Células multipotentes mesenquimais estromais (CTM) são células adultas multipotentes que podem ser isoladas a partir de diferentes tecidos e são capazes de atingir sítios danificados, exercer papéis na regeneração tecidual e modular a resposta imune. Estas células demonstraram resultados discrepantes em estudos in vivo dependentes de sua fonte de obtenção. Há na literatura hipóteses de que o mecanismo predominante pelo qual as CTMs atuam no reparo tecidual estaria relacionado à sua atividade parácrina, criando um microambiente com sinais tróficos. Nesse sentido, a avaliação do conteúdo do secretoma destas células é de grande interesse. Portanto, este projeto teve como objetivo analisar o meio condicionado de CTMs obtidas de diferentes fontes (tecido adiposo, músculo esquelético e tubas uterinas) de mesmos indivíduos. A abordagem experimental consistiu em proteômica shotgun (nanocromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas em tandem) com o intuito de identificar alvos diferentemente expressos entre as culturas que possam sugerir funções específicas de cada linhagem celular. Os dados espectrais foram obtidos pelo modo de aquisição dependente de dados (Top15). Os dados adquiridos foram processados pelas plataformas MaxQuant e TPP (Trans-Proteomic Pipeline). Foi realizada análise qualitativa de vias enriquecidas por meio do programa Ingenuity utilizando as proteínas em comum nos secretoma de todas as CTMs analisadas. Essa análise permitiu observar vias enriquecidas de proliferação celular, migração celular e desenvolvimento do sistema cardiovascular, demonstrando que as proteínas secretadas por quaisquer das CTMs analisadas podem ser relacionadas a resultados encontrados na literatura utilizando estas células para terapias para patologias. As análises estatísticas para determinar se haveria dependência da composição do secretoma em função do indivíduo doador ou tecido fonte das CTMs revelaram proteínas diferencialmente expressas entre todos os grupos. Estas proteínas diferencialmente expressas são relacionadas à proliferação, sinalização e interação celular, além de modulação do sistema imune e da angiogênese. Neste contexto, podemos concluir que o secretoma das CTMs é muito semelhante, que as CTMs isoladas de quaisquer tecidos ou indivíduos são capazes de secretar moléculas que possivelmente exercem benefícios em determinado tratamento. Entretanto, estes benefícios podem ser exacerbados ou suprimidos pelas moléculas diferencialmente expressas, as quais são dependentes tanto dos tecidos quanto dos indivíduos dos quais as CTMs foram obtidas / Multipotent Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) are multipotent adult cells that can be isolated from different tissues and are able to reach damaged sites, play a role in tissue regeneration and modulate immune response. These cells showed conflicting results in studies in vivo depending on their tissue origin. It is hypothesised that the predominant mechanism by which MSCs function could be related to its paracrine activity, creating a microenvironment with trophic signals. Accordingly, the evaluation of the content of the secretome of these cells is of great interest. Towards this end, this project analyzed the proteins of conditioned medium of MSCs obtained from different sources from the same donors (adipose tissue, uterine tubes and skeletal muscle). The MSCs were characterized by flow cytometry for the presence of membrane markers and by differentiation in vitro into adipocytes, chondrocytes, and osteoblasts. The conditioned media were obtained and the protein profile was analysed by liquid nanochromatography coupled to tandem mass spectrometry. Spectral data were obtained by full-acquisition mode MS / dd-MS2 (Top15). The acquired data were processed by MaxQuant software and TPP (Trans-Proteomic Pipeline). Qualitative analysis of enriched pathways through the Ingenuity program using the shared proteins between the cell lineages was performed.It showed enriched pathways related to cell proliferation, cell migration and development of the cardiovascular system. This allows considering that the secreted proteins from the analyzed MSCs might be related to findings in the literature using these cells for therapies. After this, the proteins were analyzed for differential expression by comparing the MSCs into groups of different sources or different donors. In which were observed differentially expressed proteins related to proliferation, cell signaling and interaction, modulation of the immune system and angiogenesis. In this context, we can conclude that MSC\'s secretome is very similar in the analyzed lineages, and that any MSCs are able to secrete molecules which potentially exert for certain treatment benefits. However, these benefits can be exacerbated or annulled by differentially expressed molecules, which are dependent both as the individual and tissues from which MSCs were obtained

Células multipotentes mesenquimais estromais (CTM) são células adultas multipotentes que podem ser isoladas a partir de diferentes tecidos e são capazes de atingir sítios danificados, exercer papéis na regeneração tecidual e modular a resposta imune. Estas células demonstraram resultados discrepantes em estudos in vivo dependentes de sua fonte de obtenção. Há na literatura hipóteses de que o mecanismo predominante pelo qual as CTMs atuam no reparo tecidual estaria relacionado à sua atividade parácrina, criando um microambiente com sinais tróficos. Nesse sentido, a avaliação do conteúdo do secretoma destas células é de grande interesse. Portanto, este projeto teve como objetivo analisar o meio condicionado de CTMs obtidas de diferentes fontes (tecido adiposo, músculo esquelético e tubas uterinas) de mesmos indivíduos. A abordagem experimental consistiu em proteômica shotgun (nanocromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas em tandem) com o intuito de identificar alvos diferentemente expressos entre as culturas que possam sugerir funções específicas de cada linhagem celular. Os dados espectrais