Les ribonucléases et les hélicases à ARN sont des acteurs clé du métabolisme des ARN et jouent donc des rôles cruciaux pour la régulation de l'expression des gènes. Peu de données sont connues concernant ce métabolisme chez les Archées, le troisième domaine du vivant. L'équipe dans laquelle j'ai effectué mes travaux de thèse s'intéresse au métabolisme de l'ARN chez les archées et plus particulièrement aux ribonucléases ß-CASP. Dans ce contexte, nous focalisons nos études sur la compréhension physiologique que pourrait jouer les ribonucléases ß-CASP aCPSF1 et aRNase J, orthologue respectivement du facteur de terminaison de la transcription eucaryotes CPSF-73 et RNase J bactérienne. Par analogie avec CPSF-73 et RNase J, qui font partie de complexes multi-protéiques, des indices sur les fonctions des homologues archéens de ces ribonucléases pourraient provenir de l'identification des complexes autour de aCPSF1 et aRNase J. Utilisant des extraits de Pyrococcus abyssi et les protéines recombinantes aCPSF1 et aRNase J comme appâts, nous avons identifié que aRNase J fait partie d'un réseau d'interaction incluant une hélicase de la famille des Ski2-like (ASH-Ski2). En parallèle, des fractionnements d'extrait de P. abyssi sur gradient de saccharose par ultracentrifugation indiquent que aRNase J et ASH-Ski2 sont présentes toutes deux dans les fractions de haut poids moléculaires avec les sous-unités du ribosome et ceux de l'exosome. Nous avons aussi démontré une interaction stable entre aRNase J et ASH-Ski2 ainsi que des motifs impliquées dans cette interaction par des expériences de co- purification par chromatographie d'affinité. De plus, les caractérisations biochimiques de ASH-Ski2 indiquent que cette protéine possède une activité d'hydrolyse de l'ATP dépendant de la présence d'acides nucléiques. ASH-Ski2 possède de plus la capacité d'hybridation et de déroulement de deux brins d'acides nucléiques en présence d'ATP. A notre connaissance, nos résultats sont les premiers à indiquer un complexe contenant une ribonucléase et d'une hélicase à ARN Ski2-like chez les archées. De manière intriguent, aRNase J est orthologue de la RNase J bactérienne et ASH-Ski2 des hélicases Ski2-like des eucaryotes. Cela démontre que les Archées pourraient posséder un système composite impliqué dans le métabolisme des ARN partageant des caractéristiques bactériens et eucaryotes. Ces résultats mettent en lumière l'avantage de l'étude des Archées pour la compréhension des mécanismes moléculaires et évolutives des processus fondamentaux des trois domaines du vivant. / Ribonucleases and RNA helicases are the main actors of RNA processing and have a critical role in gene expression regulation. Little is known about this process in Archaea. Our group focuses in RNA metabolism in Archaea involving ß-CASP ribonucleases. Recently, we published phylogenomic and experimental work demonstrating that archaeal ß-CASP proteins, aCFSF1 and aRNase J, are highly conserved ribonucleases in Archaea. Archaeal aCPSF1, an ortholog of the eukaryal transcription termination factor CPSF73, is ubiquitous in Archaea suggesting an essential conserved function. Archaeal aRNase J, an ortholog of the bacterial ribonuclease RNase J, is conserved through a major phylum of the Archaea, the Euryarchaeota. These findings suggest that the role of these enzymes in RNA processing can be reminiscent of ancient functions that had arisen early in evolution. We now want to focus on understanding the physiological role of aCPSF1 and aRNase J with the hyperthermophilic euryarchaeal Pyrococcus abyssi as model. By analogy to eukaryal CPSF73 and bacterial RNase J, which are part of multiprotein complexes, clues to the function of the archaeal ß-CASP homologs might come from the identification of archaeal multiprotein complex(es) containing aCPSF1 and aRNase J orthologs. Using P. abyssi cell extracts and recombinant aCPSF1 or aRNase J as bait, we have found that aRNase J is a part of protein interaction networks that include Ski2-like RNA helicase (ASH-Ski2). In parallel, fractionation of P. abyssi whole cell extracts in sucrose gradient by ultracentrifugation shows that aRNase J and ASH-Ski2 are present in high sedimentation fractions with ribosomal and exosome sub-units. We also demonstrate a direct interaction of aRNase J with ASH-Ski2 by co-purification affinity chromatography experiments and identify motifs that potentially involve in this interaction. Biochemical characterization of ASH-Ski2 demonstrates a nucleic dependant ATPase activity. ASH-Ski2 also possesses annealing and unwinding activities in presence of ATP. To our knowledge, our results are the first experimental indications of interacting of a complex containing ribonuclease and RNA helicase-like proteins in Archaea. Remarkably, aRNase J is an orthologue of the bacterial RNase J and ASH-Ski2 is an orthologue of the eukaryotic Ski2-like family proteins. This shows that Archaea might possess a composite RNA processing system sharing both eukaryal and bacterial features. This highlights the advantage of an archaeal model to gain further mechanistic and evolutionary information of fundamental processes across the three domains of life.

