimento a respeito do papel regulatório da SAA em células mononucleares. A ação da SAA sobre estas células torna-se importante, pois estas são cruciais na resposta imune inata e também atuam como células acessórias na resposta imune adaptativa. Desta forma, evidencia-se que, no processo de fase aguda, a expressão e a síntese de SAA resultam na modulação de etapas que controlam este processo e sua progressão. / In the past few years, our research group has described various effects of serum amyloid A (SAA) on cells of the immune system regarding the expression and release of pro-inflammatory cytokines. In this study we have focused on the effects of SAA on mononuclear cells. In order to do this, we have used three experimental models. In the murine experimental model, we described SAA\'s ability to induce the production of NO through peritoneal macrophages and, by using knockout animals for TLR4, we suggested that SAA is an endogenous agonist of TLR4. In mononuclear cells of peripheral human blood, SAA induced the expression and release of CCL20, an important chemokine in the transition from the innate to the adaptive immune response, as well as the expression of M-CSF and VEGF-factors. In THP-1 cells, we showed the phosporylation kinetics of tyrosine protein kinases induced by SAA, and we compared it to LPS, a classic pro-inflammatory stimulus. We also demonstrated, in THP-1 cells, that SAA induced the phosphorylation of two proteins, namely p38 and ERK1/2, that are crucial in the inflammatory process because they induce the activation of transcription factors. With this study, we contributed to the knowledge of the regulatory role of SAA in mononuclear cells. Activity of SAA on these cells is highly important, for they are crucial in the innate immune response and act as accessory cells in the adaptive immune response. Hence it is evident that, in the acute phase process, the expression and synthesis of SAA result in the modulation of the phases that control this process and its progression.

Alguns parasitas modificam o perfil de Compostos Orgânicos Voláteis (COVs) de seus hospedeiros na tentativa de atrais/dispersar seus vetores, assegurando a propagação do parasita e a manutenção do ciclo da doença. É sabido que o mosquito Lutzomyia longipalpis, vetor da Leishmaniose Visceral (LV) são mais atraídos por cães infectados que não infectados. Este trabalho tem como objetivo identificar e caracterizar os Compostos Orgânicos Voláteis emitidos por culturas de células e hamsters infectados Mesocricetus auratus com Leishmania infantum (MHOM/74/PP75). Células aderentes mononucleares de baço de hamsters foram separadas com Ficoll e distribuídas em placas de 24 poços com 2x106 células por poço. Após 42 horas, as células foram infectadas e os COVs foram coletados por \"headspace\" por 18 horas. Os COVs foram determinados por comparação com as placas controle: controle células aderentes mononucleares, controle L. infantum, e controle meio RPMI 1640.40 Hamsters foram subdivididos em 2 grupos: 20 animais foram infectados com formas promastigotas metacíclicas de L. infantum selecionadas com aglutinina de amendoim (PNA) por via intracardíaca com 1x107 parasitas. Os animais foram acompanhados por 4 meses pós infecção e as amostras foram coletadas colocando os animais em sacos de poliéster conectados com um tubo de metal recheado com Tenax TA acoplado a uma bomba de sucção automática por 10 minutos. Todas as amostras foram analisadas por dessorção térmica via Cromatografia gasosa/ Espectrometria de Massas (CG-EM). Nas culturas de células, 2 compostos estão presentes apenas nas culturas infectadas: 1,2-difenilciclobutano e (E)-(2,3-Difenil Ciclopropil)-metil-fenilsulfóxido. O 2,4-dimetilbenzaldeído estava presente na placa controle contendo meio RPMI 1640. Por outro lado, em ambas as placas infectadas e controle com células aderentes mononucleares, o 3-metileno-heptano estava presente. Outros compostos contendo os grupos químicos aldeídos ou álcoois ou hidrocarbonetos aromáticos foram detectados em todas as placas, mas com diferentes áreas de pico (quantidade). Quando comparamos os COVs emitidos por hamsters infectados e controles, nenhuma diferença foi encontrada. Os compostos emitidos por