foram obtidos pelo modo de aquisição dependente de dados (Top15). Os dados adquiridos foram processados pelas plataformas MaxQuant e TPP (Trans-Proteomic Pipeline). Foi realizada análise qualitativa de vias enriquecidas por meio do programa Ingenuity utilizando as proteínas em comum nos secretoma de todas as CTMs analisadas. Essa análise permitiu observar vias enriquecidas de proliferação celular, migração celular e desenvolvimento do sistema cardiovascular, demonstrando que as proteínas secretadas por quaisquer das CTMs analisadas podem ser relacionadas a resultados encontrados na literatura utilizando estas células para terapias para patologias. As análises estatísticas para determinar se haveria dependência da composição do secretoma em função do indivíduo doador ou tecido fonte das CTMs revelaram proteínas diferencialmente expressas entre todos os grupos. Estas proteínas diferencialmente expressas são relacionadas à proliferação, sinalização e interação celular, além de modulação do sistema imune e da angiogênese. Neste contexto, podemos concluir que o secretoma das CTMs é muito semelhante, que as CTMs isoladas de quaisquer tecidos ou indivíduos são capazes de secretar moléculas que possivelmente exercem benefícios em determinado tratamento. Entretanto, estes benefícios podem ser exacerbados ou suprimidos pelas moléculas diferencialmente expressas, as quais são dependentes tanto dos tecidos quanto dos indivíduos dos quais as CTMs foram obtidas / Multipotent Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) are multipotent adult cells that can be isolated from different tissues and are able to reach damaged sites, play a role in tissue regeneration and modulate immune response. These cells showed conflicting results in studies in vivo depending on their tissue origin. It is hypothesised that the predominant mechanism by which MSCs function could be related to its paracrine activity, creating a microenvironment with trophic signals. Accordingly, the evaluation of the content of the secretome of these cells is of great interest. Towards this end, this project analyzed the proteins of conditioned medium of MSCs obtained from different sources from the same donors (adipose tissue, uterine tubes and skeletal muscle). The MSCs were characterized by flow cytometry for the presence of membrane markers and by differentiation in vitro into adipocytes, chondrocytes, and osteoblasts. The conditioned media were obtained and the protein profile was analysed by liquid nanochromatography coupled to tandem mass spectrometry. Spectral data were obtained by full-acquisition mode MS / dd-MS2 (Top15). The acquired data were processed by MaxQuant software and TPP (Trans-Proteomic Pipeline). Qualitative analysis of enriched pathways through the Ingenuity program using the shared proteins between the cell lineages was performed.It showed enriched pathways related to cell proliferation, cell migration and development of the cardiovascular system. This allows considering that the secreted proteins from the analyzed MSCs might be related to findings in the literature using these cells for therapies. After this, the proteins were analyzed for differential expression by comparing the MSCs into groups of different sources or different donors. In which were observed differentially expressed proteins related to proliferation, cell signaling and interaction, modulation of the immune system and angiogenesis. In this context, we can conclude that MSC\'s secretome is very similar in the analyzed lineages, and that any MSCs are able to secrete molecules which potentially exert for certain treatment benefits. However, these benefits can be exacerbated or annulled by differentially expressed molecules, which are dependent both as the individual and tissues from which MSCs were obtained

A Pseudoartrose Congênita da Tíbia (PCT) é uma das doenças mais desafiantes da ortopedia pediátrica pela dificuldade em obter a união óssea e, quando esta ocorre, em mantê-la. É uma doença muito rara, difícil de tratar devido à sua falta de conhecimento sobre a patogênese. As Células estromais mesenquimais multipotentes (CMM) podem desempenhar um papel na patogênese do PCT, possivelmente devido à falha da diferenciação osteogênica. O estudo das CMM pode ajudar a compreender a patogênese da doença e desenvolver novas estratégias terapêuticas baseados no uso desta célula no futuro próximo. Frente ao exposto, este trabalho teve como objetivo a análise das características biológicas das CMM isoladas de diferentes regiões anatômicas de medula óssea de pacientes com PCT. Para isto, amostras de medula óssea foram coletas a partir de locais afetados e não afetadas pela doença: Crista ilíaca do membro não afetada (CINA), crista ilíaca do membro afetada (CIA), tíbia não afetada (TNA), e tíbia afetada (TA). O numero de pacientes incluídos no estudo foi três: PCT1, PCT2 e PCT3. Os resultados mostraram que todas as células isoladas de pacientes com PCT apresentavam características compatíveis com as CMM. A taxa de formação de unidades formadoras de colônias das células da TA tanto no PCT2 quanto no PCT3 foi significativamente menor em relação às células da TNA e CINA respectivamente (p<0.05). A quantidade de células positivas para o marcador CD146 foi menor nas células da TA do PCT1 e PCT2, A análise estatística mostrou que não há uma diferença significativa. Este marcador esta relacionado com a capacidade multipotente e formação óssea in vivo. No PCT1 observou-se que formação de matriz mineralizada das CMM isoladas da CIA foi significativamente maior em relação a TA. Além disso, as células da TA do PCT1 observou-se um uma secreção significativa de alguns citocinas envolvidas no processo de formação óssea, como CCL2, CCL3, CCL4, TNA-alfa, PDGF-BB, e GM-CSF. A alteração destas citocinas pode levar a situações complicadas como o caso de não consolidação óssea. Com os resultados obtidos, se há demonstrado que as CMM da tíbia afetada tenta formar osso, mas no local da lesão é insuficiente, por tal motivo é preciso