Submitted by Alessandra Portugal (alessandradf@ioc.fiocruz.br) on 2013-10-01T21:57:04Z No. of bitstreams: 1 Fernanda Costa da Cruz Pontes.pdf: 1095030 bytes, checksum: d7cce2afc2521795c55879b83c1206a7 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-10-01T21:57:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fernanda Costa da Cruz Pontes.pdf: 1095030 bytes, checksum: d7cce2afc2521795c55879b83c1206a7 (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Atualmente, a hipertensão arterial constitui uma doença cardiovascular de altíssima prevalência. A hiperatividade do sistema nervoso simpático é considerada como uma importante característica fisiopatológica da hipertensão arterial. Portanto, sua modulação farmacológica pode ser considerada como um alvo terapêutico estratégico. No entanto, a avaliação da atividade simpática sistêmica em pacientes é ainda bastante controversa. O objetivo principal do presente estudo foi avaliar a existência de uma possível relação entre a expressão da enzima tirosina hidroxilase(TH) em leucócitos periféricos e a concentração plasmática de catecolaminas. Os experimentos foram realizados em ratos Wistar Kyoto (WKY-VEI) e ratos espontaneamente hipertensos (SHR). Os animais foram tratados por gavagem com losartan (SHR-LOS, 10 mg/kg/dia), clonidina (SHR-CLO, 0,1 mg/kg/dia) ou veículo (SHR-VEI) durante 28 dias. A pressão arterial sistólica (PAS) e a leucometria foram avaliadas antes e após o tratamento. Ao final do tratamento, os animais foram eutanasiados e foi feita a coleta de sangue, bulbo raquidiano e glândulas supra-renais para análises posteriores. A expressão da TH foi avaliada através da técnica de western blotting. A PAS estava elevada nos ratos SHR-VEI antes e após o tratamento com veículo, em comparação com o grupo WKY-VEI. Já nos grupos SHR-LOS e SHR-CLO, o tratamento farmacológico foi capaz de reduzir a PAS para níveis semelhantes àqueles encontrados em animais normotensos. Não foram observadas diferenças significativas na leucometria entre os diferentes grupos experimentais. As concentrações de adrenalina plasmática estavam aumentadas no grupo SHR-VEI, mas não foram reduzidas de maneira significativa por nenhum dos tratamentos farmacológicos. Já a noradrenalina, também elevada no grupo SHRVEI, foi marcadamente reduzida pelos tratamentos utilizados. A expressão da TH se encontrava elevada nos animais do grupo SHR-VEI em todos os tecidos estudados, tendo sido também reduzida significativamente após o tratamento SHR-CLO em todos os tecidos. No grupo SHR-LOS não houve redução significativa da expressão de TH em nenhum tecido. Nossos achados sugerem que os leucócitos periféricos são diretamente influenciados pela hiperatividade simpática sistêmica presente neste modelo experimental. Tais resultados podem abrir novos caminhos para o desenvolvimento de um novo método de análise da hiperatividade simpática em pacientes, o que seria de grande valia não só para o tratamento da hipertensão arterial como também para outras condições patológicas que apresentam esta hiperatividade como característica. / Currently, hypertension is a cardiovascular disease with high prevalence. The hyperactivity of the sympathetic system is shown to be present and important for the development of this disease and its modulation become a therapeutic target, although there are no clinic accurate measures of sympathetic activity. The aim of this study was to evaluate the possible relationship between the expression of the tyrosine hydroxylase enzyme from peripheral leukocytes and plasma catecholamine’s concentration. We conduct experiments in Wistar Kyoto (WKY-VEI) and spontaneously hypertensive rats (SHR). The animals were treated by gavage with losartan (SHR-LOS), clonidine (CLO-SHR) or vehicle (SHR-VEI) for 28 days. Systolic blood pressure (SBP) and white blood cell count was conducted before and after the treatment. At the end of treatment period, animals´ blood was collected and plasma was separated for the measurement of catecholamines, and peripheral leukocytes were separated to analyze the expression of the key enzyme in the metabolism of catecholamines (tyrosine hydroxylase - TH) by Western blotting. The animals were sacrificed and were collected for the same analysis the medulla oblongata and the adrenal gland. SBP was higher in SHR-VEI before and after treatment compared with the WKY-VEI. In groups SHR-LOS and SHR-CLO pharmacological treatment was able to reduce SBP. In leukocytes counting there was no statistical difference in either group before or after the treatment. The plasma adrenaline was increased in SHR-VEI and there was no significantly reduce in the other groups. Norepinephrine, also elevated in SHR-VEI, was markedly reduced by the treatments. The expression of TH was higher in SHR-VEI in all tissues studied and was also significantly reduced after treatment in SHR-CLO in leukocytes, medulla and adrenal gland. There was no reduction of TH expression in SHR-LOS. Based in our findings, we can conclude that the expression of TH in leukocytes is directly influenced by systemic sympathetic hyperactivity present in this experimental model of hypertension. These results may open the door to the development of a new method of analysis of sympathetic hyperactivity in human, which would be of great value not only for the treatment of hypertension as well as other pathological conditions that have this hyperactivity characterized.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2013-10-15T16:35:40Z No. of bitstreams: 1 Bianca_Petitinga_de_Paiva. Produção e avaliação...2011.pdf: 1434436 bytes, checksum: f5c3b8722c06f5784b6ec44bc9937084 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-10-15T16:35:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bianca_Petitinga_de_Paiva. Produção e avaliação...2011.pdf: 1434436 bytes, checksum: f5c3b8722c06f5784b6ec44bc9937084 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / A maioria dos cães com leishmaniose visceral submetida à quimioterapia convencional apresenta recaída após a interrupção do tratamento, talvez, pelo fato desses animais desenvolverem resposta imune celular específica apenas transitoriamente. Uma vez que as citocinas IL-7 e IL-15 são descritas na literatura como sendo capazes de promover resposta imune celular de longa duração (memória), o presente trabalho teve como objetivo a clonagem, a expressão e a avaliação da atividade biológica de IL7 e IL-15 recombinantes caninas (rca-IL-7 e rcaIL-15). Diversos estudos têm demonstrado o papel essencial da IL-7 e IL-15 na homeostase de células-T. A Interleucina-7 é um fator de crescimento e anti-apoptótico de linfócitos T, sendo essencial para a sobrevida de células T maduras, naïve e células de memória, especialmente