L’adénocarcinome canalaire pancréatique (ADKP) est l’une des tumeurs solides avec le pronostic le plus sombre. Le stroma de ces tumeurs, très abondant, est composé de matrice extra cellulaire ainsi que de cellules stromales (incluant des fibroblastes activés associés au cancer ou des cellules immunitaires). Les fibres nerveuses infiltrant ce stroma tumoral sont considérées comme une caractéristique des ADKP, impliquées dans le phénomène de remodelage nerveux, qui participent aux douleurs neuropathiques, à la dissémination des cellules tumorales, ainsi qu’à la rechute de la maladie après chirurgie. Le remodelage nerveux associé aux ADKP est régulé par un réseau fonctionnel, impliquant des interactions physiques et moléculaires entre cellules tumorales, cellules nerveuses dont les cellules de Schwann et les autres cellules stromales. Dans cette étude, nous avons démontré que les cellules de Schwann (cellules gliales, soutient des neurones périphériques) stimulent l’agressivité (migration, invasion, tumorigénicité) des cellules pancréatiques tumorales de façon dépendante du TGFβ (Transforming Growth Factor beta). En effet, nous révélons que le milieu conditionné des cellules de Schwann est enrichi en nombreuses molécules de signalisation, incluant de grandes quantités de TGFβ capable d’activer sa voie de signalisation dépendante des protéines SMAD, au sein des cellules cancéreuses. Des analyses de spectrométrie de masse des sécrétomes des cellules de Schwann et des cellules tumorales pancréatiques, cultivées seules ou ensemble, soulignent le rôle central du TGFβ dans les interactions neuro-épithéliales, comme illustré par la signature protéomique relative aux mécanismes d’adhésion et de motilité cellulaires. Ainsi, ces résultats démontrent que les cellules de Schwann sont une source de TGFβ dans les ADKP, et jouent un rôle crucial dans l’acquisition de propriétés agressives par les cellules tumorales / Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is one of the solid tumors with the poorest prognosis. The stroma of this tumor is abundant and composed of extracellular matrix and stromal cells (including cancer-associated fibroblasts and immune cells). Nerve fibers invading this stroma represent a hallmark of PDAC, involved in neural remodeling, which participates in neuropathic pain, cancer cells dissemination and tumor relapse after surgery. Pancreatic cancer-associated neural remodeling is regulated through functional interplays mediated by physical and molecular interactions between cancer cells, nerve cells and surrounding Schwann cells, and other stromal cells. In the present study, we show that Schwann cells (glial cells supporting peripheral neurons) can enhance aggressiveness (migration, invasion, tumorigenicity) of pancreatic cancer cells in a transforming growth factor beta (TGFβ)-dependent manner. Indeed, we reveal that conditioned medium from Schwann cells contains various signaling cues, including high amounts of TGFβ able to activate the TGFβ-SMAD signaling pathway in cancer cells. Secretome analyses by mass spectrometry of Schwann cells and pancreatic cancer cells cultured alone or in combination highlighted the central role of TGFβ in neuro-epithelial interactions, as illustrated by proteomic signatures related to cell adhesion and motility. Altogether, these results demonstrate that Schwann cells are a meaningful source of TGFβ in PDAC, which plays a crucial role in the acquisition of aggressive properties by pancreatic cancer cells

La thèse concerne l'étude des déformations cellulaires à travers 2 approches complémentaires, expérimentale et théorique. motivées par la mise en évidence lors de travaux antérieurs, de l'existence d'une certaine auto-organisation des schémas des déformations membranaires pour des cellules arrondies. Nous avons choisi de nous intéresser ici au cas de fibroblastes L929 qui présentent une organisation plus complexe du cytosquelette. La caractérisation expérimentale a été réalisée à partir de séquences d'images vidéomicroscopiques. Les données morphodynamiques des cellules ont été extraites des séquences par 2 méthodes : (i) une segmentation des contours et (ii) une méthode de flot optique. Les résultats montrent que les cellules présentent le plus souvent des morphologies symétriques caractérisées dynamiquement par un mouvement pulsant synchronisé et périodique. Sur le plan théorique, nous nous sommes intéressés à un modèle cytomécanique des déformations décrivant la dynamique de poly/dépolymérisation de l'actine en relation avec les interactions mécaniques entre la membrane et le cytosquelette. Les simulations montrent la capacité du modèle à générer qualitativement des états pulsants tels qu'observés. Deux extensions du modèle ont alors été proposées pour prendre en compte : (i) l'interaction cellule-cellule caractérisée par l'inhibition de l'activité protrusive et (ii) la migration cellulaire par chimiotaxie, en agissant dans les 2 cas sur les propriétés mécaniques de la membrane et du cortex. Des comportements cellulaires réalistes ont ainsi pu être simulés. Finalement, une nouvelle formulation du modèle initial a été proposée pour modéliser les longs prolongements membranaires des fibroblastes. Le travail réalisé permet en particulier de proposer la possibilité d'utiliser les paramètres morphodynamiques comme critères d'identification des phénotypes cellulaires.