realizar estudos focados no mecanismo molecular. / Congenital pseudoarthrosis of the tibia (CPT) is one of the most challenging orthopedic diseases because of the difficulty in obtaining bone union and, when it happens, in maintaining it. It is a rare disease, difficult-to-treat due to the lack of knowledge about to pathogenesis. Multipotent mesenchymal stromal cells (MSC) may play a role in the pathogenesis of PCT, possibly due to a failure in the osteogenic differentiation. Studying these cells can help to better understand the pathogenesis of the disease and develop new therapeutic strategies based on the use of MSC in the near future. In view of the above, this work had the objective of analyzing the biological characteristics of CMM isolated from different anatomic regions of bone marrow of patients with PCT. For this, bone marrow samples were collected from sites affected and unaffected by the disease: unaffected limb iliac crest (CINA), affected limb iliac crest (CIA), unaffected tibia (TNA), and affected tibia (TA). The number of patients included in the study was three: PCT1, PCT2 and PCT3. The results showed that all cells isolated from PCT patients had characteristics compatible with CMM. The rate of formation of colonyforming units of TA cells in both PCT2 and PCT3 was significantly lower in TNA and CINA cells respectively (p <0.05). The amount of cells positive for the CD146 marker was lower in the TA cells of PCT1 and PCT2. Statistical analysis showed no significant difference. This marker is related to the multipotent capacity and bone formation in vivo. In PCT1 it was observed that the formation of mineralized matrix of CMCs isolated from CIA was significantly higher in relation to AT. In addition, PCT1 TA cells showed a significant secretion of some cytokines involved in the bone formation process, such as CCL2, CCL3, CCL4, TNA-alpha, PDGF-BB, and GM-CSF. The alteration of these cytokines can lead to complicated situations such as the case of non-consolidation of bone. With the results obtained, if the CMM of the affected tibia has been shown to try to form bone, but at the site of the lesion is insufficient, it is necessary to carry out studies focused on the molecular mechanism.

A interação entre células tumorais e células estromais tem um papel central na progressão neoplásica. As células estromais mesenquimais multipotentes (MSCs) podem se integrar ao microambiente tumoral onde modulam o crescimento dos tumores por meio de distintos mecanismos. Entretanto, pouco se sabe sobre o papel das MSCs na metástase, a principal causa de morte em pacientes com câncer. Utilizando um modelo de melanoma murino ortotópico, nós demonstramos que MSCs obtidas da medula óssea de camundongos (MO-MSCs) ocupam o nicho perivascular nos tumores primários e aumentam 2,5 vezes a incidência de micrometástases pulmonares quando co-infundidas com células de melanoma B16. Observamos ainda que o meio condicionado das MO-MSCs não altera o potencial de colonização pulmonar das células B16 infundidas sistemicamente. Isto indica que as MO-MSCs modulam as fases iniciais da cascata metastática, durante a qual ocorrem os processos de invasão e intravasão nos vasos sangüíneos. Em correlação com estes efeitos pró-metastáticos, o secretoma das MO-MSCs induziu a transição epitélio-mesenquimal (EMT) nas células de melanoma in vitro. Após cultivo em meio condicionado das MO-MSCs, as células B16 adquiriram uma morfologia evidentemente fibroblástica. Ao mesmo tempo, houve o rearranjo dos filamentos de actina e o aumento da expressão de marcadores mesenquimais como fibronectina, vimentina, FSP1, N-caderina e ZEB2, acompanhado da repressão transcricional de E-caderina. A ativação da EMT pelo secretoma das MO-MSCs resultou na aquisição de propriedades metastáticas nas células de melanoma. Após cultivo em meio condicionado de MO-MSCs, as células B16 tiveram seu potencial de ancoragem à fibronectina reduzido, ao passo que houve o aumento na mobilidade e no potencial de invasão em matrizes tridimensionais. Utilizando inibidores competitivos de ATP contra o receptor tirosina-cinase Met, demonstramos que a aquisição de todas as propriedades metastáticas avaliadas e a ativação da EMT nas células de melanoma é mediada pela ativação da via HGF/Met. Estes dados destacam o papel das MOMSCs no microambiente tumoral como fonte perivascular de moléculas indutoras da EMT, cuja ativação leva a aquisição de traços metastáticos nas células de melanoma. Além disso, a inibição da via HGF/Met pode neutralizar os efeitos das MO-MSCs sobre as células tumorais, contribuindo para a repressão de propriedades fundamentais que sustentam a progressão e a disseminação neoplásica. Estas informações são importantes para o desenvolvimento seguro das MO-MSCs como ferramenta terapêutica e demonstram a importância da sinalização entre MSCs e células tumorais na disseminação metastática. Mais especificamente, estas observações reforçam a inibição da via HGF/Met como uma abordagem promissora para o tratamento da metástase. / The crosstalk between tumor cells and stromal cells can profoundly impact tumor progression. Multipotent mesenchymal stromal cells (MSCs) have been reported to integrate the tumor microenvironment where they are described to modulate tumor growth by distinct mechanisms. However, little is known about the impact of MSCs on metastasis, the main cause of death in patients with cancer. Using an orthotopic mouse melanoma model, we showed that mouse bone marrow-derived MSCs (BMMSCs) occupy the perivascular niche within primary tumors and increased by 2.5-fold the incidence of lung micrometastases after co-infusion with B16 melanoma cells. Also, MO-MSCs conditioned medium did not affect the lung colonization ability of systemically infused B16 cells. This indicates that MO-MSCs induces the initial steps of the metastatic cascade, during which the invasion and intravasion occurs. Correlating with these metastatic effects, the BM-MSCs\' secretome activated the epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) in