L’ADN (acide désoxyribonucléique) est le support de notre génome, c'est aussi un biopolymère dont les propriétés d’hybridation de deux simples brins complémentaires en une double hélice permettent son utilisation comme brique élémentaire pour l’auto-assemblage de structures avec une résolution de quelques nanomètres. Parmi les différentes méthodes développées, l'origami d’ADN dans lequel un simple brin d’ADN issu du génome d’un phage est replié algorithmiquement par un ensemble de brins synthétiques plus petits s'est démontré très robuste pour l'assemblage de structures bi ou tridimensionnelles. La conception de ces origami est basée sur la thermodynamique à l'équilibre, c'est à dire sur l'optimisation de l'appariement complémentaire des bases. Cependant, bien que des outils interactifs qui facilitent la conception de structures aient été développés, très peu de recherches se sont focalisées sur le processus du repliement et sur son optimisation. Notre travail a consisté à étudier la thermodynamique de nanostructures d'ADN afin de mieux comprendre le processus d'assemblage et d'en identifier des étapes clés.Nous avons effectué des mesures en calorimétrie différentielle à balayage (DSC) sur des structures modèles et des origami d'ADN. Ainsi, nous avons pu identifier la présence d'étapes clés dans le repliement de nanostructures comportant un petit nombre de brins d'ADN. Nous montrons qu'en modifiant les séquences il est possible de changer la coopérativité et la stabilité de l'assemblage des nanostructures et donc de modifier le chemin de repliement.L'étude d'origami simplifiés comportant une ou deux agrafes nous a permis de mesurer l'influence de la position des agrafes, des tailles de boucles et de l'orientations des brins d'ADN sur la thermodynamique du repliement.Enfin, les mesures calorimétriques effectuées sur des origami d'ADN nous ont permis de résoudre l'hybridation collective d'ensemble d'agrafes. Cela nous permet de hiérarchiser l'assemblage de l'origami en domaines distincts.Notre travail de thèse a également consisté au développement de méthodes innovantes de nanocalorimétrie ultrasensible intégrant de la microfluidique. Ces méthodes calorimétriques permettront d'accéder aux paramètres cinétiques de l’assemblage en plus des paramètres thermodynamiques à l'équilibre.Nos résultats obtenus sur les nanostructures modèles montrent qu'il est possible d'optimiser la conception des nanostructures d'ADN en intégrant dans la conception le processus d'assemblage. Des nanostructures d'ADN à l'assemblage performant permettront peut-être à l'avenir le développement d'automates moléculaires synthétiques qui sont une des applications très prometteuses de ces systèmes. / DNA is the support of genetic information. The property of self-assembly of two complementary single strands to form a double helix enable the use of this biopolymer as a building block for nanofabrication. DNA origami are a method which enable the self-assembly of 2D or 3D nanostructures. In this method, a long single-stranded DNA taken from the genome of a phage is folded on itself in a programmable way thanks to a lot of short synthetic DNA strands. The design of origami is based on thermodynamic and on the optimization of the base pairing in the structures. However, although interactive tools that facilitate the design of DNA nano-structures have been developed, we know little about the folding process and its optimization. In this work, we study the thermodynamics of DNA nanostructures in order to have a better understanding of the folding process and to identify the key steps.We performed differential scanning calorimetry (DSC) on model structures and DNA origami. Thus, we have been able to identify the presence of key steps in the folding of small nanostructures. We show that by changing the sequences of the strands, it is possible to change the cooperativity and the stability of the assembly of the nanostructure and thus change the folding path.The study of small origami with one or two staples allowed us the see the influence of the position of the staples, of the sizes of the loops and of the orientation of the staples on the thermodynamic of the folding.Finally, the calorimetric measurements performed on origami allowed us to solve the collective hybridization of staple sets. This enable us to prioritize the origami assembly into separate domains.This work also consisted of the development of innovative methods of ultra-sensitive nano-calorimetry integrating microfluidics. These calorimetric methods will give us the access to the kinetic parameters of the folding and to the equilibrium thermodynamic parameters.Our results obtained on model nano-structures show that it is possible to optimize the design of DNA nanostructures by integrating the assembly process in the design of the structures. Such high-performance DNA nanostructures may allow in the future the development of molecular robot which is a very promising application of DNA nanostructures.