CD4+. IL-15 apresenta um amplo espectro de atividades biológicas. É crucial para o desenvolvimento, proliferação, sobrevivência e diferenciação de múltiplas células tanto da imunidade inata, quanto da imunidade adaptativa, e apresenta papel essencial na manutenção de células T CD8+ de memória. Nesse trabalho descreveu-se a clonagem do DNA complementar (cDNA) e a expressão de IL-7 e IL-15 recombinantes caninas biologicamente ativas em Escherichia coli. Para expressão em E. coli foram realizadas as clonagens do cDNA de IL-7 e de IL-15 no vetor pRSET, gerando as construções pRSET-caIL-7 e pRSET-caIL-15. O sucesso da clonagem em ambos os vetores de expressão foi confirmado a partir do sequenciamento. As proteínas foram expressas como proteína de fusão com seis moléculas de histidina na extremidade amina da cadeia polipeptídica e após serem solubilizadas com uréia, as proteínas foram purificadas por cromatografia de afinidade e renaturadas por diálise. A avaliação da atividade biológica de IL-15 canina purificada foi realizada em células CTLL-2 e foi demonstrada uma relação dose dependente na faixa de concentração proteica de 0,9 ng/mL até 1 µg/mL. O mesmo efeito foi demonstrado quando essas células foram cultivadas na presença de diferentes diluições de T-STIM (controle positivo do ensaio). Visando determinar as condições em que rca-IL-7 e rca-IL-15 são capazes de induzir efeitos biológicos in vitro, foram realizados experimentos com diferentes doses de ambas as citocinas e demonstrado pela primeira vez que tanto IL-7 quanto IL-15 são capazes de induzir a proliferação de CMNSP de cães pré-ativadas com PHA. Adicionalmente, as citocinas foram avaliadas quanto à capacidade de estimulação da proliferação de CMNSP de cães sem estímulo prévio ou concomitante e foi possível observar que rca-IL-7 foi capaz de manter a proliferação dessas células por até 12 dias de cultivo, enquanto rca-IL-15 foi capaz de fazê-lo por até 14 dias. Diante dos resultados obtidos a rca-IL-7 e rca-IL-15 poderão ser utilizadas no futuro em estudos que visam o estabelecimento de uma resposta de longa duração em cães com LVC submetidos à quimioterapia convencional. / Most dogs with LV subjected to conventional chemotherapy has relapsed after discontinuation of treatment, possibly due these animals develop specific cellular immune response transiently. Since IL-7 and IL-15 are described in the literature asbeing capable of promoting cellular immune response of long-term (memory), this study aimed at cloning, expression and biological activity evaluation of rca-IL7 and rca IL-15. Many studies have demonstrated the essential role of IL-7 and IL- 15 in the homeostasis of T-cells. The Interleukin-7 is a growth and anti-apoptotic factor of T lymphocytes, essential for the occurrence of mature, naive, and memory T cells, especially CD4+. IL-15 presents a wide spectrum of biological activities. It is crucial for the development, proliferation, survival, and differentiation of multiple cells of innate immunity as well as of adaptive immunity, and presents an essential role in the maintenance of CD8+ memory T cells. This work describes the cloning of complementary DNA (cDNA) and the expression of IL-7 and IL-15 canine recombinants biologically active in Escherichia coli. For expression in E. coli, we cloned cDNA of IL-7 and IL- 15 in the vector pRSET, generating the constructions pRSET-caIL7 and pRSETcaIL- 15. The success of the cloning in both the expression vectors was confirmed from the sequencing. The proteins were expressed as fusion protein with six molecules of histidine in the amine extremity of the polypeptide chain and afterwards were solubilized with urea, the proteins were purified by affinity chromatography and renatured by dialysis. The evaluation of the biological activity of purified canine IL-15 was achieved in CTLL-2 cells and a dose-dependent relation in the range of protein concentration of 0.9 ng/mL to 1 ƒÊg/mL was demonstrated. The same effect was demonstrated when these cells were cultivated in the presence of different dilutions of T-STIM (positive control of the test). With the goal of determining the conditions in which rca-IL-7 and rca-IL-15 are capable of inducing biological effects in vitro, we carried out experiments with different doses with both the cytokines and demonstrated for the first time that IL-7 as well as IL- 15 are capable of inducing proliferation of PBMC of dogs pre-activated with PHA. Also, the cytokines were evaluated as to the capacity of stimulation of the proliferation of PBMC of dogs without previous or concomitant stimulation and it was possible to observe that rca-IL-7 was capable of maintaining the proliferation of these cells for up to 12 days of cultivation, while rca-IL-15 was capable of doing it for 14 days. Considering the results obtained rca-rca-7 and IL-IL-15 may be used in future studies that aim to establish a long-termresponse in dogs with CVL undergoing conventional chemotherapy

Submitted by Ramon Santana (ramon.souza@ufpe.br) on 2015-03-13T17:44:10Z No. of bitstreams: 2 Texto_tese_Rodrigo_Fragoso_versão_digital_biblioteca corrigida.pdf: 2561062 bytes, checksum: 512f9f146843721fb04486a63feec23b (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-13T17:44:10Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Texto_tese_Rodrigo_Fragoso_versão_digital_biblioteca corrigida.pdf: 2561062 bytes, checksum: 512f9f146843721fb04486a63feec23b (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2013-03-07 / O estudo teve como objetivo avaliar a utilização do biopolímero da cana-de-açúcar como guia na reparação de lesão completa do nervo periférico, além de verificar o efeito do Ultrassom Terapêutico (US) e das Células Mononucleares da Medula Óssea (CMMO), associados ou não, neste mesmo processo. Um total de 45 ratos machos, albinos, Wistar, adultos foram utilizados, formando os grupos: (1) Grupo Controle (GC), (2) lesão + tubo de Polietileno (Grupo Polietileno - GP), (3) lesão + tubo de Biopolímero (Grupo Biopolímero - GB); para as demais investigações os seguintes grupos foram utilizados: (4) lesão + CMMO(-)/US(-); (5) lesão + CMMO(-)/US(+); (6) lesão + CMMO(+)/US(-) e (7) lesão + CMMO(+)/US(+). Aos 60 dias de vida, os animais foram submetidos a neurotomia do ciático e reparo com a técnica de tubulização, mantendo uma distância de 4mm entre os cotos neurais. O protocolo do ultrassom terapêutico pulsado consistiu nos seguintes parâmetros: frequência de emissão: 1MHz, frequência de pulsação 100Hz, ciclo de trabalho 20%, 2ms de duração de pulso, intensidade de 0.5w/cm2, com aplicação direta através de gel aquoso, 5 min/dia, durante 12 dias consecutivos. No grupo placebo o ultrassom foi utilizado com o equipamento desligado. Já, para a utilização da terapia celular, a medula óssea foi aspirada de fêmures e tíbias de ratos, a fração mononuclear separada e ajustada para um volume de 5x106 células/20μL de Matrigel e meio de cultura. 