B16 cells in vitro. After culture in BMMSCs\' conditioned medium, B16 cells acquired an evident fibroblastic morphology. Simultaneously, we observed the rearrangement of actin filaments and the upregulation of mesenchymal markers such as fibronectin, vimentin, FSP1, Ncadherin and ZEB2. In agreement with the loss of epithelial phenotype, BM-MSCs\' secretome also suppressed E-cadherin expression in B16 cells. The activation of EMT by BM-MSCs leaded to the acquisition of metastatic traits in melanoma cells. After culture in BM-MSCs\' conditioned medium, B16 cells displayed reduced anchorage to fibronectin and increased motility and invasiveness in threedimensional matrix plugs. Inhibition of Met receptor with competitive ATP inhibitors demonstrated that the induction of EMT and the resultant acquisition of metastatic traits are driven by activation of HGF/Met signaling pathway. Taken together, these evidences highlight the role of BM-MSCs as a perivascular source of EMT-inductive signals, whose activation leads to acquisition of metastatic traits in melanoma cells. Furthermore, inhibition of HGF/Met signaling pathway can neutralize the effects of BM-MSCs on tumor cells, thereby allowing the repression of fundamental properties which support tumor progression and metastasis. This information is useful to safely develop BM-MSCs as therapeutic tool and demonstrate the relevance of the signaling between MSCs and tumor cells during metastasis. More specifically, it reinforces that inhibition of Met signaling can be a promissory approach for the treatment of metastasis.

A Pseudoartrose Congênita da Tíbia (PCT) é uma das doenças mais desafiantes da ortopedia pediátrica pela dificuldade em obter a união óssea e, quando esta ocorre, em mantê-la. É uma doença muito rara, difícil de tratar devido à sua falta de conhecimento sobre a patogênese. As Células estromais mesenquimais multipotentes (CMM) podem desempenhar um papel na patogênese do PCT, possivelmente devido à falha da diferenciação osteogênica. O estudo das CMM pode ajudar a compreender a patogênese da doença e desenvolver novas estratégias terapêuticas baseados no uso desta célula no futuro próximo. Frente ao exposto, este trabalho teve como objetivo a análise das características biológicas das CMM isoladas de diferentes regiões anatômicas de medula óssea de pacientes com PCT. Para isto, amostras de medula óssea foram coletas a partir de locais afetados e não afetadas pela doença: Crista ilíaca do membro não afetada (CINA), crista ilíaca do membro afetada (CIA), tíbia não afetada (TNA), e tíbia afetada (TA). O numero de pacientes incluídos no estudo foi três: PCT1, PCT2 e PCT3. Os resultados mostraram que todas as células isoladas de pacientes com PCT apresentavam características compatíveis com as CMM. A taxa de formação de unidades formadoras de colônias das células da TA tanto no PCT2 quanto no PCT3 foi significativamente menor em relação às células da TNA e CINA respectivamente (p<0.05). A quantidade de células positivas para o marcador CD146 foi menor nas células da TA do PCT1 e PCT2, A análise estatística mostrou que não há uma diferença significativa. Este marcador esta relacionado com a capacidade multipotente e formação óssea in vivo. No PCT1 observou-se que formação de matriz mineralizada das CMM isoladas da CIA foi significativamente maior em relação a TA. Além disso, as células da TA do PCT1 observou-se um uma secreção significativa de alguns citocinas envolvidas no processo de formação óssea, como CCL2, CCL3, CCL4, TNA-alfa, PDGF-BB, e GM-CSF. A alteração destas citocinas pode levar a situações complicadas como o caso de não consolidação óssea. Com os resultados obtidos, se há demonstrado que as CMM da tíbia afetada tenta formar osso, mas no local da lesão é insuficiente, por tal motivo é preciso realizar estudos focados no mecanismo molecular. / Congenital pseudoarthrosis of the tibia (CPT) is one of the most challenging orthopedic diseases because of the difficulty in obtaining bone union and, when it happens, in maintaining it. It is a rare disease, difficult-to-treat due to the lack of knowledge about to pathogenesis. Multipotent mesenchymal stromal cells (MSC) may play a role in the pathogenesis of PCT, possibly due to a failure in the osteogenic differentiation. Studying these cells can help to better understand the pathogenesis of the disease and develop new therapeutic strategies based on the use of MSC in the near future. In view of the above, this work had the objective of analyzing the biological characteristics of CMM isolated from different anatomic regions of bone marrow of patients with PCT. For this, bone marrow samples were collected from sites affected and unaffected by the disease: unaffected limb iliac crest (CINA), affected limb iliac crest (CIA), unaffected tibia (TNA), and affected tibia (TA). The number of patients included in the study was three: PCT1, PCT2 and PCT3. The results showed that all cells isolated from PCT patients had characteristics compatible with CMM. The rate of formation of colonyforming units of TA cells in both PCT2 and PCT3 was significantly lower in TNA and CINA cells respectively (p <0.05). The amount of cells positive for the CD146 marker was lower in the TA cells of PCT1 and PCT2. Statistical analysis showed no significant difference. This marker is related to the multipotent capacity and bone formation in vivo. In PCT1 it was observed that the formation of mineralized matrix of CMCs isolated from CIA was significantly higher in relation to AT. In addition, PCT1 TA cells showed a significant secretion of some cytokines involved in the bone formation process, such as CCL2, CCL3, CCL4, TNA-alpha, PDGF-BB, and GM-CSF. The alteration of these cytokines can lead to complicated situations such as the case of non-consolidation of bone. With the results obtained, if the CMM of the affected tibia has been shown to try to form bone, but at the site of the lesion is insufficient, it is necessary to carry out studies focused on the molecular mechanism.