Le complexe Arp2/3, conservé sur le plan évolutif, joue un rôle central dans la nucléation d’actine branchée, qui entraîne la migration cellulaire, l’endocytose et d’autres processus cellulaire. Récemment, une petite protéine, Arpin, qui inhibe le complexe Arp2/3 au front du lamellipode a été découverte et caractérisée. Sur sa partie C-terminale, Arpin possède un motif acide (A), qui est homologue au motif A des différents NPF (Nucleation Promoting Factor). Il a été prédit qu’Arpin peut se lier à deux sites de liaison au complexe Arp2/3, similaire aux domaines VCA des NPF. Ici, nous utilisons la microscopie électronique de particules uniques pour obtenir une reconstruction 3D du complexe Arp2/3 lié à Arpin, à une résolution de 25 Å. Nous avons montré que la liaison d’Arpin induit la conformation ouverte, standard, du complexe Arp2/3. Nous avons confirmé qu’il y a deux sites de liaison sur le complexe Arp2/3 pour Arpin : un à l’arrière de la sous-unité Arp3, et le second localisé entre les sous-unités Arp2 et ARPC1. La distance entre le complexe Arp2/3 et Arpin (5nm) confirme qu’Arpin interagit avec son partenaire via sa queue acide C-terminale non structurée.Nous avons, ensuite, identifié Tankyrases1/2, comme un nouveau partenaire qui se lie à Arpin, par « pull-down ». De façon intéressante, les sites de liaisons d’Arpin aux Tankyrases et à Arp2/3 se chevauchent. Nous avons, par conséquent, démontré qu’il y a une compétition dose-dépendante entre le domaine ARC4 de Tankyrase1 et le complexe Arp2/3.Pour comprendre les principes de l’interaction entre Arpin et Tankyrases, nous avons créé un mutant d’Arpin (ArpinG218D) qui, in vitro, se lie toujours au complexe Arp2/3, mais plus aux Tankyrases. In vivo, ArpinG218D n’est pas capable d’inhiber le complexe Arp2/3, ce qui suggère que Tankyrase pourrait être nécessaire pour l’interaction entre Arpin et le complexe Arp2/3. Arpin est le facteur responsable du changement de direction des cellules migrantes. Nous avons donc analysé, la migration de cellules MCF10A exprimant soit la forme sauvage d’Arpin (ArpinWT) soit son mutant ArpinG218D en parallèle de la déplétion d’Arpin endogène. Les cellules exprimant ArpinG218D ont une persistance de migration supérieure, similaire à celles déplétées d’Arpin endogène. Nous avons, ainsi, fait l’hypothèse que le mutant ArpinG218D ne peut pas inactiver le complexe Arp2/3 car il n’est pas présent au niveau du lamellipode. Nous avons donc comparé la quantité de protéine d’ArpinWT et d’ArpinG218D dans la fraction membranaire de cellules migrantes. Une différence significative (44%) dans la quantité d’ArpinWT et d’ArpinG218D a confirmé notre hypothèse.Les Tankyrases sont des cibles thérapeutiques dans de nombreux cancers, mais il n’existe pas de modèle structural pour ces protéines grandes et flexibles. Dans ce travail, nous avons, pour la première fois, obtenu deux reconstructions 3D de Tankyrase1 et Tankyrase2 complètes liées à Arpin en utilisant la microscopie électronique de particules uniques. La résolution obtenue (27 Å) a été suffisante pour détecter un changement de conformation dramatique des domaines SAM et PARP de Tankyrase après fixation d’Arpin. Dans notre reconstruction, trois molécules d’Arpin se lient aux domaines ARC1, ARC4 et ARC5 de Tankyrase1. ARC5 a été montré pour être la partie le plus flexible de l’ensemble des domaines ARC.Grâce aux données que nous avons obtenues, nous avons suggéré un modèle de régulation de l’activité d’Arpin par les Tankyrases. Selon notre modèle, les Tankyrases se lient à Arpin dans le cytoplasme, changent sa conformation et amènent Arpin au niveau de la membrane dans le lamellipode. Traduisant les signaux