90 dias após a neurotomia, o material presente no interior dos tubos foi coletado, processado, emblocado em resina, para a obtenção dos cortes transversais semi-finos. Avaliou-se: quantidade total de fibras mielínicas e de vasos sanguíneos, área de secção transversa do tecido nervoso neoformado, densidade de fibras mielínicas, diâmetro das fibras mielínicas e do axônio, espessura da bainha de mielina e razão g. Os dados foram expressos em média ± desvio-padrão. Foram utilizados os seguintes testes estatísticos: Teste- T Student (análise entre dois grupos) e ANOVA one-way post hoc Tukey (análise de três grupos), com p<0.05. Nos resultados observou-se que o tubo de biopolímero foi adequado para favorecer a regeneração no nervo ciático lesionado, apresentando resultados mais expressivos (p<0.05) em relação ao número de vasos, diâmetro axonal e na razão g. A aplicação do ultrassom promoveu aumento no número de vasos sanguíneos, no diâmetro de fibras mielínicas e no diâmetro axonal, na espessura da bainha de mielina e razão g (em ambos, p<0.05) nos animais estimulados. Por fim, a associação das CMMO/US demonstrou potencialização da regeneração nervosa, uma vez que nestes animais foram encontrados maior número de fibras mielínicas (p<0.01), de vasos sanguíneos (p<0.05) e maior espessura da mielina (p<0.01), em relação aos animais não tratados com as ondas sonoras. Diante dos resultados obtidos neste estudo: (1) o biopolímero da cana-de-açúcar pode ser considerado um material viável para a confecção de tubos guia na reparação de lesões totais do nervo periférico; (2) o ultrassom terapêutico é um recurso físico capaz de estimular a regeneração do nervo periférico; (3) a associação entre o ultrassom terapêutico e as células mononucleares da medula óssea potencializa a resposta regenerativa do nervo periférico, pelo menos, no que se refere às suas características estruturais.

A inflamação associada à obesidade é caracterizada por uma ativação crônica e de baixa intensidade do sistema imune. Diversos autores demonstraram mudanças em parâmetros inflamatórios após perda de peso. A cirurgia bariátrica é um método para tratar obesidade com alta eficiência e menor risco de recidiva. Os mononucleares de sangue periférico (MNSP) constituem um material biológico interessante para pesquisa, visto a capacidade de refletir alterações de expressão gênica de diferentes tecidos e o fácil acesso para análise. O presente estudo teve por objetivo avaliar os efeitos da obesidade e da perda de peso induzida por cirurgia bariátrica sobre a atividade imunológica, por meio de cultura primária de MNSP de pacientes com obesidade grau III (IMC >= 40 kg/m2). Foram coletadas amostras de sangue de veia periférica de 10 voluntários com peso normal (grupo controle) e antes e após a cirurgia de 20 voluntários com obesidade grau III. Após a separação dos mononucleares pelo gradiente de Ficoll-HyPaque, as células foram estimuladas por lipopolissacarídeo (LPS) ou concanavalina A (Con-A) e os sobrenadantes das culturas coletados para dosagem de IL-1?, IL-6, TNF-?, IFN-?, IL-10 e IL-17 por teste ELISA. As amostras de sangue também foram utilizadas para exames bioquímicos, dosagens de adiponectina, leptina e citocinas séricas. Os resultados evidenciaram maiores concentrações de IL-6, TNF-?, IL-1? e IL-10 nos sobrenadantes das culturas de MNSP do grupo com obesidade em relação ao grupo controle. Na comparação entre dosagens de citocinas do grupo com obesidade, observamos redução de TNF-?, IL-1? e IL-10 após 6 meses da cirurgia, a qual não foi observada após 1 ano, e aumento de IL-17 após 1 ano de tratamento. Não houve diferença significativa nas concentrações de citocinas séricas na comparação entre os grupos com obesidade e controle ou pré e pós-operatório. Observamos correlações das citocinas de sobrenadante das culturas de MNSP e séricas com resultados laboratoriais relacionados à homeostase glicêmica em pacientes com obesidade antes e após a cirurgia bariátrica, além da correlação entre citocinas do sobrenadante e o estado de adiposidade no pós-operatório. Concluímos que a obesidade grau III está associada a modificações da produção de citocinas por MNSP e a perda de peso induzida por cirurgia bariátrica influencia esta produção no primeiro ano de tratamento. / The obesity-associated inflammation is characterized by a chronic and low intensity activation of the immune system. Several authors have shown changes in inflammatory parameters after weight loss. Bariatric surgery is a method for treating obesity with high efficiency and less risk of recurrence. Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) are an interesting biological material for research, due to the ability to reflect changes in gene expression in different tissues and easy access to analysis. This study aimed to evaluate the effects of obesity and weight loss induced by bariatric surgery on immune activity through PBMC culture of morbidly obese patients (BMI >= 40 kg/m2). Peripheral vein blood samples were collected from 10 volunteers with normal weight (control group) and before and after the surgery in 20 volunteers with morbid obesity. After separation of the mononuclear cells by Ficoll-Hypaque gradient centrifugation, cells were stimulated with lipopolysaccharide (LPS) and concanavalin A (Con-A) and culture supernatants collected for IL-1?, IL-6, TNF-?, IFN-?, IL-10 and IL-17 dosage by ELISA. Blood samples were also used for biochemical examinations and adiponectin, leptin and serum cytokine dosage. The results showed higher concentrations of IL-6, TNF-?, IL-1? and IL-10 in the supernatants of the MNSP cultures of the obesity group in relation to the control group. In the comparison between cytokine dosages of the obesity group, we observed reduction of TNF-?, IL-1? and IL-10 after 6 months of surgery, which was not observed after 1 year, and IL-17 increased after 1 year of treatment. There was no significant difference in serum cytokine concentrations in the comparison between obesity and control groups or operated group. We observed correlations of cytokines obtained in PBMC culture supernatant and serum with laboratory results related to glucose homeostasis in patients with obesity before and after bariatric surgery, as well as correlation between cytokines of the supernatant and the state of adiposity postoperatively. We conclude that morbid obesity is associated with changes in cytokine production by PMNC and weight loss induced by bariatric surgery influences cytokine production in the first year of treatment.