culturas de células infectadas mostram que a infecção com L.infantum é capaz de modificar o perfil de COVs em culturas de células. Outros compostos encontrados em todas as placas, mas com diferentes áreas de pico podem indicar que a infecção aumenta a liberação de algumas substâncias que são possíveis atrativos para vetores. / Some parasites can modify their hosts Volatile Organic Compounds (VOCs) profile in order to attract / disperse their vectors, ensuring spreading of the parasite and maintenance of the disease cycle. It is already known that Lutzomyia longipalpis sandflies, the vectors of Visceral Leishmaniasis (VL), are more attracted to infected than to non-infected dogs. This work aims to identify and characterize the VOCs emitted by cell cultures and hamsters Mesocricetus auratus infected with Leishmania infantum (MHOM/74/PP75). Spleen adherent mononuclear cells of hamsters were separed with Ficoll and distributed in flat-bottomed 24-well plates at 2x106 cells per well. After 42 hours, the cells were infected and VOCs were collected from the \"headspace\" for 18 hours. The VOCs were determined in comparison with the controls plates: control mononuclear adherent cells, control L. infantum and control medium RPMI 1640. 40 Hamsters were subdivided in two groups: 20 animals were used as a control group and 20 animals were infected with metaciclic form of L. infantum selected by peanut agglutinin (PNA) by intracardiac route with 1x107 parasites. The animals were followed up for 4 months post-infection and the samples were collected by introducing the hamsters in a polyester bag connected with a metal tube filled with the Tenax TA adsorbent coupled to an automatic suction pump for 10 minutes. All samples were analyzed by thermal desorption via Gas Chromatography/Mass Spectrometry (GCMS). In cell cultures, two compounds were present only in infected cultures: 1, 2- diphenyl cyclobutane, and trans-[(2, 3-Diphenylcyclopropyl) methyl] phenyl sulfoxide. 2, 4-dimethyl benzaldehyde was present in the control well containing RPMI 1640 medium. On the other hand, in both infected and control wells with mononuclear adherent cells, 3-methylene heptane was present. Other compounds containing either aldehydes or alcohols or aromatic hydrocarbon chemical groups were detected in all plates, but with different peak areas (i.e., amounts). When comparing the VOCs emitted by infected and control hamsters, no difference was found. The compounds emitted only by infected cell cultures show that the infection with L. infantum is able to modify the profile of VOCs in cell cultures. The other compounds found in all plates but with different peak areas may indicate that infection may increase the release of some substances that are possible attractants for vectors.

O tratamento sistêmico é extremamente importante na abordagem clínica do câncer de mama. O presente estudo teve a finalidade de avaliar se a quimioterapia sistêmica é capaz de produzir instabilidade genética representada por instabilidade de microssatélites (MSI) e perda de heterozigosidade (LOH) na fração mononuclear do sangue periférico de pacientes portadoras de câncer de mama. Foram estudadas 119 amostras de sangue, obtidas seqüencialmente antes, durante e após a quimioterapia. Das 30 pacientes avaliadas, 27 apresentaram MSI em pelo menos uma das amostras estudadas e 6 desenvolveram LOH. Uma importante correlação foi obtida entre o número de eventos de MSI por amostra e quimioterápicos com agentes alquilantes (p < 0,0001). Entretanto, quando as amostras foram de pacientes em radioterapia, observou-se um menor número de eventos de MSI por amostra (p=0,038). Concluímos que o tratamento sistêmico pode induzir MSI e LOH em células mononucleares do sangue periférico de pacientes em tratamento quimioterápico com agentes alquilantes / Systemic chemotherapy is an important part of treatment for breast cancer. We conduced the present study to evaluate whether systemic chemotherapy could produce microsatellite instability (MSI) in the peripheral blood mononuclear cell fraction of breast cancer patients. We studied 119 sequential blood samples from 30 previously untreated breast cancer patients before, during and after chemotherapy. In 27 out of 30 patients we observed MSI in at least one sample, and six patients had loss of heterozygosity (LOH). We found a significant correlation between the number of MSI events per sample and chemotherapy with alkylating agents (p < 0.0001). However, when the samples were obtained in patients with radiotherapy we observed low MSI events per samples (p = 0.038). We concluded that systemic chemotherapy may induce MSI and LOH in peripheral blood mononuclear cells from breast cancer patients receiving alkylating agents