Les organismes vivants, qu'ils soient simples ou complexes, ont acquis des stratégies pour s'adapter aux changements environnementaux. Ces changements correspondent à un large éventail de signaux chimiques, physiques ou mécaniques qui doivent être transmis en messages intracellulaires. Dans la cellule, des réseaux de signalisation sont modulés avec une grande précision pour transmettre ces messages et générer une réponse cellulaire appropriée. Les protéines d'échafaudage jouent un rôle crucial dans la sélectivité et la modulation spatio-temporelle de la transduction du signal. Par divers mécanismes moléculaires, elles médient l’organisation de complexes multimoléculaires impliqués dans plusieurs processus biologiques. CNK est une protéine d'échafaudage découverte par le biais d’études génétiques chez la drosophile où elle agit comme modulateur positif de la signalisation RAS/MAPK. Cependant, les fonctions physiologiques des homologues de CNK de mammifères (CNK1, CNK2 et CNK3) et leurs contributions aux pathologies humaines sont mal caractérisées. De plus, il existe peu d’évidences rapportant leur implication dans la signalisation RAS/MAPK. Elles ont plutôt été associées à des voies de signalisation contrôlées par les guanosine triphosphatases (GTPases) des familles ARF et RHO. Dans un premier manuscrit, nous avons montré que CNK2 est requise pour la migration et l'invasion des cellules cancéreuses en couplant le récepteur tyrosine kinase (RTK) prométastatique AXL à l'activation de la GTPase ARF6. D'un point de vue mécanistique, la signalisation induite par AXL favorise le recrutement de CNK2 à la membrane plasmique de manière dépendante de PI3K. Ensuite, CNK2 promeut l’activation d’ARF6 via son interaction aux ARF Guanosine exchange factors (GEFs) cytohésines et à la protéine adaptatrice SAMD12. Nous démontrons également qu’ARF6 coordonne l'activité des GTPases RAC1 et RHOA. Enfin, l'ablation génétique de CNK2 ou SAMD12 réduit considérablement les lésions métastatiques hépatiques et pulmonaires dans un modèle de xénogreffe de souris. Dans une série d’expériences de BioID supplémentaires utilisant le mutant gain-de-fonction ARF6 Q67L, nous avons identifié PLD1 et ITGB1 comme candidats potentiels pouvant médier la signalisation RAC1 et RHOA en aval d’ARF6. Dans une autre série d’expériences, nous avons caractérisé l'interaction entre les CNKs et la sous-famille des kinases Misshapen (MSN). Les trois membres de cette sous-famille, MAP4K4, TNIK et MINK1, ont été identifiés comme principaux interacteurs proximaux de CNK2A et CNK3 dans les expériences de BioID. Toutefois, leur interaction ne semble pas être impliquée dans la fonction promigratoire de CNK2A. Par des expériences de cartographie, nous démontrons que les domaines CRIC et DUF1170 de CNK2/3 et la région coiled-coil de MAP4K4 sont importants pour leur interaction. Nos travaux suggèrent également que SAMD10 compétitionne avec MAP4K4 pour se lier à CNK2 et que SAMD10/12 modulent la stabilité de CNK2. Enfin, nos résultats préliminaires suggèrent que MAP4K4 induit la phosphorylation de CNK2/3. Cependant, la pertinence biologique de ces évènements reste à déterminer. Dans l'ensemble, nos travaux révèlent une fonction inattendue de CNK2 dans la régulation de la motilité des cellules cancéreuses et identifient une nouvelle voie de signalisation qui pourrait être ciblée pour limiter les métastases. En outre, nos travaux identifient plusieurs pistes pour approfondir le rôle de CNK dans les cellules de mammifères. / All living organisms, whether simple or complex, have acquired sophisticated strategies to adapt to their changing environment. These environmental changes correspond to a breadth of chemical and mechanical signals that need to be transmitted into intracellular information. In cells, dense signalling networks are put into place and modulated with great precision to transmit messages and generate appropriate cellular responses. Scaffolding proteins play a crucial role in the selectivity and spatiotemporal modulation of signal transduction. Through various molecular mechanisms, they mediate the organization of multimolecular complexes implicated in various biological processes. CNK is a scaffolding protein discovered through genetic studies in drosophila where it acts as an important positive regulator of the highly oncogenic RAS/MAPK pathway. In contrast, the physiological functions of human CNKs and their roles in human diseases are poorly characterized. Moreover, evidence supporting their requirement for RAS/MAPK signalling remains sparse. Rather, they have been linked to signalling pathways controlled by the ARF and RAS homologous (RHO) subfamilies of GTPases. In a first manuscript, we found that mammalian CNK2 promotes cancer cell migration and invasion by coupling the pro-metastatic RTK AXL to downstream activation of ARF6 GTPase. Mechanistically, we showed that AXL signalling induces PI3K-dependent recruitment of CNK2 to the plasma membrane where it stimulates ARF6 via its interaction with the cytohesin ARF GEFs and the adaptor protein SAMD12. We also showed that