Neste trabalho estudamos o efeito SERS de moléculas adsorvidas em sistemas eletroquímicos em termos da participação do mecanismo de transferência de carga na intensificação total observada. Desenvolvemos um modelo para o mecanismo químico de transferência de carga assitido por fótons, de maneira a explicar a variação do potencial de máxima intensificação SERS (Vmax) com a energia da radiação excitante. O modelo permite também o uso da expressão para o espalhamento Raman no domínio do tempo para o cálculo de perfis de excitação SERS (intensidade SERS versus potencial aplicado) de moléculas adsorvidas em interfaces eletroquímicas. Este método de cálculo dos perfis de excitação SERS foi aplicado para os casos da piridina e do íon complexo [Fe2(CN)104,4\'-bpy]6- em eletrodo de prata. Os resultados mostram existir uma boa relação entre os perfis calculados e os obtidos experimentalmente. Como resultado dos cálculos efetuados, o modelo fornece ainda dados sobre o deslocamento das curvas de poço potencial dos estados excitados envolvidos nos processos de transferência de carga assistidos por fótons. Nos capítulos seguintes, estudamos algumas conseqüências deste modelo, e sua aplicação em diferentes sistemas químicos. Um dos sistemas estudados foi o íon complexo [Ru(bpy)2viol]+ adsorvido em eletrodo de prata. Observa-se que a intensidade relativa dos modos vibracionais de cada um dos ligantes varia com o potencial aplicado ao eletrodo. Esses resultados podem ser explicados considerando-se dois processos de transferência de carga superficie → adsorbato assistidos por fótons. O primeiro deles deve-se a uma transição envolvendo estados doadores próximos ao nível de Fermi do metal (EF) e estados receptores (orbitais π*) localizados no violurato. O segundo envolve estados doadores em EF e orbitais π* da bpy. A energia da transição de transferência de carga metal → adsorbato varia com o potencial aplicado. Existe portanto a possibilidade de se alcançar diferentes estados eletrônicos excitados do adsorbato, intensificando, seletivamente, diferentes cromóforos com um único comprimento de onda. Assim, através da variação do potencial aplicado ao eletrodo é possível modular a transição de transferência de carga Ag → complexo de modo a envolver cada um dos diferentes ligantes. Estudamos também o mecanismo envolvido no efeito SERS da molécula FePc (ftalocianina de ferro) em eletrodo de prata. Nesse sistema, foi possível apresentar uma versão mais detalhada para o efeito químico envolvido na intensificação SERS incluindo o efeito de múltiplos estados excitados e acoplamento vibrônico, enfatizando as relações de simetria e overlap de funções de onda que regem os mecanismos de intensificação Raman ressonante. A excitação dos espectros SERS em comprimentos de onda fora da condição de Raman ressonante pode intensificar modos vibracionais de simetria a2g (não permitidos no espectro Raman normal) desde que o potencial aplicado esteja próximo à condição de ressonância para uma transição de transferência de carga superficie/adsorbato. O mecanismo químico de intensificação envolvido no efeito SERS desse sistema pode ser descrito como um processo de transferência de carga modulado pelo potencial, envolvendo dois estados doadores da FePc e um estado aceptor localizado na superficie do eletrodo de prata. Enquanto os modos totalmente simétricos (a1g) são intensificados por um mecanismo de Franck-Condon, os modos a2g têm a simetria apropriada para acoplar dois estados eletrônicos de simetria A1u e A2u, sendo intensificados através do mecanismo de Herzberg- Teller. Os efeitos da natureza química do solvente, e das interações solvente-soluto nas geometrias de adsorção e nas posições dos estados eletrônicos do adsorbato, são analisados para os ciano complexos Fe(phen)2(CN)2 e [Fe2(BPE)(CN)10]6-. Os resultados obtidos demonstram a influência decisiva da natureza química de solventes e eletrólitos suporte na espectroscopia de espécies adsorvidas em interfaces eletroquímicas. De fato, a natureza das interações solvente-adsorbato ou eletrólito-adsorbato podem determinar a ligação à superficie, e, desta maneira, intensificação seletiva de modos vibracionais da molécula pode ser obtida. A partir do estudo do processo de transferência de carga entre a superficie e os complexos adsorvidos através dos perfis de excitação SERS foi possível, em alguns casos, mapear os níveis de energia do adsorbato com relação ao nível de Fermi do metal. / In this work, attention has been given to systems in which the charge transfer (CT) mechanism is contributing to the enhancement of the Raman scattering of species adsorbed on metal surfaces in order to address the participation of a resonance Raman effect on this part of the total enhancement. A model for the adsorbate-metal surface interaction and the charge transfer mechanism for surface-enhanced Raman scattering (SERS) is presented. The fundamental observation behind the currently proposed model is that ali previous theories indicate that Raman intensity should be at maximum when the incident laser frequency is resonant with a surface/adsorbate charge transfer band. This fact leads to the conclusion that this aspect of the chemical effect may be due to a resonance Raman mechanism. Therefore, for such mechanism to be valid, the chemical effect of SERS must follow the already well established principies of resonance Raman theory. In this model, the metal