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A disfunção mitocondrial tem sido associada a várias doenças, incluindo a colestase hepática, caracterizada pela ativação de células de Kupffer e células fibrogênicas, as quais produzem matriz extracelular excessiva. O acúmulo de sais biliares tóxicos no parênquima hepático leva à lesão crônica com dano mitocondrial, redução da síntese de ATP, aumento de espécies reativas de oxigênio (ROS) e apoptose, resultando em comprometimento da função hepática. Trabalhos anteriores do nosso grupo mostraram o efeito positivo do transplante de células mononucleares da medula óssea (CMMO) na resolução da fibrose hepática e recuperação da função hepática em ratos com colestase, induzida pela ligadura de ducto biliar (LDB). Assim, o presente estudo teve como objetivo analisar a bioenergética mitocondrial após o transplante de CMMO no fígado de ratos com fibrose induzida por ligadura de ducto bilar (LDB). Ratos Wistar machos foram divididos em quatro grupos: animais normais, animais com fibrose hepática após 14 e 21 dias de LDB (F14d e F21d, respectivamente), e animais que após 14 dias de LDB receberam 1x107 CMMO, e foram eutanasiados sete dias após. Nossos dados demonstraram aumento do conteúdo de colágeno tipo I no grupo F21d em relação ao grupo normal, indicativo de fibrose, e sua diminuição após o transplante de CMMO. A análise da fisiologia mitocondrial do fígado mostrou diminuição significativa da taxa respiratória máxima estimulada por ADP (estado 3) nos grupos F14d e F21d, indicando redução da capacidade de oxidação de carboidratos e ácidos graxos. Além disso, a razão do controle respiratório (RCR), indicativa de acoplamento da fosforilação oxidativa com a produção de ATP, apresentou-se significativamente diminuída nos grupos F14d e F21d, sugerindo desacoplamento mitocondrial. No entanto, o transplante de CMMO aumentou significativamente nestes grupos tanto a capacidade oxidativa quanto o acoplamento mitocondrial a níveis semelhantes aos do grupo normal. Estes resultados foram confirmados por análise de western blotting, que mostrou aumento significativo no conteúdo de UCP2 e diminuição do conteúdo de PGC-1&#945; no grupo F21d, com consequente restauração após o transplante de CMMO. Além disso, os resultados mostraram um aumento significativo do conteúdo de 4-HNE no grupo F14d com redução após o transplante CMMO. Assim, podemos concluir que o transplante de CMMO tem um efeito positivo sobre a bioenergética mitocondrial de fígados de ratos com colestase, com aumento da capacidade oxidativa e redução do estresse oxidativo, o que, por sua vez, contribui para a recuperação da função hepática. / Mitochondrial dysfunction has been associated with several diseases, including liver cholestatis, which is characterized by activation of Kupffer cells and fibrogenic cells that produce excessive extracellular matrix. Toxic bile salt accumulation in liver parenchyma leads to chronic injury with mitochondrial damage, ATP synthesis reduction, ROS increase and apoptosis, resulting in liver function impairment. Our previous works showed the positive effect of bone marrow mononuclear cells (BMMNC) transplantation on liver fibrosis resolution and hepatic function recover in cholestatic rats. This study aimed to analyze mitochondrial bioenergetics in rats with hepatic fibrosis induced by bile duct ligation (BDL) after BMMNC transplantation. Wistar male rats were divided into four groups: normal animals, animals with cholestasis after 14 and 21 days BDL (F14d and F21d, respectively), and animals with cholestasis after 14 days of BDL that received 1x107 BMMNC, via jugular vein, and were euthanasia after 7 days. The livers were analyzed by