ARF6 coordinates RAC1 and RHOA GTPase activity. Finally, the genetic ablation of CNK2 or SAMD12 potently reduces liver and lung metastatic lesions in a mouse xenograft model. In a series of supplemental BioID experiments using the gain-of-function ARF6 Q67L mutant, we identified PLD1 and ITGB1 as potential candidates that could mediate RAC1 and RHOA signalling downstream of ARF6. In another study, we characterized the interaction between CNKs and the MSN subfamily of kinases. The three members of this subfamily, namely MAP4K4, TNIK and MINK1, were identified as top proximal interactors of CNK2A and CNK3 in the BioID experiments. However, their interaction does not appear to be involved in the pro-migratory function of CNK2A. Through mapping experiments, we found that the CRIC and DUF1170 domains of CNK2 and CNK3 and the coiled-coil region of MAPK4K4 are important for their interaction. In addition, we found that SAMD10 competes with MAP4K4 for binding to CNK2 and that SAMD10/12 proteins also modulate CNK2 stability. Finally, our preliminary results suggest that MAP4K4 induces CNK2/3 phosphorylation. However, the biological relevance of these interactions and phosphorylation events remains to be addressed. Overall, our work uncovers an unanticipated function of CNK2 in regulating cancer cell motility and identifies a novel signalling pathway that could be targeted to restrain metastasis. Moreover, it identifies several avenues for further study into CNK function in mammalian cells.

La motilité cellulaire est fondamentale dans de nombreux processus physiologiques, qu’ils soient normaux ou pathologiques. Cependant, bien que ces derniers impliquent la plupart du temps de nombreuses cellules se mouvant en même temps, les effets des interactions entre cellules sur leur dynamique, à la fois individuelle et collective, restent assez mal connu. Dans cette thèse, j’ai utilisé Dictyostelium discoideum à l’état végétatif pour étudier cette régulation collective de la motilité. Je me suis principalement appuyé sur une analyse minutieuse de nombreuses trajectoires cellulaires dans des situations variées pour (i) caractériser un facteur sécrété qui régule négativement la motilité cellulaire (nature chimique, voie de signalisation, dynamique de sécrétion et de réponse) et (ii) analyser et modéliser quantitativement la dynamique d’étalement de colonie cellulaires de forme, dimension et densité contrôlées. Je décris enfin un phénomène d’agrégation dynamique observé lorsque les cellules sont placées à haute densité dans un milieu nutritif / Cell motility is fundamental in many physiological, either normal or pathological, phenomena. Yet, although these most often involve several cells moving at the same time, how the interactions between cells affect both individual and collective dynamics remains a poorly understood question. In this thesis, I used vegetative Dictyostelium discoideum cells as a model to study this collective regulation of the motility. I relied mainly on the thorough analysis of numerous cell trajectories in various situations to (i) characterise a secreted factor used to down-regulate the cells’ motility (biochemical nature, response pathway, secretion and response dynamics) and (ii) quantitatively analyse and model the dynamics of spreading cell colonies of controlled initial shape, size and density. Last, I describe a dynamic aggregation phenomenon that occurs when the cells are seeded at high density in a nutrient-rich medium

Le rampement est un mode de locomotion fondamental de nombreuses cellules eucaryotes, engagé dans des mécanismes aussi importants que embryogenèse, la réponse immunitaire et la cicatrisation. Son dérèglement provoque de graves maladies, en particulier des cancers. La compréhension mécanique de ce mode de locomotion présente également un grand intérêt pour la confection de robots opérant à l'échelle cellulaire. Le schéma classique du rampement cellulaire met en jeu la polymérisation du réseau d'actine dans la partie frontale de la cellule couplée avec l'activation des points d'adhésion focaux liant la cellule à son substrat, alors que la partie postérieure de la cellule se détache du substrat sous l'effet de la contraction engendrée par les molécules de myosine. De manière simplifiée, on peut voir la partie motrice d'une cellule eucaryote comme un gel actif dont les fonctions sont contrôlées par des processus chimiques et mécaniques. En particulier, les mouvements coordonnés de ce gel engendrant le rampement impliquent une auto organisation spatiale et temporelle du cytosquelette et demandent un apport continu d'énergie. Si les bases biochimiques de la motilité cellulaire sont connues, la compréhension qualitative des interactions mécaniques entre les différents acteurs rentrant en jeu dans le rampement n'est que très limitée, et ce malgré les récents efforts visant à construire des modèles complets et exhaustifs du phénomène. Cette thèse présente l'analyse d'un modèle simple et unidimensionnel expliquant le rampement cellulaire. La première partie de la thèse est dédiée à l'analyse inverse du problème