extracellulaires, la GTPase Rac active Arpin, qui séquentiellement inactive le complexe Arp2/3, tandis que les Tankyrases sont libérées. / The evolutionarily conserved Arp2/3 complex plays a central role in nucleating the branched actin filament arrays that drive cell migration, endocytosis, and other processes. Recently, an inactivator of the Arp2/3 complex at the lamellipodium tip, a small protein, Arpin, was discovered and characterized. On its C-terminus, Arpin possesses an acidic (A) motif, which is homologous to the A-motif of various Nucleation Promoting Factors (NPFs). It was predicted that Arpin can bind at two binding sites to the Arp2/3 complex, similar to VCA domains of NPFs. Here, we used single particle electron microscopy to obtain a 3D reconstruction of the Arp2/3 complex bound to Arpin at a 25Å resolution. We showed that the binding of Arpin causes the standard open conformational of the Arp2/3 complex. We confirmed that there are two binding sites on the Arp2/3 complex for Arpin: one on the back of the Arp3 subunit, and the second is located between Arp2 and ARPC1 subunits. The distance between the Arp2/3 complex and Arpin (5 nm) supports the view that Arpin interacts with its partner via its unstructured C-terminal acidic tail.Next, using the pull-down assay, we identified the new Arpin binding partners, Tankyrases1/2. Interestingly, Tankyrases and the Arp2/3 complex possess overlapping amino acid sequences at Arpin binding sites. Hence, we demonstrated a competition between the ARC4 domain of Tankyrase1 and the Arp2/3 complex in a dose-dependent manner.To understand the principles of Tankyrases-Arpin interaction, we created a mutant Arpin (ArpinG218D) that lacks its ability to interact with Tankyrases, but not with the Arp2/3 complex in vitro. Interestingly, ArpinG218D was not able to inhibit the Arp2/3 complex in vivo, suggesting that Tankyrase may be necessary for Arpin-Arp2/3 complex interaction. Arpin is the turning factor of migrating cells, so we performed a migration analysis of MCF10-A cells expressing either wild type Arpin (ArpinWT) or mutant ArpinG218D in parallel with the depletion of endogenous Arpin. Cells expressing ArpinG218D had higher directional persistence, similar to the cells where the endogenous Arpin was knocked down. Thus, we suggested that mutant ArpinG218D cannot inactivate the Arp2/3 complex since it is not present at the lamellipodial tip. We compared the amount of protein for both ArpinWT and ArpinG218D in the membrane fraction of the migrating cells. A significant difference (44%) in the amount of ArpinWT and Arpin G218D was consistent with our hypothesis.Tankyrases are therapeutic targets in a variety of cancers, but currently there is no structural model available for these large and flexible proteins. In this work, we obtained for the first time two 3D reconstructions of full-length Tankyrase1 and Tankyrase1 bound to Arpin using single particle electron microscopy. The achieved resolution (27Å) was enough to detect a dramatic conformational change in Tankyrase SAM and PARP domains upon binding of Arpin molecules. In our reconstruction, three Arpins were bound to the ARC1, ARC4 and ARC5 domains of Tankyrase1. ARC5 was shown to be the most flexible part of the ARC cluster.Based on the obtained data, we suggested a model of regulation of the activity of Arpin by Tankyrases. According to our model, Tankyrases bind Arpin in the cytoplasm, change their conformational state and bring Arpin closer to the membrane in the lamellipodia. Deciphering the extracellular signals, Rac GTPase activates Arpin, which sequentially inactivates the Arp2/3 complex, while Tankyrases are released.

