Phanerochaete chrysosporium est un champignon modèle étudié en particulier pour ses capacités ligninolytiques et son aptitude à dégrader un grand nombre de polymères aromatiques toxiques dérivés notamment des hydrocarbures polycycliques. Durant ces processus de dégradation, une multitude de composés hautement réactifs et toxiques pour les cellules vont dans un premier temps être générés puis dégradés ou excrétés hors de la cellule. Le séquençage complet du génome de P. chrysosporium a permis d'identifier plusieurs superfamilles d'enzymes impliquées dans les mécanismes de tolérance à ces composés toxiques. Parmi elles, les glutathion transférases sont présentes au sein de tous les règnes du vivant et constituent une superfamille multigénique jouant un rôle dans la protection cellulaire, le métabolisme secondaire et la détoxication. Cependant, en dépit de nombreuses études réalisées en particulier chez les vertébrés, le rôle joué par ces enzymes dans la détoxication des dérivés aromatiques toxiques est encore inconnu chez les basidiomycètes. L'analyse comparative des séquences de GST présentes au sein des différents règnes du vivant révèle que les GST fongiques ont évolué différemment de leurs orthologues, notamment via l'extension de sous-classes très peu représentées chez les vertébrés. Parmi elles, les GST à cystéine catalytique représentent 30 % de cette superfamille d'enzymes chez P. chrysosporium. Trois isoformes fongiques ainsi qu'une protéine orthologue exprimée chez une bactérie lignivore ont été caractérisées in vitro tant au niveau biochimique que structural. Ces enzymes sont impliquées dans la déglutathionylation d'une grande variété de molécules électrophiles potentiellement toxiques et issues notamment de la dégradation de polymères aromatiques halogénés. La recherche de substrats a permis d'identifier plusieurs classes fonctionnelles, néanmoins l'activité des quatre isoformes s'effectue via l'attaque directe du conjugué glutathionylé par la cystéine catalytique, qui est dans un deuxième temps régénérée par un réducteur. L'analyse comparée prouve également l'existence d'une nouvelle classe structurale et fonctionnelle appelée glutathionyl hydroquinone réductase absente chez les vertébrés. Ces protéines présentent un mode de dimérisation original ainsi que la capacité tout à fait particulière de déglutathionyler les quinones. Ces résultats suggèrent que les champignons ont développé des mécanismes de résistance en réponse à des contraintes environnementales, notamment via l'évolution de familles multigéniques telles que les GST à cystéine catalytique qui sont impliquées dans le métabolisme et la tolérance vis-à-vis d'une grande variété de composés d'origine exogène ou endogène / Phanerochaete chrysosporium is a model fungus well studied for its lignolytic properties towards wood compounds and various toxic aromatic derivatives such as polycyclic aromatic hydrocarbons. These degradation processes lead first to the formation of highly reactive and toxic compounds, which are then catabolized or excreted outside the cell. Genomic data allowed the identification of genes coding for superfamilies of enzymes putatively involved in these tolerance mechanisms. Among them, glutathione transferases are present in all kingdoms and constitute a multigenic superfamily of enzymes involved in cell protection and detoxification. However, although numerous studies have been performed on vertebrate enzymes, the role of these enzymes in the detoxication of toxic aromatic compounds is still unknown in basidiomycetes. The comparative analysis of GST sequences from various kingdoms of life reveals that fungal GSTs have evolved differently from their orthologs, in particular through the expansion of sub-classes poorly represented in vertebrates. Among them, GSTs with a catalytic cysteine represent 30% of this superfamily of enzymes in P. chrysosporium. Three Cys containing fungal isoforms have been characterized at the biochemical and structural levels, including an orthologue from lignolytic bacteria. All these enzymes are involved in deglutathionylation processes using a wide range of aromatic halogenated electrophilic compounds, including potentially toxic derivatives arising from the degradation of halogenated aromatic polymers. This GSTs family can be organized in various functional groups based on their substrate specificities, but still the catalytic process remains the same with the direct attack of the glutathionylated compound by the catalytic cysteine which is then reduced and regenerated. The comparative analysis of three isoforms revealed a new structural and functional class called glutathionyl hydroquinone reductase absent in vertebrates. These proteins exhibit a new mode of dimerization as well as the ability to deglutathionylate quinones. These results suggest that fungi have developed resistance mechanisms in response to environmental stresses, notably through the evolution of multigenic families such as catalytic cysteine bearing GSTs which are likely involved in the metabolism and tolerance towards a wide range of exogenous or endogenous compounds