high-resolution respirometry and western blotting. Our data demonstrated increased collagen type I content in livers of F21d group compared to normal group, indicative of fibrosis, and its decrease after BMMNC transplantation. Liver mitochondrial physiology analysis showed that F14d and F21d groups have significantly reduced maximum ADP-stimulated respiratory rates (State 3), indicating reduced carbohydrates and fatty acids oxidation capacity. In addition, respiratory control ratio (RCR), indicative of oxidative phosphorilation coupling to ATP production, was significantly decreased in F14d and F21d groups, suggesting mitochondrial uncoupling. However, BMMNC transplantation significantly increased both State 3 respiration and RCR to levels similar to those of normal group, recovering hepatic mitochondrial function. These results were confirmed by WB analysis, which showed that F21d group had a significantly increase in liver mitochondrial uncoupling protein content, UCP2, and reduced PGC-1&#945; content, a mitochondrial biogenesis co-factor. However, after BMMNC transplantation both proteins returned to levels similar to normal group. In addition, F14d group had a significantly increase in 4-HNE content compared to normal group, indicative of oxidative stress, but after BMMNC transplantation 4-HNE content significantly reduced, compared to normal group, suggesting oxidative stress reduction. Therefore, BMMNC transplantation had a positive effect on hepatic mitochondrial bioenergetics of cholestatic rats, increasing oxidative capacity and reducing oxidative stress, which, in turn, contribute to liver function recover.

Submitted by DANIELE LOPES PEREIRA null (danielelopesp@hotmail.com) on 2016-05-11T22:02:11Z No. of bitstreams: 1 dissertação maio - 2016.doc: 36656128 bytes, checksum: 544a8bb80add41fb7e4e0faa6dc3b70c (MD5) / Rejected by Felipe Augusto Arakaki (arakaki@reitoria.unesp.br), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo as orientações abaixo: A versão final da dissertação/tese deve ser submetida no formato PDF (Portable Document Format). O arquivo PDF não deve estar protegido e a dissertação/tese deve estar em um único arquivo, inclusive os apêndices e anexos, se houver. E também, o arquivo submetido está sem a folha de aprovações providenciada pela Pós-graduação. Lembramos que a versão submetida por você é considerada a versão final da dissertação/tese, portanto não poderá ocorrer qualquer alteração em seu conteúdo após a aprovação. Corrija estas informações e realize uma nova submissão contendo o arquivo correto. Agradecemos a compreensão. on 2016-05-13T16:38:51Z (GMT) / Submitted by DANIELE LOPES PEREIRA null (danielelopesp@hotmail.com) on 2016-08-12T21:37:08Z No. of bitstreams: 1 Terapia celular em fibrose pulmonar.pdf: 14681718 bytes, checksum: ddd650e002e44e6ba3817e66564c1581 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-08-15T19:52:38Z (GMT) No. of bitstreams: 1 pereira_dl_me_assis.pdf: 14681718 bytes, checksum: ddd650e002e44e6ba3817e66564c1581 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-15T19:52:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 pereira_dl_me_assis.pdf: 14681718 bytes, checksum: ddd650e002e44e6ba3817e66564c1581 (MD5) Previous issue date: 2016-03-15 / A Fibrose Pulmonar (FP), também denominada Alveolite Fibrosante, é uma pneumopatia idiopática, crônica e irreversível, que acomete o tecido pulmonar promovendo a deposição de tecido fibroso cicatricial e consequente remodelamento da arquitetura pulmonar. Considerando a inexistência de um tratamento clínico curativo que não seja apenas paliativo, a terapia com células-tronco desponta como alternativa promissora no tratamento da fibrose pulmonar e diversas outras patologias. Neste contexto, este projeto propôs o emprego da terapia celular com células-tronco mesenquimais de tecido adiposo humano (CTMTA) e “pool” de células mononucleares da medula óssea (BMMC), isoladas ou conjuntamente, em modelo experimental de fibrose pulmonar. Foram utilizados 36 ratos Wistar divididos em 6 grupos. O grupo controle recebeu instilação intratraqueal de tampão fosfato. Cinco grupos foram instilados com bleomicina (2U/animal) para a indução da doença e, após 14 dias, submetidos ou não