Les objectifs de mes travaux de thèse étaient de développer de nouvelles méthodes d’identification, de caractérisation et de quantification de protéines, mieux adaptées à la diversité des études en protéomique, ce dont la biologie a besoin aujourd’hui. L’analyse protéomique par spectrométrie de masse est apparue comme un outil précieux et pertinent pour évaluer la qualité de l’isolement d’un complexe spécifique, et pour guider les biologistes dans les choix de la stratégie à adopter. La stratégie de marquage de N-terminomique développée a permis de caractériser un processus de maturation biologique en déterminant précisément les sites d’activation de la protéine Perséphone par marquage spécifique des extrémités N-terminales. Ce travail a permis d’élucider un nouveau mécanisme fin de régulation dans l’immunité innée chez la drosophile. De nouveaux modes de marquages ont été mis au point et les familles chimiques des réactifs de marquage étudiés permettront d’adapter au mieux les études de quantifications protéomiques à la nature et aux contraintes des études biologiques à mener. / The aim of this work was to develop new methods for the identification, characterization and quantification of proteins best suited to a large diversity of proteomics studies, which is nowadays essential to biology. Our work has shown that proteomic analysis based on mass spectrometry can be a valuable and relevant tool to evaluate the isolation strategy efficiency set up for a specific complex and thus guide the biologists in their choice. The N-terminomic labeling strategy developed allowed us to describe a biological maturation process by determining precisely the Persephone protein activation sites using specific labeling of the successively generated N-terminal extremities. This work allowed elucidating a new regulation mechanism in the Drosophila innate immunity system. New chemical labeling reagents to target specific amino acids (cysteine, tyrosine and tryptophan) have been set up for fast mass-spectrometry based proteomics. These labeling strategies combined with proteomic tools will allow developing a robust and quantitative approach essential for biological studies.

Environ 30% des CDS prédits d'un génome code pour des protéines de fonction inconnue ou hypothétiques. La compréhension du rôle de ces protéines est donc l'un des grands challenges de la communauté scientifique.L'objectif principal de cette thèse est de comprendre la fonction de six protéines de fonction inconnue spécifiques de l'anaérobiose formant un complexe, appelé complexe ORP chez Desulfovibrio vulgaris Hildenborough (DvH). Ce système est répandu dans de nombreuses espèces anaérobies, et certaines de ses protéines possèdent des homologies significatives avec des protéines impliquées dans la division cellulaire.Des outils de microscopie dédiés à l'anaérobiose ont été développés au cours de cette thèse et ont permis, pour la première fois, l'observation du cycle cellulaire de DvH. L'étude de l'effet de l'oxygène à l'échelle de la cellule unique a montré une inhibition réversible de la division cellulaire en présence d'oxygène révélant une nouvelle stratégie impliquée dans l'aérotolérance de DvH.Chez DvH, le complexe ORP est codé par des gènes organisés en deux opérons divergents, orp1 et orp2, dont la transcription est gouvernée par l'ARN polymérase sigma54, le facteur de transcription IHF et l'activateur de transcription DVU2106.La diminution de la quantité de complexe ORP conduit à une hétérogénéité de la taille des cellules en accord avec un rôle potentiel du complexe dans le contrôle de la division cellulaire. Alors que l'absence de certaines protéines ORP n'affecte pas de manière significative la division de la bactérie en anaérobiose, la protéine DVU2109 présente une localisation dynamique au cours du cycle cellulaire et semble être essentielle chez DvH. / Up to now, approximately 30% of the predicted CDS in genomes encode for hypothetical or unknown function proteins. Understanding the role and the function of these proteins is now a major challenge for the scientific community.The main objective of this thesis is to determine the function of six proteins of unknown function specific of anaerobiosis and able to forming a multiprotein complex in Desulfovibrio vulgaris Hildenborough (DvH), named the ORP complex. This system is widely found in many anaerobic microorganisms, and some proteins of this system have significant homologies with proteins involved in cell division.Tools for microscopy in anaerobiosis have been developed during this thesis and have allowed observation, for the first time, of a complete DvH cell cycle. The study of oxygen effect on DvH at a single cell level has showed a reversible inhibition of cell division during oxygen exposure revealing a new strategy involved in DvH aerotolerance.In DvH, the ORP complex is encoding by genes organized in two divergent operons, orp1 and orp2, whose transcription is governed by sigma 54 RNA polymerase, the transcription factor IHF and the transcriptional regulator DVU2106. The decreased in the amount of ORP complex leads to heterogeneity of the cell size in accordance with a potential role of this complex in the spatio-temporal control of DvH cell division. While the absence of the majority of ORP proteins doesn't significantly affect DvH division in anaerobic conditions, the protein DVU2109 has a dynamic location during cell cycle and appears to be essential in the cell.