d'optimisation en vitesse et en efficacité mécanique du rampement. Notre analyse montre que les distributions optimales de contraintes contractiles et de friction avec le substrat sont en bonnes accord avec les distributions observées. Dans une seconde partie, nous proposons un mécanisme de motilité cellulaire spontanée centré sur la contraction et ignorant la polymérisation et la dépolymérisation de l'actine. A l'origine de la polarisation, l'anti-diffusion auto amplifiée des moteurs pilotant la contraction déstabilise la configuration initialement symétrique de la cellule. L'apparition de cette instabilité morphologique est pilotée par le ratio entre la diffusion et la contractilité des moteurs générant un flot convergent qui, lui-même, transporte les moteurs. Par l'étude unidimensionnelle du phénomène, nous montrons que le flot ainsi produit peut générer un mouvement de translation de la cellule qui reproduit des observations concernant la motilité spontanée des fragments de keratocytes. La troisième partie de la thèse concerne la motilité cellulaire basée sur les propriétés de polymérisation et de dépolymérisation active de l'actine qui permettent non seulement l'autopropulsion de la cellule mais aussi le mécanisme de poussée (d'obstacles) et de tirée (de noyau cellulaire par exemple) de charges données . Nous utilisons un modèle minimaliste pour montrer que la relation force-vitesse dans le cas de la poussée est essentiellement réminiscente du mécanisme de protrusion piloté par la polymérisation alors que la relation force-vitesse du tirage d'une charge ne repose sur le mécanisme de protrusion que pour des charges faibles, le mécanisme de contraction prenant le relais pour des charges plus grandes.

Cette thèse a pour objectif l’étude d’un lien effectif potentiel entre la motilité cellulaire, la mécanique cellulaire, et l’activité biochimique de ces mêmes cellules. Ce couplage a été étudié dans divers systèmes biologiques, et aussi bien dans des cultures de cellules qu’à l’intérieur de tissus plus complexes. Notamment, nous avons particulièrement cherché à détecter un couplage électromécanique dans des neurones qui pourrait être impliqué dans la propagation du message nerveux.Pour ce faire, nous avons dû développer deux microscopes optiques à la sensibilité extrême. Ces microscopes se composent de deux parties principales. La première sert à détecter des mouvements axiaux plus petits que la longueur d’onde optique, soit en dessous de 100 nanomètres. La deuxième partie permet la détection d’un signal de fluorescence, offrant la possibilité de suivre l’évolution biochimique de la cellule. Avec ces deux microscopes multimodaux, il est donc possible de suivre de manière simultanée un contraste de motilité, un contraste mécanique, un contraste structurel et un contraste biochimique. Si l’un de ces systèmes est basé sur la tomographie de cohérence optique plein champ et permet de faire de telles mesures en 3-D et en profondeur dans les tissus biologiques, le second ne permet que des mesures dans des cultures de cellules, mais est bien plus robuste au bruit mécanique. Dans ce manuscrit, nous allons essentiellement décrire le développement de ces deux appareils, et préciser les contrastes auxquels ils sont sensibles spécifiquement.Nous développerons également deux des applications principales de ces microscopes que nous avons étudié dans le détail au cours de cette thèse. La première application développe l’intérêt d’un de nos microscopes pour la détection sans marquage des principaux composants cellulaires et structuraux de la cornée et de la rétine. La seconde application tend à détecter et à suivre des ondes électromécaniques dans des neurones de mammifères / This PhD project aims to explore the relationship that might exist between the dynamic motility and mechanical behavior of different biological systems and their biochemical activity. In particular,we were interested in detecting the electromechanical coupling that may happen in active neurons, and may assist in the propagation of the action potential. With this goal in mind, we have developed two highly sensitive optical microscopes that combine one modality that detects sub-wavelength axial displacements using optical phase imaging and another modality that uses a fluorescence path. Therefore, these multimodal microscopes can combine a motility, a mechanical,a structural and a biochemical contrast at the same time. One of this system is based ona multimodal combination of full-field optical coherence tomography (FF-OCT) and allows the observation of such contrast inside thick and scattering biological tissues. The other setup provides a higher displacement sensitivity, but is limited to measurements in cell cultures. In this manuscript, we mainly discuss the development of both systems and describe the various contrastst hey can reveal. Finally, we have largely used our systems to investigate diverse functions of the eye and to look for electromechanical waves in cell cultures. The thorough description of both biological applications is also provided in the manuscript