a diferentes tratamentos utilizando células mononucleares da medula óssea e/ou células-tronco mesenquimais de tecido adiposo, sendo que um grupo recebeu tratamento placebo com tampão fosfato. A análise histológica evidenciou o desenvolvimento de fibrose nos animais instilados com bleomicina (p<0,0001) e uma melhora do quadro fibrótico nos animais submetidos ao tratamento, independentemente do tipo celular utilizado (p<0,001). A ventilação pulmonar basal revelou a presença de esforço respiratório nos animais instilados com bleomicina (p=0,0260), porém nenhum tipo de terapia foi capaz de reverter esse quadro. Não houve diferença significativa entre o perfil de leucócitos encontrados no lavado broncoalveolar dos animais sadios e doentes, entretanto a terapia com CTMTA promoveu a redução da porcentagem de linfócitos e o aumento de macrófagos nos animais doentes. O tratamento com BMMC e CTMTA, realizado de modo isolado ou em conjunto, mostrou remissão significativa do quadro de fibrose instalado. / Pulmonary Fibrosis (PF), also known as fibrosing alveolitis, is an idiopathic, chronic, irreversible lung disease that affects the lung tissue by promoting the deposition of fibrous scar tissue and subsequent lung architecture remodeling. Considering the need for curative medical treatment that is not only palliative, stem cell therapy is emerging as a promising alternative for the treatment of pulmonary fibrosis and many other diseases. ln this context, it is proposed in this study the cell therapy with mesenchymal stem cells derived from human adipose tissue (CTMTA) in association with the pool of mononuclear bone marrow cells (BMMC) in an experimental model of pulmonary fibrosis. The disease was induced in 4 groups of Wistar rats (n = 6) by intratracheal bleomycin (2U/animal). 14 days after instillation, each group was subjected to a specific treatment with BMMC and CTMTA, isolated or combined mode, while a fourth group was treated with phosphate buffer. The control group was instilled and treated with phosphate buffer. Histological analysis showed the development of disease in animais instilled with bleomycin (p<0,0001) and untreated, and improvement in the fibrous framework of animais subjected to cell therapy (p<0,001 ). The basal ventilation revealed the presence of respiratory effort in animais instilled with bleomycin, submitted or not to therapy (p=0,0260). Treatment with BMMC and CTMTA, performed alone or in conjunction mode showed similar results, since both promoted remission of pulmonary fibrosis.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2014-05-22T16:58:19Z No. of bitstreams: 1 Bruno Solano de Freitas Souza Terapia... 2012.pdf: 11192595 bytes, checksum: bbf17ad75e0d20605c6fd2274da72034 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-05-22T16:58:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bruno Solano de Freitas Souza Terapia... 2012.pdf: 11192595 bytes, checksum: bbf17ad75e0d20605c6fd2274da72034 (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / Introdução e objetivos: A insuficiência hepática aguda (IHA), apesar de rara, permanece como uma condição rapidamente progressiva e frequentemente fatal. A intoxicação por acetaminofen (APAP) induz necrose hepática maciça e frequentemente leva à morte por edema cerebral. Terapias celulares são de grande interesse como potenciais tratamentos para IHA. Neste projeto foi avaliado o potencial terapêutico das células mononucleares da medula óssea (CMMO) em um modelo experimental de IHA induzida por APAP em camundongos. Métodos: A IHA foi induzida em camundongos C57Bl/6, previamente submetidos à dieta alcoólica por três semanas, através da administração de APAP na dose de 300 mg/kg por via intraperitoneal. Após a indução da IHA, os camundongos foram transplantados, por via endovenosa, com 107 CMMO obtidas de doadores transgênicos para a proteína verde fluorescente (GFP) ou injetados com salina. As curvas de sobrevivência, os níveis plasmáticos de aminotransferases, amônia, uréia e creatinina, a extensão da necrose hepática, o infiltrado inflamatório e a expressão de citocinas e metaloproteinases foram avaliados. A microscopia confocal foi utilizada para estudar a migração das células transplantadas