Esta pesquisa avaliou o efeito da transferência passiva dos leucócitos do colostro na imunidade específica de bezerras recém-nascidas. Foram acompanhadas 20 bezerras Holandesas durante o período neonatal, distribuídas em dois grupos experimentais: grupo COL+ recebeu colostro fresco (4L) proveniente de suas respectivas mães; e grupo COL- recebeu colostro congelado e acelular (4L), oriundo de vacas doadoras de colostro. As avaliações foram realizadas antes da mamada do colostro (M0), 1-2 (M1), 7 (M2), 14 (M3), 21 (M4) e 28 dias pós-nascimento (M5). As bezerras foram submetidas ao exame clínico, seguido da colheita das amostras sanguíneas para realização de hemograma, imunofenotipagem e cultivo celular. Os dois grupos foram colostrados com colostro de igual qualidade com relação à concentração de imunoglobulinas (70-120 g/L). A concentração de células do colostro fresco fornecido ao grupo COL+ foi de 1.895.849 células/mL. Não foi possível encontrar diferenças para as funções vitais em relação aos grupos experimentais. O exame específico dos sistemas revelou um caso de broncopneumonia, três de inflamação umbilical e maior frequência de escore de fezes 3 no COL-. As alterações clínicas foram refletidas no eritrograma das bezerras, sendo encontrado menor valor médio para a taxa de hemoglobina (HGB) no COL- em M3. Em relação à idade, observou-se redução gradativa dos valores médios para He (hemácias), HGB, HCT (hematócrito) e índices hematimétricos no primeiro mês de vida. A frequência de bezerras anêmicas foi maior no grupo COL- nos momentos M4 e M5. Em relação ao leucograma, observou-se diferença entre os grupos para linfócitos no M0 e M2 com valores superiores no COL-. Em relação aos momentos foi possível detectar leucocitose por neutrofilia no M0 e M1, observando-se inversão da relação neutrófilo:linfócito a partir desses momentos. Os valores de CD45+CD45RO- foram maiores em M0 no COL-, além disso, observou-se aumento da expressão do marcador de memória celular CD45RO+ do M0 ao M1 nos dois grupos experimentais. O CD3+gamma-delta- aumentou no decorrer do estudo, em contrapartida as células CD3+gamma-delta+ foram menores em M5 com relação ao M0-M3. Foi detectado também aumento dos valores de CD14+MHCII+ no primeiro mês de vida indicando maturação das células apresentadoras de antígeno. Em relação à produção de citocinas pelas células mononucleares sanguíneas, foi possível identificar maior concentração de IFN-gamma em M4, quando as células do COL- foram estimuladas com S. aureus (1 mononuclear:10 bactérias inativadas). A concentração de IL-17 detectada a partir das células do COL+ foi maior em M3, quando as células foram estimuladas com ConA. Com base nos resultados obtidos, pode-se concluir que: a) bezerras COL- apresentaram maior frequência e intensidade de doenças que evoluíram para anemia da inflamação; b) bezerras COL- apresentaram maior número absoluto de linfócitos, representadas especialmente pela subpopulação CD3+gamma-delta+ nos episódios de maior frequência de diarreias; c) Linfócitos de memória CD45RO+ aumentaram após a colostragem em ambos os grupos, sugerindo que outros componentes acelulares do colostro podem apresentar papel fundamental no desenvolvimento da resposta imunológica de bezerras recém-nascidas; d) a subpopulação CD3+gamma-delta- e as células CD14+MHCII- e CD14+MHCII+ aumentaram durante o primeiro mês de vida, indicando maturação imunológica; e) as células mononucleares das bezerras não responderam ao Herpesvírus Bovino tipo 1, porém responderam aos estímulos bacterianos, especialmente para a Escherichia coli; a interpretação do leucograma em conjunto com a análise das variações apresentadas para as citocinas inflamatórias IFN-gamma e IL-17 permitem afirmar que as bezerras apresentaram resposta inflamatória retardada e de menor magnitude no COL-. / This study evaluated the effect of leukocytes passive transference from bovine colostrum in specific immunity of newborn calves. During neonatal period, 20 Holstein calves were followed. Animals were distributed in two experimental groups: COL+ which received fresh colostrum (4L) from their mothers, and COL- which received frozen and acellular colostrum (4L) that came from donor cows. The evaluations were performed in the following moments: before colostrum intake (M0), 1-2 (M1), 7 (M2), 14 (M3), 21 (M4) and 28 days after birth (M5). Heifers were submitted to clinical examination. Then, blood samples were harvested for hemogram, immunophenotyping and cell culture. Both groups were fed with the same quality of colostrum (immunoglobulin concentration 70-120 g/L). The cell concentration of fresh colostrum that was provided to COL+ group was 1.895.849 cells/mL. It was not possible to detect differences in vital functions concerning the experimental groups. The system specific examination reveled one case of bronchopneumonia, three cases of umbilical inflammation and major rates of diarrhea score 3 in group COL-. Clinical alterations were reflected in calves erythrogram. It was found lower mean value for hemoglobin (HGB) in M3 for COL-. Regarding age, a gradual reduction in mean values for erythrocytes, HGB, HCT (hematocrit) and hematimetric rates were observed in the first month of life. The frequency of anemic heifers was higher in COL- group at moments M4 and M5. Regarding leukogram, it was observed difference between groups for lymphocytes in M0 and M2 with higher values in COL-. Concerning moments, it was possible to detect leukocytosis by neutrophilia from M0 up to M1 and inversion of neutrophil:lymphocyte relation from this moment. Values of CD45+CD45RO- was higher in