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<p> Malic enzymes catalyze the oxidative decarboxylation of malate to pyruvate with the simultaneous reduction of a nicotinamide cofactor. It was previously reported that the nitrogen-fixing bacterium, Sinorhizobium meliloti, has two malic enzymes, a diphosphopyridine-dependent malic enzyme (DME) and a triphosphopyridine-dependent malic enzyme (TME). The dme gene is essential for symbiotic nitrogen-fixation in alfalfa root nodules and this symbiotic requirement cannot be met through increased expression of tme. In order to determine if a metabolic difference exists between the dme and tme mutants which might explain the symbiotic phenotypes, we conducted an analysis of intracellular and extracellular polar metabolomes. Differences noted between the intracellular profiles of the dme and tme mutant strains hinted at osmotic stress or a disturbance in central carbon metabolism. Extracellular studies indicated that dme mutant cells excreted at least 10-fold greater concentrations of both malate and fumarate. When considered together, the metabolic data implies that the DME enzyme is primarily responsible for the conversion of malate to pyruvate to generate acetyl-CoA whereas the TME enzyme must serve a secondary function within the cell.</p> <p> While the C-terminal 320 amino acid regions from both DME and TME are similar in sequence to phosphotransacetylase enzymes, enzyme assays with DME and TME proteins have failed to detect PTA activity. Here we report that the chimeric malic enzyme structure is conserved among various gram negative bacteria including Agrobacterium tumefaciens, Escherichia coli, Bradyrhizobium japonicum and Porphyromonas gingivalis. Moreover these chimeric proteins are also present in the archaebacteria. Halobacterium salinarum and Haloarcula marismortui. To further our understanding of the functions of DME and TME in S. meliloti, we have fused protein domains from DME to an affinity tag consisting of strepII and a calmodulin binding peptide. To identify proteins interacting with this fusion, we expressed these protein fusion constructs in S. meliloti, prepared extracts containing the soluble proteins and passed these through tandem affinity chromatography columns. All proteins that coeluted with the fusion proteins appeared to be interacting with antibodies specific for the DME protein and so may have been aggregates or break-down products of DME.</p> / Thesis / Master of Science (MSc)

The response of plants to environmental stress spans several orders of magnitude in time and space, causing system-wide changes. These changes comprise of both protective responses and adverse reactions in the plant. Stresses like water deficit or drought cause a drastic effect in crop yield, while concomitantly agriculture consumes 1/3rd of the fresh water available to us and there is widespread water scarcity around the world. It is, hence, a fundamental goal of modern biology and applied biotechnology to unravel this complex stress response in laboratory model plants like Arabidopsis and crop models like rice. Such an understanding, especially at the cellular level, will aid in informed engineering of stress tolerance in plants. We have developed and used integrative functional genomics approaches to characterize environmental stress response at various levels of organization including genes, modules and networks in Arabidopsis and rice. We have also applied these methods in problems concerning bioenergy. Since the poor knowledge of the cellular roles of a large portion of plant genes remains a fundamental barrier to using such approaches, we have further explored the problem of 'gene function prediction'. And, finally, as a contribution to the community, we have curated a large mutant resource for the crop model, rice, and established a web resource for exploratory analysis of abiotic stress in this model. All together, this work presents insights into several facets of stress response, offers numerous novel predictions for experimental validation, and provides principled analysis frameworks for systems level analysis of environmental stress response in plants. / Ph. D.