O crescente número de aplicações clínicas envolvendo células mesenquimais estromais multipotentes (CMMs) gera a necessidade da produção em larga escala destas células com adequada qualidade terapêutica. As CMMs são geradas atualmente através de culturas aderentes na presença de soro fetal bovino (SFB). Entretanto, apesar da eficiência na promoção do crescimento celular, o uso de SFB não é isento de desvantagens e riscos. Além do alto custo, sua utilização pode gerar risco de contaminação do produto final com agentes adventícios como vírus e príons. Por outro lado, a sua variabilidade em diferentes lotes e fornecedores dificulta a padronização do meio e reprodutibilidade do cultivo. Uma alternativa promissora para a cultura de células destinadas a terapia celular é a substituição de SFB por soro AB humano obtido a partir de plasma humano. Neste cenário, o objetivo deste trabalho foi produzir soro AB humano e avaliar a sua qualidade e eficácia como substituto do SFB na produção de células mesenquimais destinadas à terapia celular. Para a produção do soro AB humano foram avaliados tanto Plasma comum (PC>24h) (n=3) quanto Plasma isento de crioprecipitado (PCIC) (n=3). Após a produção, foi realizado o controle de qualidade dos lotes produzidos sendo verificado que os mesmos atenderam as exigências necessárias para a utilização na terapia celular. As duas fontes de plasma utilizadas para a produção do soro AB humano apresentaram características semelhantes quanto aos constituintes bioquímicos e demais parâmetros analíticos e foram eficazes na suplementação do cultivo e expansão das CMMs. A suplementação do meio com 10% de soro AB humano foi eficaz tanto no cultivo em culturas estáticas quanto em microcarregadores. Esta característica alinhase com a possibilidade de produção em larga escala, uma vez que, permitiu a expansão das CMMs de maneira similar à condição controle (suplementada com 10% de SFB) e preservou as características imunofenotípicas, funcionais e perfil citogenético pós cultivo. Além disso, o soro AB humano produzido pode ser utilizado por no mínimo doze meses após produção, quando armazenado em temperatura inferior a 20ºC negativos / The growing number of clinical applications involving multipotent mesenchymal stromal cells (MSCs) generates the need for large-scale production of these cells with appropriate treatment quality. The MSCs are now generated through adherent cultures in the presence of fetal bovine serum (FBS). However, despite the efficiency of this method, the use of FBS is not exempt of drawbacks and hazards. Besides the high cost, their use can lead to the risk of final product contamination with adventitious agents such as viruses and prions. In addition, due to its high variability of reproducibility, this methodology requires high level of standardization. A promising alternative would be to replace FBS by human AB serum from human plasma. In this scenario, our objective was to produce human AB serum and evaluate their quality and effectiveness as a FBS substitute on production of mesenchymal cells for therapy. For the production of human AB serum were evaluated both common plasma (CP > 24h; n=3) and plasma cryoprecipitate depleted (PCD; n=3). Quality controls were carried out to stablish minimal requirements of quality to be used in a cell therapy scenario. Both plasma sources of human AB serum presented similar biochemical characteristics and other analytical parameters, being effective in supplementation of the culture and expansion of MSCs. Supplementing the culture medium with 10% human AB serum was effective both in cultivation of static cultures as for microcarriers. This condition might indicate that this method would be useful for large scale production, allowing the expansion of MSCs similarly to the control condition and maintaining immunophenotypic, functional and cytogenetic characteristics. Furthermore, the human AB serum produced can be used for at least twelve months after production when stored at temperature below 20ºC negative