M0 for COL-, furthermore, increase of cellular memory marker expression CD45RO+ was observed from M0 to M1 in both groups. The CD3+gamma-delta- increased during the study. On the other hand, CD3+gamma-delta+ were lower in M5 in relation to M0-M3. Increase of CD14+MHCII+ values were also detected in the first month of life, indicating maturation of antigen presenting cells. Regarding cytokine production by mononuclear cells of heifers blood, it was possible to identify higher concentration of IFN-gamma in M4 when cells of COL- were stimulated with S. aureus (1 mononuclear: 10 inactivated bacteria). The concentration of IL-17 detected from COL+ cells was higher in M3, when cells were stimulated with ConA. Based on these results, it can be concluded that: a) COL- heifers presented higher frequency and intensity of diseases that evolved to anemia of inflammation; b) COL- heifers presented higher lymphocyte absolute number, represented specially by CD3+gamma-delta+ subsets in episodes of higher frequency of diarrhea; c) memory lymphocytes CD45RO+ increased after colostrum intake in both groups, suggesting that other acellular colostrum components can present fundamental role in development of immunological response in newborn heifers; d) the subset of CD3+gamma-delta- and the cells CD14+MHCII- and CD14+MHCII+ increased during the first month of life, indicating immunological maturation; e) heifers mononuclear cells did not respond for herpes virus bovine type 1, however, responded for bacterial stimulus, specially Escherichia coli. The interpretation of leukogram with the variation of presented analyses for inflammatory cytokines IFN-gamma and IL-17, allow to state that heifers presented delayed inflammatory response and of lesser magnitude in COL-.

A necessidade de tratamentos mais eficazes e menos invasivos para os pacientes, em adição à capacidade de diferenciação celular da medula óssea sugere que o transplante de células mononucleares totais poderia ser uma das melhores formas de tratamento para as diversas patologias existentes. Entretanto, vários fatores implicam sobre a viabilidade das células da medula óssea dos quais destacamos a ausência de padronização de protocolo de criopreservação que permita a manutenção da viabilidade celular, sendo altamente necessário o desenvolvimento de estudos nesta área. Deste modo, neste estudo, após a anestesia de um grupo de animais foi realizada punção da medula óssea, separação das células mononucleares e avaliação da viabilidade. Foram testados oito meios diferentes para criopreservação das células. O meio de congelamento A é composto por 20% dimetilsulfóxido (DMSO), 40% Dulbecco´s Modified Eagle´s Médium (DMEM) e 40% de Plasma Autólogo, o meio de congelamento B contém 20% dimetilsulfóxido (DMSO), 40% Roswell Park Memorial Institute (RPMI) e 40% de Plasma Autólogo, o meio de congelamento C tem em sua composição 20% dimetilsulfóxido (DMSO), 40% soro fetal bovino (SFB) e 40% plasma autólogo, o meio de congelamento D é composto de 20% dimetilsulfóxido (DMSO) e 80% de plasma autólogo, o meio E constitui-se de 5% dimetilsulfóxido (DMSO), 47,5% de Dulbecco\'s Modified Eagle\'s Médium (DMEM) e 47,5% de plasma autólogo, o meio F contém 5% dimetilsulfóxido (DMSO), 47,5% de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) e 47,5% de plasma autólogo, o meio G contém 5% dimetilsulfóxido (DMSO), 47,5% de soro fetal bovino (SFB) e 47,5% de plasma autólogo e o meio H constitui-se de 5% dimetilsulfóxido (DMSO) e 95% de plasma autólogo. Após as análises realizadas pela técnica de citometria de fluxo, o meio mais eficiente na criopreservação das células mononucleares de suínos foi o protocolo D por possuir maior concentração de plasma autólogo e crioprotetor. / The necessity of the most efficient and less invasive treatments for the patients, in addition to the capacity of cellular differentiation of the bone marrow suggests that the transplant of mononuclear total cells might be one of the best treatment for several pathologies. Meantime, several factors influence on the viability of the cells of the bone marrow as the absence of standardization of criopreservação protocol which could allow the maintenance of the cellular viability, being an important issue of investigation. In this study, after the anaesthesia of a group of animals, samples of bone marrow were collected, following the separation of the mononuclear cells and evaluation of the viability. Eight different protocols were tested for cells criopreservation. The protocol A by 20% dimetilsulfóxido (DMSO), 40% Dulbecco\'s Modified Eagle\'s Médium (DMEM) and 40% autologus plasma, B protocol conatained 20% dimetilsulfóxido (DMSO), 40% Roswell Park Memorial Institute (RPMI) and 40% autologus plasma, the C protocol was composed 20 % dimetilsulfóxido (DMSO), 40% bovine fetal serum (SFB) e 40% autologus plasma, D protocol was made using 20% dimetilsulfóxido (DMSO) and 80% autologus plasma, E protocol was constituted by 5% dimetilsulfóxido (DMSO), 47,5% de Dulbecco\'s Modified Eagle\'s Médium (DMEM) and 47,5% autólogo plasma, the F contains 5% dimetilsulfóxido (DMSO), 47,5% de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) and 47,5% autologo plasma, the protocol G was compoed by 5% dimetilsulfóxido (DMSO), 47,5% de bovine feta serum (SFB) and 47,5% autologus plasma and the H protocol was 5% dimetilsulfóxido (DMSO) and 95% autologus plasma. After flux citometer analyses, the most efficient protocol in criopreservation of the mononuclear cells of pigs was the protocol D which was composed the by the most amount of autologus plasma and crioprotectant.