Les Heat Shock Proteins 70 kDa (HSP70) sont considérées comme les membres les plus conservés de la superfamille des HSP. Ces protéines chaperonnes sont indispensables à tous les organismes vivants par leur implication dans de nombreuses voies de signalisation cellulaire et dans la gestion de multiples facteurs de stress environnementaux (température, pollution, salinité, radiation). Largement utilisée en écologie comme biomarqueur de stress, la famille des HSP70 constitue également une cible thérapeutique privilégiée dans les recherches contre les maladies neurodégénératives et les cancers. Dans le cytosol, une large variété de HSP70 a été observée chez quelques espèces modèles (drosophile, levure, humain). Néanmoins, cette diversité reste méconnue au sein du phylum Arthropoda, et plus particulièrement chez les décapodes. La diversité des HSP70 cytosoliques a été étudiée à partir de 735 séquences issues 198 espèces d’arthropodes, dont 142 séquences de décapodes obtenues durant ces travaux. Les analyses de phylogénie moléculaire ont permis la description d’au moins trois groupes distincts de HSP70 cytosoliques chez les arthropodes, comprenant chacun plusieurs subdivisions méconnues jusqu’à présent. Une nouvelle classification et un modèle évolutif des HSP70 cytosoliques sont proposés pour le phylum Arthropoda. Les profils d’expression observés dans ces groupes remettent en cause la catégorisation des HSP70 selon leurs caractère constitutif (HSC70) ou inductible (HSP70). Les spécificités structurales géniques et protéiques observées pour chacune de ces formes reflèteraient différentes capacités d’interaction des HSP70 avec leurs co-chaperons et autres cofacteurs. / The 70 kDa Heat Shock Proteins (HSP70) are considered the most conserved members of the HSP family. These molecular chaperones are primordial to living beings, because of their implications in many cellular pathways and the management of multiple environmental stress factors (e. g., temperature, pollutants, salinity, radiations). Widely used in ecology as a biomarker of environmental stress, the HSP70 family is also a privileged therapeutic target for neurodegenerative diseases and cancers. In the cytosol, a wide variety of HSP70 is observed in few model species (Drosophila, human, yeast). Nevertheless, the diversity of cytosolic HSP70 remains unclear amongst the Arthropoda phylum, especially within decapods. The diversity studies of cytosolic HSP70 were based on 735 sequences from 198 arthropod species, including 142 sequences from decapods obtained during this work. Molecular phylogeny analyses revealed at least three distinct groups of HSP70 within arthropods, comprising several unrecognised subdivisions. This study proposes a new classification and an evolutionary model of cytosolic HSP70 amongst the Arthropoda phylum. The expression profiles observed in each group lead to reconsider the HSP70 classification according to their constitutive (HSC70) or inducible (HSP70) features. The observed structural specificities of genes and proteins, relative to each form of HSP70, will probably have to be linked to distinct interactions with cochaperones or other co-factors.

Babesia canis est un hémoparasite du phylum des Apicomplexes transmis par la morsure de tique et responsable de la piroplasmose canine en Europe. Dans la perspective de développer un vaccin recombinant, nous avons réalisé deux études visant à mieux comprendre les interactions hôte/parasite au cours du cycle érythrocytaire. Nous avons étudié d'une part le rôle des antigènes parasitaires solubles (APS) dans le déclenchement des signes cliniques et d'autre part celui de l'antigène Bc28.2 codé par la famille multigénique Bc28 dans les mécanismes d'échappement à l'hôte.Les APS de B. canis induisent une réponse protectrice anti-maladie chez les chiens vaccinés. Toutefois, leur rôle exact dans la pathogénèse reste à définir. Contrairement à ce qui est décrit dans la pathogenèse à B. bovis, nos analyses réfutent l'hypothèse qu'ils pourraient agir sur le système kallicréine-kinine plasmatique. Par contre elles suggèrent, pour la première fois chez le genre Babesia, un rôle direct des APS dans le déclenchement précoce de la réponse inflammatoire observée au cours de la pathogenèse.De part leur fonction essentielle dans la survie parasitaire, les antigènes localisés à la surface de l'érythrocyte (rôle dans l'agglutination des hématies parasitées) ou des mérozoïtes (rôle dans l'invasion) sont de bons candidats vaccins. Cependant et probablement dans une perspective d'échappement à l'hôte, ils sont codés par des familles multigéniques. Chez B. canis, la famille multigénique Bc28 contient le gène Bc28.1 qui code pour un antigène à ancrage GPI préalablement caractérisé à la surface du mérozoïte. Nous montrons qu'un autre gène, désigné Bc28.2 (plusieurs copies dans le génome) contient 2 cadres de lecture chevauchant et serait capable d'exprimer des antigènes polymorphes de 28 kDa et 50 kDa par un mécanisme de recodage traductionnel +1. De façon originale, ces protéines seraient localisées non pas à la surface des mérozoïtes mais à la surface des hématies parasitées. / Babesia canis is an apicomplexan