A interação entre células tumorais e células estromais tem um papel central na progressão neoplásica. As células estromais mesenquimais multipotentes (MSCs) podem se integrar ao microambiente tumoral onde modulam o crescimento dos tumores por meio de distintos mecanismos. Entretanto, pouco se sabe sobre o papel das MSCs na metástase, a principal causa de morte em pacientes com câncer. Utilizando um modelo de melanoma murino ortotópico, nós demonstramos que MSCs obtidas da medula óssea de camundongos (MO-MSCs) ocupam o nicho perivascular nos tumores primários e aumentam 2,5 vezes a incidência de micrometástases pulmonares quando co-infundidas com células de melanoma B16. Observamos ainda que o meio condicionado das MO-MSCs não altera o potencial de colonização pulmonar das células B16 infundidas sistemicamente. Isto indica que as MO-MSCs modulam as fases iniciais da cascata metastática, durante a qual ocorrem os processos de invasão e intravasão nos vasos sangüíneos. Em correlação com estes efeitos pró-metastáticos, o secretoma das MO-MSCs induziu a transição epitélio-mesenquimal (EMT) nas células de melanoma in vitro. Após cultivo em meio condicionado das MO-MSCs, as células B16 adquiriram uma morfologia evidentemente fibroblástica. Ao mesmo tempo, houve o rearranjo dos filamentos de actina e o aumento da expressão de marcadores mesenquimais como fibronectina, vimentina, FSP1, N-caderina e ZEB2, acompanhado da repressão transcricional de E-caderina. A ativação da EMT pelo secretoma das MO-MSCs resultou na aquisição de propriedades metastáticas nas células de melanoma. Após cultivo em meio condicionado de MO-MSCs, as células B16 tiveram seu potencial de ancoragem à fibronectina reduzido, ao passo que houve o aumento na mobilidade e no potencial de invasão em matrizes tridimensionais. Utilizando inibidores competitivos de ATP contra o receptor tirosina-cinase Met, demonstramos que a aquisição de todas as propriedades metastáticas avaliadas e a ativação da EMT nas células de melanoma é mediada pela ativação da via HGF/Met. Estes dados destacam o papel das MOMSCs no microambiente tumoral como fonte perivascular de moléculas indutoras da EMT, cuja ativação leva a aquisição de traços metastáticos nas células de melanoma. Além disso, a inibição da via HGF/Met pode neutralizar os efeitos das MO-MSCs sobre as células tumorais, contribuindo para a repressão de propriedades fundamentais que sustentam a progressão e a disseminação neoplásica. Estas informações são importantes para o desenvolvimento seguro das MO-MSCs como ferramenta terapêutica e demonstram a importância da sinalização entre MSCs e células tumorais na disseminação metastática. Mais especificamente, estas observações reforçam a inibição da via HGF/Met como uma abordagem promissora para o tratamento da metástase. / The crosstalk between tumor cells and stromal cells can profoundly impact tumor progression. Multipotent mesenchymal stromal cells (MSCs) have been reported to integrate the tumor microenvironment where they are described to modulate tumor growth by distinct mechanisms. However, little is known about the impact of MSCs on metastasis, the main cause of death in patients with cancer. Using an orthotopic mouse melanoma model, we showed that mouse bone marrow-derived MSCs (BMMSCs) occupy the perivascular niche within primary tumors and increased by 2.5-fold the incidence of lung micrometastases after co-infusion with B16 melanoma cells. Also, MO-MSCs conditioned medium did not affect the lung colonization ability of systemically infused B16 cells. This indicates that MO-MSCs induces the initial steps of the metastatic cascade, during which the invasion and intravasion occurs. Correlating with these metastatic effects, the BM-MSCs\' secretome activated the epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) in B16 cells in vitro. After culture in BMMSCs\' conditioned medium, B16 cells acquired an evident fibroblastic morphology. Simultaneously, we observed the rearrangement of actin filaments and the upregulation of mesenchymal markers such as fibronectin, vimentin, FSP1, Ncadherin and ZEB2. In agreement with the loss of epithelial phenotype, BM-MSCs\' secretome also suppressed E-cadherin expression in B16 cells. The activation of EMT by BM-MSCs leaded to the acquisition of metastatic traits in melanoma cells. After culture in BM-MSCs\' conditioned medium, B16 cells displayed reduced anchorage to fibronectin and increased motility and invasiveness in threedimensional matrix plugs. Inhibition of Met receptor with competitive ATP inhibitors demonstrated that the induction of EMT and the resultant acquisition of metastatic traits are driven by activation of HGF/Met signaling pathway. Taken together, these evidences highlight the role of BM-MSCs as a perivascular source of EMT-inductive signals, whose activation leads to acquisition of metastatic traits in melanoma cells. Furthermore, inhibition of HGF/Met signaling pathway can neutralize the effects of BM-MSCs on tumor cells, thereby allowing the repression of fundamental properties which support tumor progression and metastasis. This information is useful to safely develop BM-MSCs as therapeutic tool and demonstrate the relevance of the signaling between MSCs and tumor cells during metastasis. More specifically, it reinforces that inhibition of Met signaling can be a promissory approach for the treatment of metastasis.