Au début du XXIe siècle émerge en Espagne un mouvement littéraire qu’on appelle « mutant » et qui annonce la fin du paradigme postmoderne. Cette étude se centre sur l’écriture narrative de Jorge Carrión, Agustín Fernández Mallo et Vicente Luis Mora : figures représentatives de ce phénomène, ils jettent les bases d’une poétique mutante, à travers des œuvres singulières, rendant compte des transformations culturelles à l’époque contemporaine. Les nouvelles technologies et les médias récents sont des outils narratifs récurrents dans leurs textes, mais ils fournissent également un modèle d’organisation aussi bien générationnelle que textuelle, ou encore médiatique, qui pourrait être désigné comme le réseau mutant. La thèse se donne pour objet de montrer que la poétique de ces auteurs se construit à travers des relations réticulaires qui se tissent entre les personnes, entre les œuvres et entre les perspectives théoriques que ces écrivains explorent. À l’époque de l’expansion narrative, il faut chercher l’unité dans les nœuds et les liens qui assemblent les pièces, les lieux, les genres, les moyens de communication et de diffusion, etc. Les transformations auxquelles est soumise l’esthétique de la postmodernité dans les textes mutants pointent l’avènement d’une ère nouvelle, celle du postnumérique, époque dans laquelle la tension entre l’écriture et la technologie est mise au service d’une création littéraire hybride. / At the beginning of the 21st century, a new literary movement, called “mutant”, appears in Spain, thus announcing the end of the postmodern paradigm. The present research study focuses on the narrative of Jorge Carrión, Agustín Fernández Mallo and Vicente Luis Mora. These three significant figures attempt to lay the ground for a mutant poetics, by creating literary works which point out the cultural changes that are taking place in our contemporary world. They use the new technologies and media as narrative tools, as well as a model for their organisation as a generation and for the organisation of their texts, in interaction with other platforms. One may therefore speak of a mutant network. The purpose of this dissertation is to indicate that these authors’ poetics is built through reticular relations between people, between works and theories. In this time of narrative expansion, one must search for unity in the nodes and the links which bind the pieces, the places, the literary genres, the means of communication and transmission, etc. In the mutant texts, the postmodern aesthetic is transformed, thus indicating a new cultural turn, the post-digital era, where the tension between writing and technology is used to create hybrid literary works.

Toxoplasma gondii est un parasite intracellulaire responsable de la toxoplasmose. Lors de l’infection aiguë, le parasite se divise dans une vacuole parasitophore (VP), compartiment d’interactions avec la cellule hôte. La VP se modifie pour former un kyste qui persiste au cours de la phase chronique. Le rôle des protéines de granules denses (GRA) dans ce processus est suggéré par leur abondance dans la VP et la paroi kystique. Par des approches de génétique inverse et de protéomique, le but de ce travail visait à préciser au plan moléculaire, le rôle de la protéine GRA5. En utilisant un modèle de différenciation parasitaire in vitro, l’étude des phénotypes d’un mutant invalidé du gène gra5 a permis de découvrir son rôle clé dans la formation des kystes par le maintien 1/ de l’intégrité de la membrane délimitant la VP en cours de différenciation, 2/ de l’accumulation d’autres composants parasitaires dans la VP et 3/ de son interaction avec le reticulum endoplasmique de l’hôte. / Toxoplasmosis, which is caused by the intracellular parasite Toxoplasma gondii is characterized by a life-long chronic infection. The parasites replicate inside a parasitophorous vacuole (PV), which evolves into a persistent cyst. The molecular mechanisms governing the differentiation process are poorly characterized. It is known that the dense granules proteins (GRA) are major components of both the PV and the cyst wall, enabling their interaction with the host cells. Using a Prugniaud cystogenic type II strain in which the gra5 gene was invalidated and a combination of cellular and proteomic approaches, we discovered that GRA5 regulates i) the molecular content of the PV, ii) the PV interaction with the host endoplasmic reticulum and iii) host cell homeostasis,that is necessary to ensure the formation of a stable cyst wall.