para o fígado. A permeabilidade da barreira hemato-encefálica foi avaliada pela injeção do corante azul de Evans (AE) por via endovenosa. Resultados: Observou-se que os camundongos tratados com CMMO apresentaram uma redução significativa da mortalidade, com uma taxa de 60% de sobrevivência quando comparados a 20% de sobrevivência do grupo controle. As células transplantadas migraram para o fígado, mas não foi observada a diferenciação destas em células hepáticas ou fusão celular. Não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas na extensão de necrose hepática no fígado, nos níveis plasmáticos de transaminases e amônia, na intensidade do infiltrado inflamatório no fígado entre os dois grupos com IHA, bem como nos níveis hepáticos das citocinas TNF-a e IL-10 e de transcritos para adrenomedula e endotelina 1 no cérebro, assim como na atividade da metaloproteinase 9 no soro. No entanto, observou-se uma redução dos níveis séricos de TNF-a no grupo tratado com CMMO quando comparado ao grupo injetado com salina. Esta redução está correlacionada ao aumento do mRNA para IL-10 na medula óssea e no baço dos animais tratados com CMMO. A avaliação do extravasamento do corante azul de Evans para o cérebro demonstrou que o grupo tratado com células mononucleares da medula óssea apresentou uma redução da permeabilidade da barreira hemato-encefálica quando comparado ao grupo injetado com salina. Conclusão: As CMMO exercem um efeito protetor em camundongos com IHA induzida por APAP, sem alterar o dano hepático, provavelmente através da modulação da resposta inflamatória sistêmica e da diminuição da permeabilidade da barreira hemato-encefálica. / Introduction and objectives: Acute liver failure (IHA), although rare, remains a rapidly progressive and often fatal condition. Poisoning by acetaminophen (APAP) induces a massive hepatic necrosis and often leads to death by cerebral edema. Cell therapies are of great interest as potential treatments for IHA. In this project we evaluated the therapeutic potential of bone marrow mononuclear cells (BMC) in an experimental model of IHA induced by APAP in mice. Methods: The IHA was induced in C57BL/6 mice previously submitted to the alcohol diet for three weeks by the administration of APAP at a dose of 300 mg / kg, intraperitoneally. After induction of IHA, the mice were transplanted intravenously with 107 BMC obtained from donors transgenic for green fluorescent protein (GFP) or injected with saline. The survival curves, plasma levels of aminotransferases, ammonia, urea and creatinine, the extent of hepatic necrosis, inflammatory infiltrate and the expression of cytokines and metalloproteinases were evaluated. Confocal microscopy was used to study the migration of transplanted cells to the liver. The permeability of the blood-brain barrier was assessed by injection of Evans blue dye (AE) intravenously. Results: We found that mice treated with BMC showed a significant reduction in mortality, with a rate of 60% survival compared to 20% survival in the control group. The transplanted cells migrated to the liver, but we did not observe the differentiation of these cells or fusion with liver cells. There were no statistically significant differences in the extent of hepatic necrosis in the liver, plasma levels of transaminases and ammonia, and in the intensity of the inflammatory infiltrate in the liver between the two groups with IHA, as well as in hepatic levels of TNF-α and IL-10, transcripts for endothelin 1 and adrenomedullin in the brain and serum metalloproteinase 9 activity. However, there was a reduction of serum TNF-α in BMC-treated group compared to the group injected with saline. This decrease correlated with the increase in IL-10 mRNA expression in the bone marrow and spleen of BMC-treated mice. The assessment of Evans blue extravasation into the brain showed that the group treated with BMC had a reduced permeability of the blood-brain barrier compared to the group injected with saline. Conclusion: Bone marrow mononuclear cells exert a protective effect in mice with APAPinduced IHA, without changing the liver injury, probably through modulation of systemic inflammatory response and decrease the permeability of the blood-brain barrier.