O crescente número de aplicações clínicas envolvendo células mesenquimais estromais multipotentes (CMMs) gera a necessidade da produção em larga escala destas células com adequada qualidade terapêutica. As CMMs são geradas atualmente através de culturas aderentes na presença de soro fetal bovino (SFB). Entretanto, apesar da eficiência na promoção do crescimento celular, o uso de SFB não é isento de desvantagens e riscos. Além do alto custo, sua utilização pode gerar risco de contaminação do produto final com agentes adventícios como vírus e príons. Por outro lado, a sua variabilidade em diferentes lotes e fornecedores dificulta a padronização do meio e reprodutibilidade do cultivo. Uma alternativa promissora para a cultura de células destinadas a terapia celular é a substituição de SFB por soro AB humano obtido a partir de plasma humano. Neste cenário, o objetivo deste trabalho foi produzir soro AB humano e avaliar a sua qualidade e eficácia como substituto do SFB na produção de células mesenquimais destinadas à terapia celular. Para a produção do soro AB humano foram avaliados tanto Plasma comum (PC>24h) (n=3) quanto Plasma isento de crioprecipitado (PCIC) (n=3). Após a produção, foi realizado o controle de qualidade dos lotes produzidos sendo verificado que os mesmos atenderam as exigências necessárias para a utilização na terapia celular. As duas fontes de plasma utilizadas para a produção do soro AB humano apresentaram características semelhantes quanto aos constituintes bioquímicos e demais parâmetros analíticos e foram eficazes na suplementação do cultivo e expansão das CMMs. A suplementação do meio com 10% de soro AB humano foi eficaz tanto no cultivo em culturas estáticas quanto em microcarregadores. Esta característica alinhase com a possibilidade de produção em larga escala, uma vez que, permitiu a expansão das CMMs de maneira similar à condição controle (suplementada com 10% de SFB) e preservou as características imunofenotípicas, funcionais e perfil citogenético pós cultivo. Além disso, o soro AB humano produzido pode ser utilizado por no mínimo doze meses após produção, quando armazenado em temperatura inferior a 20ºC negativos / The growing number of clinical applications involving multipotent mesenchymal stromal cells (MSCs) generates the need for large-scale production of these cells with appropriate treatment quality. The MSCs are now generated through adherent cultures in the presence of fetal bovine serum (FBS). However, despite the efficiency of this method, the use of FBS is not exempt of drawbacks and hazards. Besides the high cost, their use can lead to the risk of final product contamination with adventitious agents such as viruses and prions. In addition, due to its high variability of reproducibility, this methodology requires high level of standardization. A promising alternative would be to replace FBS by human AB serum from human plasma. In this scenario, our objective was to produce human AB serum and evaluate their quality and effectiveness as a FBS substitute on production of mesenchymal cells for therapy. For the production of human AB serum were evaluated both common plasma (CP > 24h; n=3) and plasma cryoprecipitate depleted (PCD; n=3). Quality controls were carried out to stablish minimal requirements of quality to be used in a cell therapy scenario. Both plasma sources of human AB serum presented similar biochemical characteristics and other analytical parameters, being effective in supplementation of the culture and expansion of MSCs. Supplementing the culture medium with 10% human AB serum was effective both in cultivation of static cultures as for microcarriers. This condition might indicate that this method would be useful for large scale production, allowing the expansion of MSCs similarly to the control condition and maintaining immunophenotypic, functional and cytogenetic characteristics. Furthermore, the human AB serum produced can be used for at least twelve months after production when stored at temperature below 20ºC negative

Transforming growth factor beta 3 (TGF3) promotes tenogenic differentiation and may enhance tendon regeneration in vivo. This study aimed to apply TGF3 absorbed in decellularized equine superficial digital flexor tendon scaffolds, and to investigate the bioactivity of scaffold-associated TGF3 in an in vitro model. TGF3 could effectively be loaded onto tendon scaffolds so that at least 88% of the applied TGF3 were not detected in the rinsing fluid of the TGF3-loaded scaffolds. Equine adipose tissue-derived multipotent mesenchymal stromal cells (MSC) were then seeded on scaffolds loaded with 300 ng TGF3 to assess its bioactivity. Both scaffold-associated TGF3 and TGF3 dissolved in the cell culture medium, the latter serving as control group, promoted elongation of cell shapes and scaffold contraction (p < 0.05). Furthermore, scaffold-associated and dissolved TGF3 affected MSC musculoskeletal gene expression in a similar manner, with an upregulation of tenascin c and downregulation of other matrix molecules, most markedly decorin (p < 0.05). These results demonstrate that the bioactivity of scaold-associated TGF3 is preserved, thus TGF3 application via absorption in decellularized tendon scaffolds is a feasible approach.