La recherche de variations d’activités enzymatiques associées à des phénotypes chez la tomate (Solanum Lycopersicum) a permis d’apporter de nouveaux éléments pour l’étude desrelations existantes entre le métabolisme central et la qualité du fruit. Ce projet qui engageaitune nouvelle thématique au sein de l’unité Biologie et Pathologie de Fruit (UMR 1332, INRABORDEAUX) a permis dans un premier temps de développer une plateforme d’enzymologieà haut débit. Cette structure permet d’une part de réaliser plus de 10 000 déterminationsd’activités enzymatiques par jour avec une très grande reproductibilité et d’autre part dedéterminer les constantes de Michaelis (Km) apparentes pour jusqu’à une dizaine d’enzymespar jour.Dans un deuxième temps ce projet s’est attaché à étudier les relations existantes entre lesenzymes de la voie de la glycolyse chez le cultivar de tomate MicroTom. Nous y avonsrelevé l’existence de corrélations fortes entre les activités de ces enzymes. Nous avonségalement mis à jour l’existence de corrélations pour les enzymes mesurées à partir de deuxétages foliaires distincts ce qui suggère que les réseaux enzymatiques sont conservés ausein d’une plante.Dans un troisième temps, le criblage d’une collection de mutants de tomate MicroTom a étéentrepris. Ce criblage de plus de 150 familles (soit environ 1800 plantes) sur la base desactivités enzymatique de onze enzymes du métabolisme central à deux concentrations desubstrats différentes (saturante et non saturante) a abouti à l’identification de deux familles.Ces deux familles porteraient chacune une mutation affectant les caractéristiques cinétiquesde la Triose-Phosphate Isomérase. Ces mutations étaient toujours en cours d’étude à la finde ce projet. Ces résultats ouvrent de nouvelles perspectives pour la compréhension desrelations entre les enzymes du métabolisme central. Ils permettent aussi d’apporter desméthodes d’identification rapide de mutants enzymatiques au sein d’une large population. / Research on enzymatic variations associate with phenotypes in tomato (SolanumLycopersicun) provided new and original input regarding links between central metabolismand fruit quality. This project took part in a new topic of the Fruit Biology and Pathology Unit(UMR 1332, INRA BORDEAUX). First, during this project, a new high-throughputenzymology platform was created. This unique lab offers possibility to determine both morethan 10 000 enzyme activities per day with a very good reliability and apparent Michealisconstant (Km) for up to ten enzymes per day.Second, this project investigated existent relationship between glycolytic enzymes inMicroTom tomato cultivar. We highlighted strong correlations between enzymes in leaves.We also uncovered correlations between enzymes activities measured in two distinct foliarlevels. These elements suggest inheritability of the enzymes network within the plant.Third, the screen of an Ethylmethyl Sulfonate (EMS) MicroTom mutant’s collection wasinitiated. 150 families (around 1800 plants) were screened for eleven enzymes with twodifferent substrate concentrations. At the end of the process, two families were identified;both could have mutation(s) that affect(s) the kinetic characteristic of Triose-Phosphateisomerase. These mutations were style investigated at the end of this project. These originalresults provide new perspectives for knowledge of relationship between central metabolism’senzymes. Finally, This project proposes new and rapid enzymatic mutant identification withina large population as an EMS mutant’s collection.

La compréhension des mécanismes de défense mis en place lors de la résistance des plantes vis-à-vis d'agents pathogènes a pour objectif de proposer des alternatives à l'utilisation de produits phytosanitaires utilisés en agriculture. Dans une première partie, nous avons étudié les mécanismes moléculaires impliqués dans la résistance induite aux pathogènes par l'acide β-aminobutyrique (BABA) chez la vigne. En effet, cet acide aminé non protéique favorise un état physiologique particulier, appelé potentialisation, dans lequel la plante est capable de mobiliser plus rapidement et/ou plus intensément ses réactions de défense en réponse à un stress. Contrairement aux éliciteurs comme les oligogalacturonates (OG), nous avons montré que le BABA seul n’induisait pas les événements précoces de signalisation sur suspensions cellulaires de vigne, tels que les variations de la concentration en calcium cytosolique libre ([Ca2+]cyt), la production de monoxyde d’azote (NO), la production d’H2O2, la phosphorylation de MAPkinases, ni l’expression de gènes de défense. Seules la production d’H2O2 et l’expression plus intense du gène RbohD codant une NADPH oxydase sont potentialisées par le BABA dans les suspensions cellulaires élicitées par les OG. In planta, le BABA potentialise également une production d’H2O2 en réponse à l’infection par l’oomycète Plasmopara viticola. L’utilisation d’un inhibiteur de NADPH oxydase abolit complètement cette production d’H2O2 et bloque partiellement la résistance induite par le BABA. Nous montrons donc que la potentialisation de la