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-10-15T17:46:51Z No. of bitstreams: 1 amanda_b_r_b_macedo_ioc_bcm_0038_2011.pdf: 6569786 bytes, checksum: 14dd4b1254c99bb75e49af1ca06a9072 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-10-15T17:46:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 amanda_b_r_b_macedo_ioc_bcm_0038_2011.pdf: 6569786 bytes, checksum: 14dd4b1254c99bb75e49af1ca06a9072 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / As Leishmanioses são doenças causadas por diferentes espécies de protozoários do gênero Leishmania, que afetam indivíduos em aproximadamente 88 países. Atualmente, a medida de controle da doença mais aceita é o desenvolvimento de uma vacina profilática; porém, para que uma vacina efetiva seja alcançada, torna-se necessário a compreensão dos fatores que regulam e participam na proteção durante e após a infecção natural. São comuns trabalhos em que a resposta imune do tipo Th1 é medida exclusivamente pela produção in vitro de IFN-γ, porém a avaliação de um só parâmetro nem sempre é suficiente para predizer proteção. O presente trabalho visou estudar a qualidade de resposta Th1 induzida por diferentes antígenos de Leishmania em pacientes com a forma cutânea de leishmaniose tegumentar americana (LTA) provenientes do RJ. Utilizando-se ensaios de citometria de fluxo multiparamétrica para marcadores de superfície, e para as citocinas IL-2, TNF-α e IFN-γ, bem como ELISA para IFN-γ, foram feitas comparações da resposta induzida pelos extratos totais de promastigotas de fase estacionária de L. (V.) braziliensis (LbT) e L. (L.) amazonensis (PH8T), assim como frações enriquecidas em componentes subcelulares de L. (L.) amazonensis, em células mononucleares de sangue periférico de pacientes com LTA, antes e 140 dias após o tratamento, e indivíduos controles sadios. A análise das subpopulações de linfócitos T por citometria de fluxo não identificou alterações significativas nos percentuais de células CD8 +, CD4+ e CD25+ induzidas pelos diferentes estímulos, dentro de um mesmo grupo, nem entre os grupos de pacientes e controles. A avaliação individual da MFI integrada (frequência de células produtoras de uma citocina multiplicada pela intensidade média de fluorescência) para cada citocina estudada, não evidenciou nenhuma diferença marcante na resposta imune do tipo Th1 induzida pelos diferentes estímulos; porém, através da avaliação da contribuição dos fenótipos CD4+ produtores de 3, 2 ou 1 única citocina na resposta imune do tipo Th1 total, observamos diferenças qualitativas bem distintas entre as respostas obtidas antes e após o tratamento, e entre os antígenos estudados. Todos os estímulos apresentaram aumento da porporção de células multifuncionais nos pacientes PT, em relação aos AT. Após o tratamento, LbT foi o estímulo que induziu maior proporção de células multifuncionais (produtoras de IL-2, TNF-α e IFN-γ, simultaneamente; 28%), seguido da fração de membrana de L. (L.) amazonensis (PH8M; 23%), enquanto que, PH8T induziu a menor proporção de células multifuncionais (10%), e a maior proporção de células simples produtoras de IFN-γ (38%). Corroborando alguns outros relatos da literatura, observamos que as células multifuncionais são as que possuem a maior intensidade média de fluorescência para as 3 citocinas estudadas. A avaliação quantitativa da produção de IFN-γ por ELISA, demonstrou que LbT foi o estímulo que induziu significativamente a maior produção desta citocina, em comparação aos demais estímulos, tanto antes como após o tratamento. Este último resultado parece se correlacionar com os dados de citometria já mencionados, em que este mesmo estímulo foi capaz de induzir o maior percentual de células T multifuncionais, células essas com a capacidade de produzir uma quantidade maior de citocinas, do que os outros fenótipos