Orientador: Joyce Maria Annichino Bizzacchi / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-21T17:55:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bassora_FernandaDutraSantiago_D.pdf: 2667928 bytes, checksum: 612538a2c5c4e4e33577d2303de3a9c1 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A trombose venosa é definida como a oclusão de um vaso do sistema venoso. Três fatores básicos para a formação de um trombo no interior dos vasos são: alteração do fluxo sangüíneo, da parede vascular e/ou dos elementos sangüíneos. A trombose venosa e a embolia pulmonar, que ocorre como uma complicação subseqüente representa uma causa importante de morbidade e mortalidade em pacientes hospitalizados. A freqüência da trombose venosa foi estimada em aproximadamente 1/1000 na população em geral. Na maior parte dos casos existe uma tendência para trombose determinada pela presença de um fator causal herdado ou adquirida, ou pela interação desses fatores, bem como por variações genéticas que determinam alterações nos níveis das proteínas pró-coagulantes e anticoagulantes. Dados da literatura têm sugerido a associação de mecanismos inflamatórios com a fisiopatologia da trombose venosa profunda (TVP). Os monócitos, estimulados por citocinas ou endotoxinas, expressam fator tecidual, o maior indutor da coagulação sangüínea, e que também tem a função de sinalização para a mobilidade celular e vascular. Os leucócitos apresentam receptores capazes de ligar e ativar o fator X da coagulação, servindo como via alternativa para a formação de trombina. As plaquetas podem aderir ao endotélio intacto e através da liberação de mediadores e citocinas como interleucina (IL)-1 e Fator de necrose tumoral-a (TNF-a), induzindo a expressão de moléculas de adesão e fator tecidual pela célula endotelial. Com base nestes dados e considerando que a migração leucocitária é um dos principais eventos que caracterizam o processo inflamatório, justificamos a escolha de células mononucleares (monócitos e linfócitos) como células centrais do nosso estudo. Utilizando técnicas de separação de células mononucleares por centrifugação em gradiente de "Ficoll-Hypaque", extração do Ácido ribonucléico (RNA) total, hibridação em Ácido desoxiribonucléico complementar (cDNA) -Microarray, e validação usando a reação em cadeia da polimerase em tempo real quantitativo (qRT-PCR) avaliamos do perfil de expressão gênica de alguns mediadores inflamatórios nessas células e a possível relação com a trombose venosa. Neste trabalho, usando a tecnologia de Microarray encontramos 60 induzidos e 56 genes reprimidos diferencialmente expressos nos pacientes com TVP, estes genes que estavam relacionados à resposta imune, inflamação, proteólise e transcrição. Destes genes diferencialmente expressos, selecionamos nove relacionados com inflamação para validação usando a técnica de qRT-PCR. Destes, somente houve aumento de expressão do gene da caspase 4 (CASP4) nos pacientes com TVP, sendo que, esta diferença se manteve no subgrupo com TVP espontâneo. Neste mesmo subgrupo, também foi verificado o aumento da expressão no gene Elong factor 1, alpha 2(EEF1A2) / Abstract: Venous thrombosis is defined as a vessel occlusion of the venous system. Three basic factors for the formation of a thrombus inside the vessel are: changes in blood flow, vascular wall and / or blood elements. Venous thrombosis and pulmonary embolism, which occurs as a subsequent complication is a major cause of morbidity and mortality in hospitalized patients. The frequency of venous thrombosis was estimated to be approximately 1 / 1000 in the general population. In most cases there is a tendency for thrombosis determined by the presence of a causal factor inherited or acquired, or by the interaction of these factors, as well as genetic variations that determine changes in protein levels of procoagulants and anticoagulants. Literature data have suggested the association of inflammatory mechanisms in the pathophysiology of deep venous thrombosis (DVT). Monocytes, stimulated by cytokines or endotoxin, express tissue factor, the greater inducer of blood coagulation, and also have the function of signaling for cell motility and vascular. Leukocytes have receptors that can bind and activate coagulation factor X, serving as an alternative route for the formation of thrombin. Platelets can adhere to intact endothelium and through the release of mediators and cytokines such as interleukin (IL)-1 and Tumor necrosis factor-a (TNF-a), inducing expression of adhesion molecules and tissue factor by endothelial cells. Based on these data and considering that leukocyte migration is one of the main events that characterize the inflammatory process, we justify the choice of mononuclear cells (monocytes and lymphocytes) as the central cells of our study. Using techniques of separation of mononuclear cells by gradient centrifugation "Ficoll-Hypaque," extraction of total RNA, cDNA-Microarray hybridization, and validation using real time qPCR assessed the gene expression profile of some inflammatory mediators in these cells and the possible relationship with venous thrombosis. In this work using Microarray technology we found 60 genes upregulated and 56 downrelated differentially expressed in patients with DVT. Genes that were related to immune response, inflammation, proteolysis and transcription. Of these differentially expressed genes, we selected nine genes that were related with inflammation to validation using qRT- PCR technique. Just one of then, the caspase 4 (CASP4) genes was differentially increased in DVT patients, this increase kept in patients with spontaneous DVT and an increased of Elong factor 1, alpha 2 (EEF1A2) gene too / Doutorado / Ciencias Biomedicas / Doutora em Ciências Médicas