production d’H2O2 dépendante d’une NADPH oxydase contribue à l’établissement de la résistance induite par le BABA chez la vigne. Une deuxième partie a permis d’appréhender les événements cellulaires impliqués dans la résistance des plantes en se focalisant sur le mutant pad2 (phytoalexin deficient) d’Arabidopsis thaliana. Ce mutant présente une sensibilité accrue à différents pathogènes et contient un taux de glutathion de l’ordre de 20 % par rapport à l’écotype sauvage. Nous avons tout d’abord montré que le faible taux de glutathion dépendait d’une quantité réduite de la première enzyme de sa biosynthèse, la glutamate-cystéine ligase. Le glutathion étant impliqué dans la mise en place des réactions de défense, nous avons tenté de définir le lien entre la déficience en glutathion et la sensibilité de pad2 aux pathogènes. Nous avons tout d’abord montré que pad2 possédait un état redox du glutathion plus oxydé que le sauvage. Une analyse transcriptomique à l’état basal a révélé que la plupart des gènes différentiellement exprimés étaient réprimés chez pad2. Parmi ces gènes, certains codent des protéines impliquées dans les flux d’ions qui pourraient déréguler la dépolarisation membranaire. Nous avons ainsi confirmé que la dépolarisation de la membrane plasmique est amoindrie chez pad2 en réponse aux OG. De plus, des événements en aval tels que la production d’H2O2 et la production de NO sont également plus faibles chez le mutant par rapport au sauvage. Cette absence de la production d’H2O2 a également été spécifiquement observée sur plantes pad2 infectées par l’oomycète Phytophthora brassicae. Il en résulte un développement accru du pathogène corrélé à une absence de réponse hypersensible, une mort cellulaire localisée normalement observée dans le cas du sauvage résistant. En réponse aux OG ou à l’infection par P. brassicae, les analyses transcriptomiques font ressortir un fort enrichissement de gènes relatifs à la dégradation des protéines chez pad2. De manière globale, nos résultats suggèrent que la déficience en glutathion chez pad2 pourrait profondément modifier le turn-over des protéines, perturbant ainsi la signalisation cellulaire et les réponses biologiques associées. / Alternative strategies are required to reduce pesticide input into the environment for effective and sustainable plant protection. One solution is the activation of plant basal resistance that relies on the application of resistance inducer molecules. In the first part of this study, we analyzed the mode of action of β-aminobutyric acid (BABA), a non-protein amino acid, in the grapevine induced resistance. BABA confers a physiological state, called priming, during which plants are able to mobilize better and/or more rapidly defense responses to biotic or abiotic stress. Unlike oligogalacturonides (OG), we showed that BABA did not induce early signaling events in grapevine cells such as variations of cytosolic free calcium concentration, H2O2 and nitric oxide production, MAPkinase phosphorylation, nor the expression of defense-related genes. Among them, only H2O2 production and the expression of RbohD gene, which encodes a NADPH oxidase, are primed by BABA in OG-treated cells. Moreover, BABA-treated plants display a stronger accumulation of H2O2 in response to the oomycete Plasmopara viticola. Application of an NADPH oxidase inhibitor completely abolishes this H2O2 production and leads to a reduction of BABA-induced resistance against P. viticola. These data suggest that the priming of an NADPH oxidase-dependent H2O2 production contributes to BABA-induced resistance in grapevine. The second part consisted to analyze molecular events involved in plant resistance by using the pad2 (phytoalexin deficient) mutant of Arabidopsis thaliana which is susceptible to a broad range of pathogens. We showed that the glutathione depletion depends on the low amount of glutamate-cysteine ligase protein, the first enzyme involved in its biosynthesis. We studied molecular events, which are involved in defense mechanisms, to understand the impact of the glutathione content on pad2 susceptibility. Our results show that the redox state of glutathione is more oxidized in pad2 than in wild type Col-0. Since cellular redox state change is known to regulate gene expression, a basal transcriptome analysis has been performed in pad2 and wild type plants. Interestingly, most of the identified genes in pad2 are down-regulated, some of them encoding proteins involved in ion fluxes. As expected, the plasma membrane depolarization and events downstream like H2O2 and NO production are impaired in pad2 in response to OG. During infection with Phytophthora brassicae, the lack of H2O2 production is concomitant with an absence of the hypersensitive response, a localize cell death observed in the resistant wild type. After OG treatment or P. brassicae infection, microarray analysis brings out genes related to protein machinery including degradation in pad2. Taken together, these data suggest that the depletion of glutathione has an impact on protein turn-over which disturbs cell signaling events and related biological responses.