estudados, como evidenciado nos resultados de MFI. Nossos resultados levam a discussão sobre a importância da avaliação da qualidade de uma resposta imune do tipo Th1 medida por mais de um parâmetro, a nível de uma única célula, e sugerem que a avaliação das células multifuncionais é importante para correlacionar com a cura da doença. / Leishmaniasis is a group of disease caused by different species of protozoan parasites from the genus Leishmania, that affects 88 countries around the world. Currently, the most accepted approach to control the disease is a prophylactic vaccine. However, to develop such a vaccine, it becomes necessary to understand the factors that regulate and participate in the healing process as well as protection during and after natural infection. It is well established that Th1-immune response is important for the protection against intracellular parasites. Many studies evaluate this response only by the in vitro IFN-γ production, but the evaluation of this single parameter not always is sufficient to predict protection. The present work assessed the quality of the Th1-immune response induced by different Leishmania antigens in patients affected with the cutaneous form of American Tegumentary Leishmaniasis (ATL) from Rio de Janeiro, Brazil. Using multiparametric flow cytometry to access surface markers and cytokines, such as IL-2, TNF-α and IFN-γ, as well as ELISA to measure IFN-γ in culture supernatants, we evaluated the immune responses induced by total antigens of stationary phase promastigotes of L. (V.) braziliensis (LbT) and L. (L.) amazonensis (PH8T), as well as subcellular components, composed of enriched fractions of L. (L.) amazonensis promastigotes, in peripheral blood mononuclear cells of ATL patients, before and 140 days after antimonial therapy, and healthy controls. Analysis of the T lymphocytes subpopulations by flow cytometry did not show significant variations in the percentage of CD4+, CD8+ and CD25+ cells induced by all different stimuli within the same group, or among the three studied groups. The individual evaluation of integrated MFI (frequency x MFI) for each cytokine assessed did not show any marked difference in the Th1-immune response induced by the different stimuli; however, by assessing the contribution of the CD4+ phenotypes producing 3, 2, or a single cytokine in the total Th1-immune response, we were able to identify very interesting differences. In the group of patients analyzed after treatment, LbT induced the highest proportion of multifunctional CD4+ T cells (producing IL-2, TNF-α and IFN-γ, simultaneously; 28%), followed by the membrane fraction of L. (L.) amazonensis (PH8M; 23%), whereas PH8T induced the lowest proportion of multifunctional CD4+ T cells (10%) and the highest proportion of single positive-cells for IFN-γ (38%). Corroborating previously published data, our results also showed that multifunctional CD4+T cells are those with the highest mean fluorescence intensity for the three cytokines studied. The quantitative evaluation of IFN-γ by ELISA showed that LbT significantly induced the higher production of this cytokine, in comparison to the other stimuli, both before and after treatment. This last result appears to show a relationship with our flow cytometry data, in which the same antigen was able to induce the highest percentage of multifunctional T cells, coincidently the cells that produced the larger amounts of cytokines, in comparison to the other CD4+ T cells phenotypes, as observed by the MFI values. Our results support the actual discussion about the importance of evaluating not only the quantity, but also the quality of a Th1-immune response by more than one parameter at a single-cell level, and indicate the importance of studying multifunctional CD4+ T cells in the cure of of ATL lesions.