Le complexe Arp2/3 génère des réseaux d’actine branchés, qui produisent une forcée de poussée permettant à la cellule de remodeler ses membranes. Le complexe WASH active le complexe Arp2/3 à la surface des endosomes et facilite ainsi la scission membranaire des intermédiaires de transports contenants des récepteurs internalisés tels que les intégrines α5β1. De ce fait, le complexe WASH en favorisant le recyclage des intégrines, joue un rôle crucial dans l’invasion des cellules tumorales durant la progression tumorale. Cependant, le mécanisme d’assemblage du complexe WASH est inconnu. Dans cette étude, nous rapportons l’identification du premier facteur d’assemblage du complexe WASH. Nous avons identifié la protéine HSBP1 grâce à un crible des protéines qui se lient aux formes précurseurs des sous-unités mais plus au complexe une fois assemblé. La reconstitution biochimique et la modélisation moléculaire nous a permis de montrer que HSBP1 est associé avec le précurseur trimérique CCDC53, le dissocie et forme un hétérotrimère qui va éventuellement libérer une forme monomérique de CCDC53 pour l’assemblage du complexe WASH. Le rôle de HSBP1 dans l’assemblage du complexe WASH est conservé. En effet, WASH est déstabilisé dans des cellules mammaires par le knock-down de HSBP1 et dans l’amibe Dictyostelium par le knock-out de HSBP1. La déstabilisation du complexe WASH par le knock-out de HSBP1 phénocopie la déplétion de WASH dans l’amibe Dictyostelium. Dans des cellules humaines de carcinomes mammaires l’inhibition de l’expression de HSBP1 altère le recyclage des intégrines à la membrane plasmidique. Il en résulte des adhésions focales défectueuses et des capacités invasives réduites. De plus, HSBP1 est localisé aux centrosomes et est requis pour la polarité des cellules lors de la migration. Enfin, nous avons trouvé que la surexpression de HSBP1 dans des tumeurs mammaires est associée à une augmentation des niveaux du complexe WASH et à un mauvais pronostic pour les patientes atteintes de cancer du sein. En conclusion, HSBP1 est un facteur d’assemblage conservé qui contrôle les niveaux du complexe WASH. / The Arp2/3 complex generates branched actin networks, which produces a pushing force that helps the cell to remodel its membranes. The WASH complex activates the Arp2/3 complex at the surface of endosomes and thereby, facilitates the membrane scission of the transport intermediates containing internalized receptors such as α5β1 integrins. Hence, by promoting integrin recycling, the WASH complex plays a crucial role in tumor cell invasion during cancer progression. However, how cells assemble the WASH complex at first is unknown. Here we report the identification of the first assembly factor of the WASH complex. We identified HSBP1 in a proteomics screen for proteins binding to precursor forms of subunits, but not to the fully assembled WASH complex. Through biochemical reconstitution and molecular modeling, we found that HSBP1 associates with the precursor CCDC53 trimer, dissociates it and forms a heterotrimer that will eventually contribute a single CCDC53 molecule to the assembling WASH complex. The role of HSBP1 in WASH complex assembly is well conserved since WASH is similarly destabilized upon HSBP1 knock-down in mammalian cells or upon HSBP1 knock-out in Dictyostelium amoeba. In line with the defective assembly of the WASH complex, the HSBP1 knock-out closely phenocopies WASH knock-out in amoeba. In human mammary carcinoma cells, HSBP1 depletion results in impaired integrin recycling to the plasma membrane leading to the defective development of focal adhesions and reduced invasion abilities. Moreover, HSBP1 was found to localize at the centrosome and was required for the polarization associated with the migration. On the other end, in mammary breast tumors, we found that HSBP1 was often overexpressed and that its overexpression was associated with increased levels of the WASH complex and with poor prognosis for breast cancer patients. Hence, HSBP1 is a conserved assembly factor that controls the levels of the WASH complex.