Nesta dissertação, apresentamos dois estudos por ressonância paramagnética eletrônica (RPE) de complexos de cobre. O primeiro estudo contempla os complexos mononucleares de cobre e seu objetivo é analisar a simetria de coordenação dos sítios paramagnéticos. Os espectros de RPE obtidos em banda X na temperatura de 50K para as amostras de membranas e bio-membranas dopadas com Cu(ClO4)2 indicam a presença do íon Cu2+ em sítios de simetria axial. Com a análise dos espectros experimentais, obtivemos os parâmetros do Hamiltoniano de spin e através do modelo empírico de Peisach-Blumberg foi possível observarmos que, para a maioria das amostras analisadas, a complexação equatorial do íon Cu2+ ocorre com átomos de nitrogênio e oxigênio. O segundo estudo contempla os complexos dinucleares de cobre e seu objetivo é analisar as interações dipolar e de troca. Os espectros obtidos em banda Q em temperatura ambiente (300K) para o complexo dinuclear [Cu2(Sant)4 (H2O)2] 2.5H2O em sua forma monocristalina indicaram a presença do íon Cu2+ em sítios de simetria axial com duas unidades dinucleares magneticamente não equivalentes por célula unitária na amostra. Com a análise da variação angular das linhas de ressonância foi possível obtermos os parâmetros do Hamiltoniano de Spin e estimarmos a constante de acoplamento de troca como sendo J0 <&asymp;>324 cm1. / This dissertation presents two electron paramagnetic resonance (EPR) studies on copper complexes. The first study focused mononuclear copper complexes and its objective is to analyze the symmetry of coordination of the paramagnetic sites. The 50K X-band EPR spectra obtained for membranes and bio-membranes doped with Cu(ClO4)2 indicates the presence of the Cu2+ ion in axially distorted sites. Through the analysis of the experimental spectra the spin Hamiltonian parameters are obtained and using the Peisach-Blumberg empirical model its possible to notice that the equatorial complexation of the Cu2+ ion occurs with both nitrogen and oxigen for most of the samples. The second study focused dinuclear copper complexes and its objective is to analyze both dipolar and exchange interactions. The room temperature Q-band EPR spectra obtained for the monocrystalline form of the dinuclear complex [Cu2(sant)4 (H2O)2] 2.5H2O indicates the presence of the Cu2+ ion in axially distorted sites with two non-equivalent dimeric units per unit cell of the sample. With the analisys of the angular variation of the resonant lines we are able to obtain the spin Hamiltonian parameters and estimate the exchange coupling constant J0 &asymp; 324 cm1.

As doenças cardiovasculares continuam sendo a primeira causa de morte no Brasil (32%) representando a terceira maior causa de internação hospitalar. Apesar dos avanços terapêuticos das últimas décadas, estudos epidemiológicos consideram o infarto agudo do miocárdio (AMI) uma das maiores causas de morbidade e mortalidade, sendo a maioria, ligados a realização de terapias não adequadas, dos quais 50% das mortes ocorrem nas primeiras 2 horas do ocorrido e 14% morrem antes de receber atendimento médico. O objetivo deste estudo foi de avaliar a técnica de infusão transpericárdica de células mononucleares de medula óssea (CMMO) em suínos. Três suínos fêmeas, pesando 25Kg foram induzidas ao AMI, com auxilio de cateter balão colocado no 1° ramo diagonal da artéria coronária interventricular por 45 minutos, seguido por infusão de 1x108 CMMO marcadas com Hoechst® pela via transpericárdica. O grupo controle foi composto por 3 animais, os quais receberam infusão de 1x108 CMMO marcadas com Hoechst® através da mesma técnica. Os resultados revelaram distribuição homogênea das CMMO no miocárdio, concentrando-se especialmente na área infartada, enquanto que o grupo controle apresentou distribuição homogênea ao longo do miocárdio. Nós concluímos que a técnica transpericárdica é viável para infusão de CMMO em processos de isquemia cardíaca. / Cardiovascular illnesses continue to be the first cause of death in Brazil (32%), representing the third major reason of hospital internment. Although the therapeutics advances in the last decades, epidemiologic studies considered the acute myocardium infarct (AMI) to be one of the most causes of morbidity and mortality (30%), most of, related to the institution of non-adequate therapy, thereby 50% of deaths in the early two hours of the event and 14% dying before any medical assistance. Currently therapies include stent angioplasty, Thrombolytic medication and aortic-coronary venous grafting; while in experimental area the cellular therapy has been largely investigated being the cells infusion technique investigation the most enthusiastic issue. This study aimed to evaluate the transepicardic infusion technique of bone marrow mononuclear cells (BMMC) in swine. Three female swine, averaging 25 kg, were induced to AMI, with the aid of a balloon catheter displaced on the first interventricular diagonal branch of the coronary artery for 45 minutes, following to the infusion of 1x108 BMMC stained with Hoescht® by the transepicardic technique. Sham operation was carried out in three animals (Control group), which received infusion of 1x108 BMMC stained with Hoescht® by the same technique. The results revealed an inhomogeneous distribution of the BMMC in the myocardium, being more concentrated in the infarcted area, while the control group presented a homogeneous distribution along the myocardium. We concluded the transpericardic technique would be acceptable to the infusion of BMMC in cardiac ischemic processes.