haemoparasite transmitted by tick bite and responsible of canine babesiosis in Europe. Understanding host/parasite relationships during the erythrocytic cycle is crucial for further development of a recombinant vaccine. In that way, the role of soluble parasite antigens (SPA) in the onset of clinical signs and the role of Bc28.2 antigen (encoded by the B. canis Bc28 multigene family) in host evading process were investigated.B. canis-derived SPA induce a protective anti-disease immunity in vaccinated dogs but their precise role during the pathogenesis remains unknown. In contrast to B. bovis, our analysis disproved the hypothesis that B. canis SPA could act on the plasma kallikrein-kinin system. However they strongly suggest, for the first time in the genus Babesia, a direct role of these SPA in the onset of the inflammatory response which is early observed during pathogenesis. Because of their essential function in the parasite survival, antigens located on the surface of infected erythrocyte (role in agglutination of erythrocytes) or on the surface of merozoites (role in the invasion) are good vaccine candidates.However, and probably for host evading, they are encoded by multigene families. In B. canis, the Bc28 multigene family contains the Bc28.1 gene that encodes for a GPI-anchored antigen previously characterized on the merozoite surface. We demonstrated here, that another gene designated Bc28.2, is multicopy and composed of two overlapping open reading frames (Orf1 and Orf2). It allows, though +1 programmed ribosomal frameshift, expression of polymorphic antigens of 28 kDa and 50 kDa. Unexpectedly, these proteins seem localized on the surface of parasitized erythrocytes, suggesting they play a crucial function in evading host through agglutination process of infected erythrocytes.

La dynamique co-évolutive, présente dans les interactions durables hôte invertébré / parasite, conduit dans certains cas à un polymorphisme de compatibilité dont les bases moléculaires ne sont pas connues. Afin d'identifier les déterminants moléculaires de ce polymorphisme de compatibilité dans le modèle Schistosoma mansoni / Biomphalaria glabrata, nous avons développé une approche protéomique comparative des stades larvaires qui interagissent avec l'hôte invertébré. Ainsi, la comparaison, qualitative et quantitative, des protéomes des souches de parasites compatible et incompatible, nous a permis d'identifier une nouvelle famille d'antigènes chez S. mansoni. Les protéines de cette famille partagent les caractéristiques moléculaires des mucines. Elles possèdent un domaine contenant un nombre variable d'unités répétées en tandem (VNTR). Elles sont (i) exprimées spécifiquement dans les stades larvaires interagissant avec le mollusque, (ii) localisées dans la glande apicale des stades miracidia et sporocystes et (iii) sécrétées et relarguées avec les produits d'excrétion-sécrétion. Nous avons également montré que ces protéines de type mucine présentent un haut degré de polymorphisme et que des différences importantes existent entre les deux souches de S. mansoni. Ces différentes caractéristiques nous ont conduit à nommer les protéines de cette famille « S. mansoni Polymorphic Mucin », SmPoMuc. Nous avons ensuite montré que les SmPoMuc sont codées par une famille multigénique qui évolue selon le modèle de "birth and death". Les gènes codant les SmPoMuc sont transcrits indépendamment, et pour chaque gène, différents transcrits peuvent être obtenus par épissage. De plus, nos résultats suggèrent que ce polymorphisme pourrait avoir des conséquences sur le statut de glycosylation des SmPoMuc. Nos résultats supportent l'idée que S. mansoni a développé au cours de l'évolution des mécanismes complexes permettant de générer un haut niveau de polymorphisme des SmPoMuc. Par ailleurs, le fait que ce « chaos contrôlé » soit généré à partir d'un nombre limité de gènes est unique par rapport à ce qui a été décrit pour des variants polymorphes exprimés par d'autres parasites

Les plantes sont soumises durant leur vie à de nombreux stress environnementaux. Face à ces contraintes, les végétaux ont développé au cours de l'évolution différentes stratégies. La plus emblématique est la mise en place du métabolisme spécialisé, représenté par une grande diversité chimique et fonctionnelle. Bien que ce métabolisme soit de plus en plus étudié ces dernières années, de nombreuses lacunes persistes à son propos, liées notamment (i) à la complexité des modifications métabolomiques engendrées par la perception de stress, (ii) aux coûts et avantages que ces métabolites imputent à la plante les accumulant, et (iii) aux voies métaboliques menant à cette diversité de composés. Pour appréhender ces différentes problématiques, nous avons adopté une stratégie combinant des approches de phytochimie, de biologie moléculaire et de génétique. Dans un premier temps, nous avons étudié les changements métaboliques globaux engendrés par l’application de deux stress environnementaux, l’ozone et la blessure mécanique, sur une plante modèle au laboratoire, le panais, en fonction du temps. Les résultats de ces travaux nous ont permis d’identifier 40 