As células-tronco hematopoéticas (CTHs) e estromais mesenquimais multipotentes (CTMs) isoladas da medula óssea vêm sendo utilizadas como fonte autóloga no tratamento de doenças autoimunes, como a esclerose múltipla (EM). As CTHs dão origem a todas as células dos sistemas hematopoético e imunológico e as CTMs possuem propriedades imunomoduladoras pela liberação de fatores solúveis e interação célula-célula. Existem trabalhos que sugerem que as doenças autoimunes sejam provenientes de defeitos intrínsecos nas células-tronco precursoras da medula óssea. Com o intuito de avaliar se as CTHs e CTMs de pacientes com EM possuem alterações intrínsecas, o objetivo geral deste trabalho foi avaliar o perfil de expressão gênica diferencial por microarrays de CTHs e CTMs de pacientes com EM, além de avaliar o perfil de expressão gênica de CTMs após o transplante autólogo de CTHs e a capacidade imunomoduladora in vitro das CTMs de pacientes. As CTHs e CTMs foram isoladas da medula óssea de pacientes com EM e doadores saudáveis, após consentimento informado. As CTHs foram isoladas por colunas imunomagnéticas e as CTMs foram isoladas por gradiente de densidade e submetidas à caracterização morfológica, imunofenotípica e capacidade de diferenciação em adipócitos e osteócitos. O RNA das CTHs e CTMs foi extraído e purificado e o perfil de expressão gênica foi avaliado por microarrays, utilizando hibridações em lâminas contendo 44.000 sondas. A capacidade imunomoduladora das CTMs de pacientes e controles foi avaliada por ensaios de cocultivo com linfócitos alogênicos e as citocinas foram quantificadas no sobrenadante por CBA flex e ELISA. Este estudo foi aprovado pelo comitê de ética do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto. Os resultados mostraram que as CTHs de pacientes possuem perfis de expressão gênica diferentes dos controles, com 2.722 genes diferencialmente expressos, envolvidos em vias de sinalização importantes para manutenção/proliferação das CTHs e diferenciação em linhagens específicas durante a hematopoese. Dentre essas sinalizações estão incluídas as vias da apoptose, Wnt, Notch, mTOR, PI3K/Akt e Ca/NFAT, sugerindo que as CTHs de pacientes com EM possuam alterações intrínsecas que podem estar relacionadas com a patogenia da doença autoimune. As CTMs isoladas de pacientes com EM exibiram aparência senescente e reduzida expressão de marcadores imunofenotípicos. Com relação à expressão gênica, as CTMs de pacientes possuem perfil diferente das CTMs controle, sendo detectados 618 genes diferencialmente expressos, incluindo genes relacionados à sinalização FGF, HGF, sinalização de moléculas de adesão e moléculas envolvidas nos processos de imunorregulação, como IL10, IL6, TGFB1, IFNGR1, IFNGR2 e HGF. O perfil de expressão gênica das CTMs de pacientes pós-transplante assemelhou-se ao perfil das CTMs pré-transplante. Ensaios de cocultivo de CTMs com linfócitos alogênicos mostraram que as CTMs de pacientes possuem capacidade antiproliferativa reduzida em relação às CTMs controle, e ainda, secreção reduzida de TGF- e IL-10 no sobrenadante das coculturas. Esses dados sugerem que as CTMs isoladas de pacientes com EM possuam alterações fenotípicas, transcricionais e funcionais. Embasados nesses achados, concluímos que as CTHs e as CTMs de pacientes com EM possuem alterações intrínsecas que podem estar relacionadas com a patogenia da doença. Uma vez que as CTMs sejam células com grande potencial terapêutico para controle da EM em pacientes refratários aos tratamentos convencionais, as alterações encontradas sugerem que CTMs de doadores saudáveis sejam mais adequadas em aplicações clínicas. / Bone marrow hematopoietic stem cells (HSCs) and mesenchymal stromal cells (MSCs) have been used as an autologous source to treat autoimmune diseases, such as multiple sclerosis (MS). HSC give rise to all hematopoietic and immune system cells, and MSCs exhibit immunomodulatory properties by releasing soluble factors and by cell-cell interactions. Evidence indicates that bone marrow stem cells obtained from patients with autoimmune diseases may present intrinsic defects. To assess whether or not HSC and MSC of MS patients have intrinsic defects, the main objective of this study was to evaluate the differential gene expression profiles of HSC and MSC from MS patients before and after autologous HSC transplantation, and additionally, to evaluate the in vitro immunomodulatory ability of patient MSCs. Bone marrow HSC and MSCs were isolated from MS patients and healthy donors. HSCs were isolated by immunomagnetic columns and MSCs were isolated by gradient density and cultured until the third passage. MSCs were characterized according to morphology, immunophenotypic markers and cell differentiation into adipocytes and osteocytes. HSC and MSCs mRNAs were extracted, purified, and the gene expression profile was evaluated by microarray hybridizations, using a platform containing 44.000 probes. The immunomodulatory activity of patient and control MSCs was assessed by coculture assays with allogeneic lymphocytes. Cytokines were quantified in coculture supernatants by ELISA and CBA flex. This study was approved by the Ethics Committee of the University Hospital of the School of Medicine of Ribeirão Preto. The results showed that the patient HSCs exhibited a distinctive gene expression profile when compared to healthy HSCs, yielding 2.722 differentially expressed genes, involved in essential HSC signaling pathways for maintenance, proliferation and differentiation into specific lineages during hematopoiesis. Among these signaling pathways were included, apoptosis, Wnt, Notch, mTOR, PI3K/Akt and Ca/NFAT, suggesting that patient HSCs have significant intrinsic transcriptional alterations that may be associated with MS pathogenesis. Regarding MSCs isolated from MS patients, they exhibited senescence appearance, decreased expression of immunophenotypic markers, and also exhibited a distinctive gene expression profile in relation to healthy MSCs, yielding 618 genes differentially expressed genes, included in FGF and HGF signaling pathways, adhesion molecules, and genes involved in immunoregulation processes, such as IL-10, IL-6, TGFB1, IFNGR1, IFNGR2 and HGF. Coculture assays of control or patient MSCs with allogeneic lymphocytes showed that patient cells exhibited reduced antiproliferative activity as compared with controls, and also exhibited reduced secretion of TGF- and IL-10 cytokines in coculture supernatants. These data suggest that MSCs isolated from MS patients have phenotypic, functional and transcriptional defects, highlighting genes related to MSC maintenance, adhesion and immunomodulatory effects. According to these results, we concluded that patient HSCs and MSCs have intrinsic defects that may be associated with the disease per se. Considering that MSCs exhibit great therapeutic potential to control MS patients refractory to conventional treatment, the major MSCs alterations observed in this study indicate that healthy MSCs may be more suitable for MS cell therapy.