Moléculas HLA-DR e co-estimulatórias tem papel central na função imune de leucócitos. Diferentes emulsões lipídicas (EL) podem alterar funções imunes de leucócitos. Para avaliar os efeitos de diferentes EL sobre a expressão de moléculas HLA-DR, CD80 e CD86 presentes na superfície de monócitos/macrófagos (MO/M?) e CD28 e CD152 presentes na superfície de linfócitos T auxiliares (L? CD4) humanos, células mononucleares do sangue periférico de voluntários saudáveis (n=10) foram separadas com uso de Ficoll Hypaque (d=1,007) e incubadas por 48 horas (MO/M?) e 72 horas (L?) em meio RPMI 1640 acrescidas ou não (controle negativo) de diferentes EL comerciais ou misturas experimentais na concentração de 1mg/mL. De acordo com o tipo da emulsão lipídica adicionada ao meio de cultura, as células foram divididas em seis grupos experimentais: a) Controle negativo - células mononucleares cultivadas sem o acréscimo de EL b) TCLn-6 - células mononucleares cultivadas com EL a base de óleo de soja rica em ácidos graxos poliinsaturados tipo n-6 (AGPI n-6), c) TCLn-6/TCLn-3 - células mononucleares cultivadas com mistura experimental contendo 80% da EL a base de óleo de soja e 20% de EL a base de óleo de peixe rica em AGPI tipo n-3, d) TCM/TCLn6 - células mononucleares cultivadas com EL composta por 50% óleo de coco, rico em triglicérides de cadeia média e 50% de óleo de soja, e) TCM/TCLn-3 - células mononucleares cultivadas com mistura experimental contendo 80% de EL composta por 50% óleo de coco e 50% de óleo de soja e 20% de EL a base de óleo de peixe, f) SMOF - células mononucleares cultivadas com a nova EL contendo 30% de óleo de soja, 30% de triglicérides de cadeia média, 25% de óleo de oliva e 15% de óleo de peixe. As células mononucleares foram ativadas pelo uso de 10?g/mL de fitohemaglutinina. A expressão das moléculas de superfície foi analisada por citometria de fluxo. A porcentagem de fluorescência, que indica o número de células expressando as moléculas em estudo e a intensidade de fluorescência, que indica de forma indireta o número de moléculas expressas por células, foram medidas. Os resultados obtidos foram submetidos à teste estatístico Friedman e pós-teste Student-Newman-Keuls, adotando-se nível de significância de p<0,05. Devido às diferenças na expressão basal dos doadores, os resultados de intensidade de fluorescência foram transformados em porcentagem relativa ao controle basal (Basal=100). Nos grupos TCLn-6, TCLn-6/TCLn-3, TCM/TCLn-6, TCM/TCLn-3 e SMOF, a intensidade de fluorescência de moléculas HLA-DR expressas na superfície de monócitos/macrófagos diminuiu (medianas = 87,6; 84,0; 81,0; 85,0 e 80,0 respectivamente) em relação ao controle negativo (CN) (mediana=100,0) p=0,01. Todos os grupos tratados com EL aumentaram o número de linfócitos T auxiliares expressando moléculas CD28 (medianas = 90,9; 90,4; 91,5; 92,6 e 90,1 respectivamente) em relação ao CN (mediana=82,8) p=0,001 e também o número de moléculas CD152 expressas por células na superfície de linfócitos T auxiliares (medianas = 120,6; 108,8; 127,7; 114,6 e 121,3 respectivamente) em relação ao CN (mediana=100,0), p=0,03. Não foram encontradas diferenças estatísticas na expressão de moléculas CD80 e CD86 na superfície de monócitos/macrófagos cultivados com diferentes EL. Ainda não foram encontradas diferenças no número de linfócitos T auxiliares expressando CD152. Finalmente a expressão por células de moléculas CD28 na superfície de linfócitos T auxiliares também não mostrou alteração significante com as diferentes emulsões lipídicas. Conclusão: Emulsões lipídicas parenterais in vitro, diminuem a expressão de moléculas HLA-DR na superfície de monócitos/macrófagos e aumentam a expressão de moléculas CD28 e CD152 na superfície de linfócitos T auxiliares humanos. Estas alterações podem ser um dos mecanismos pelos quais as EL modulam funções de células imunes / HLA-DR and co-stimulatory molecules play a central role on leucocytes immune function. Different lipid emulsions (LE) may change leucocytes immune function. It is of interest to study the effect of different LE on HLA-DR and costimulatory molecules expression. To access the effect of LE on the HLA-DR, CD80 and CD86 expression on monocytes/macrophages (MO/MØ) surface and CD28 and CD152 (CD80/CD86 co-stimulatory molecules receptor) expression on human T helper lymphocytes (LØ CD4) surface we obtained mononuclear cells from peripheral blood of healthy volunteers (n=10) by using ficoll hypaque (d=1.077). The cells were cultured for 48 hours (MOMØ) and 72 hours (LØ CD4) and incubated with RPMI 1640 medium without (negative control) or added with 1mg/mL of commercial or experimental mixtures of five LE. Groups: a) NC - negative control without LE, b) LCTn-6 - n-6 polyunsaturated fatty acids (PUFA) rich LE ( soybean oil), c) LCTFO - 80% of LCT and 20% of n-3 PUFA rich LE (FO) (fish oil), d) MCT/LCT - LE containing 50% of medium chain triglycerides and 50% of n-6 PUFA rich LE, e) MCT/LCTFO - 80% of MCT/LCT LE and 20% of FO LE and f) SMOF - a new LE containing 30% of soybean oil, 30% of medium chain triglycerides, 25% of olive oil and 15% of fish oil. Mononuclear cells were activated by using 10?g/mL of phytohemagglutinin. Surface molecules expression was measured by flow cytometry. Percentage and intensity of fluorescence were recorded and the data were submitted to Friedman statistical test and Student-Newman-Keuls post test (p<0,05). Due the differences in basal expression between donors, prior to statistical tests, data from intensity of fluorescence were transformed of percentage relative of basal expression (where basal=100). All LE groups LCT, LCTFO, MCT/LCT, MCT/LCTFO and SMOF decreased HLA-DR intensity of fluorescence on monocytes/macrophages (mean= 87.6, 84.0, 81.0, 85.0, and 80.0 respectively) in relation to negative control (NC) (mean=100.0) cultured without LE (p=0,01). All LE groups increased the percentage of lymphocytes expressing CD28 (means=90.9, 90.4, 91.5, 92.6 and 90.1 respectively) in relation to control (mean=82.8) p=0,001 and CD152 intensity of fluorescence on lymphocytes cultured with all different LE (mean=120,6; 108,8; 127,7; 114,6 and 121,3 respectively) in relation to NC (mean=100,0), p=0,03. No significant differences were found on CD80 and CD86 expression on monocytes/macrophages surface, CD28 intensity of fluorescence and the percentage of lymphocytes expressing CD152 on lymphocytes cultured with the different studied LE. Conclusion: In vitro parenteral LE decreased HLA-DR expression on human monocytes/macrophages surface and increase co-stimulatory molecules receptor expression on human lymphocytes surface. These changes could be one of the mechanisms of LE modulation of immune cells functions