métabolites différentiellement accumulés dans ces conditions, dont certaines furocoumarines. Par la suite, nous avons focalisé notre étude sur ces molécules en évaluant leurs profils d’accumulation, en condition de stress par blessures mécaniques, par la biais d’analyses différentielles. A partir de ces données, nous avons initié la recherche et l'identification de gènes candidats potentiellement impliqués dans cette voie à partir de plusieurs banques transcriptomiques et génomiques de panais. La fonction des gènes sélectionnés a été évalué par des approches d'expression hétérologue dans la levure. En parallèle de ces travaux, nous avons développé une stratégie destinée à mieux comprendre le coût métabolique de la synthèse de métabolites spécialisés. Pour ce faire, nous avons adapté aux furocoumarines une technique de clonage multigénique permettant de transférer dans une plante, et en une seule opération, plusieurs gènes impliqués dans la même voie de biosynthèse. Cette méthode nous a permis d'initier la génération de lignées stables ayant intégré les deux premiers gènes de la voie. Ces plantes seront comparées à des plantes sauvages et permettront ainsi d’étudier les coûts métaboliques et physiologiques de l’introduction de cette nouvelle voie de biosynthèse ainsi que ses bénéfices en termes de défense de la plante. / Plants are subjected to many environmental stresses during their life. Faced with these constraints, plants have developed different strategies during their evolution. The most emblematic is the establishment of a specialized metabolism, represented by a great chemical and functional diversity. Although this metabolism has been studied more and more in recent years, many gaps remain, related in particular (i) to the complexity of the metabolomic changes generated by the perception of stress, (ii) to the costs and benefits that these metabolites impute to the producing plant, and (iii) to the metabolic pathways leading to the diversity of compounds. To cope with these different issues, we adopted a strategy combining approaches of phytochemistry, molecular biology and genetics. First, we studied global metabolic changes caused by the application of two environmental stresses, ozone and mechanical wounding, on parsnip. The obtained results allowed us to identify 40 metabolites differentially accumulated under these conditions, including some furocoumarins. Subsequently, we focused our study on these molecules by evaluating their accumulation profiles under mechanical wounding stress condition, using differential analyzes. From this data, we initiated the search and identification of candidate genes potentially involved in this pathway based on transcriptomic and genomic parsnip libraries analyses. The function of the selected genes was evaluated by heterologous expression approach in yeast. In parallel to this work, we have developed a strategy to better understand the metabolic cost of specialized metabolites synthesis. To do this, we have adapted a multigene cloning method to furocoumarines, allowing to transfer several genes involved in the same pathway in a plant, in a single operation. This method allowed us to initiate the generation of stable lines having integrated the first two genes of the pathway. These plants will be compared to wild plants and will thus allow to study the metabolic and physiological costs of the introduction of this new biosynthetic pathway and its benefits in terms of plant defense.

Notre équipe de recherche étudie l'action des hormones gibbérellines (GA) et cytokinines (CK) dans les processus de développement chez la plante modèle Arabidopsis thaliana. En recherchant des régulateurs de l'expression d'un gène impliqué dans la différenciation des cellules épidermiques et dont l'expression est contrôlée par ces deux hormones, une nouvelle famille de quatre protéines nommées GeBP (GL1 enhancer Binding Protein), GPL1 (GeBP Protein Like 1), GPL2 et GPL3 a été identifiée au laboratoire. Le but de ce travail de thèse était de caractériser moléculairement et fonctionnellement les membres de cette nouvelle famille multigénique.<br /> Nous avons tout d'abord vérifié l'adressage nucléaire des protéines GeBP/GPL et démontré leur capacité à former des dimères in planta via un motif Leucine-Zipper non canonique. L'analyse fonctionnelle a été abordée par l'étude de lignées simples et multiples mutantes gebp/gpl. Différentes données physiologiques et moléculaires convergentes ont démontré un rôle redondant des gènes GeBP/GPL dans le contrôle de la réponse aux CK. Enfin, une analyse globale des transcriptomes d'une lignée surexpresseur de GPL2 et du quadruple mutant gebp/gpl, nous a permis d'établir un lien entre les GeBP/GPL et CPR5, un gène impliqué dans la réponse aux pathogènes, et le contrôle du cycle cellulaire. Ce lien a été conforté expérimentalement par des mesures de ploïdies des noyaux des cellules foliaires montrant une dérégulation du cycle cellulaire chez la lignée quadruple mutant et la lignée surexpresseur de GPL2.<br />Les futurs travaux auront pour but de poursuivre l'étude de la fonction des GeBP/GPL et de confirmer le lien avec CPR5.