surface provides a source of electrons that may, upon interaction with light, flow into and out of the adsorbed species. Based on this model we have proposed a formalism derived from the time-domain description of the resonance Raman effect that describes the dependence of the SERS intensities of molecules adsorbed in electrochemical interfaces upon the applied potential. This approach accounts for the enhancement of totally symmetric modes via a Franck-Condon mechanism, and only one electronic excited state of the adsorbate/surface system is considered. The analytical expression derived to calculate the SERS intensity versus applied potential profiles and their dependence on the exciting radiation has been applied for pyridine and for the ion complex [Fe2(CN)10bpy]6- adsorbed on a silver electrode. A good agreement between calculated and experimental excitation profiles have been obtained for both investigated species. Resonance Raman spectroscopy is also an electronic spectroscopy, and, as presented in this work, the SERS effect, or part of it, is also an electronic spectroscopy. Its intensity contains, therefore, information about the structure of the excited electronic state involved in the charge transfer process. This information is provided by the calculation of the SERS excitation profiles according to the derived expression in the form of ΔK values. The remaining sections of this work are dedicated to the study of the SERS effect of coordination compounds adsorbed on silver electrodes. One of the investigated systems is the mixed ligand ion complex [Ru(bpy)2viol]+. The SERS measurements have shown that the vibrational modes of both ligands can be selectively enhanced by changing the electrochemical applied potential at a fixed laser excitation energy. This result indicates the presence of two different metal to adsorbate photon assisted charge transfer processes. The first one involves a density of donor states near the Fermi level (EF) of the metal and na acceptor state localized on the violurate ligand, while the second process involves na acceptor state localized on the bpy ligand. These results demonstrate the possibility of reaching different excited electronic states of molecules adsorbed on electrode surfaces, selectively enhancing different chromofores by changing the applied potential and of assigning electronic charge transfer transitions based on SERS results. In order to provide a more detailed description of the charge transfer mechanism of enhancement working in the SERS effect of adsorbed molecules, including the role of multiple excited electronic states, vibronic coupling and symmetry selection rules, the SERS effect of iron phthalocyanine is discussed. The charge transfer mechanism of enhancement in this system is characterized as a potential modulated charge transfer process involving two donor states at the FePc and an acceptor state at the silver electrode surface. Excitation of the SERS spectra at wavelengths off resonance with the Q-band may enhance the a2g vibrational modes (non allowed modes at normal Raman condition), via a Herzberg-Teller mechanism, providing that the applied potential is dose to the resonance condition for the adsorbate to metal charge transfer transition. The effects of the chemical nature of the solvent in the adsorption geometry and in the position of the electronic states of adsorbates is discussed for the cyano complexes Fe(phen)2(CN)2 and [Fe2(BPE)(CN)10]6-. The results obtained have demonstrated the decisive role played by the chemical nature of solvents and supporting electrolytes in the surface-enhanced spectroscopy of species adsorbed at electrochemical interfaces. In fact, the nature of solvent or electrolyte - molecule interaction can determine the bonding to the surface, and therefore, selective enhancement of vibrational modes within a molecule can be accomplished. Based on the charge transfer processes between the surface and the adsorbed molecules probed by the SERS excitation profiles, it has been possible, in some cases, to determine the position of the energy levels of the adsorbate in relation to the Fermi level of the metal electrode.

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(理学) / 甲第18539号 / 理博第4015号 / 新制||理||1579(附属図書館) / 31439 / 京都大学大学院理学研究科物理学・宇宙物理学専攻 / (主査)教授 阪部 周二, 教授 田中 貴浩, 准教授 橋田 昌樹 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Science / Kyoto University / DGAM

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Ce travail concerne l‟étude de la croissance épitaxiale de couches fines de nitrure d‟aluminium (AlN) sur substrats silicium. Les propriétés structurales et optiques de l‟AlN épitaxié par jets moléculaires sont étudiées en fonction de l‟orientation et de la préparation de surface du substrat. La vitesse de propagation des ondes acoustiques et les coefficients piézoélectriques e31 et d33 sont mesurés. Des mesures préliminaires sur des résonateurs à ondes acoustiques de volume confirment que l‟utilisation de couches épitaxiées permet la réalisation de composants capables de fonctionner à hautes fréquences. Dans la dernière partie, nous présentons des résultats collatéraux à cette étude et plus particulièrement nous montrons l‟effet de l‟amélioration de la qualité de la couche tampon d‟AlN sur la croissance d‟hétérostructures à base de GaN sur substrat silicium et nous dégageons quelques perspectives concernant la fabrication de micro-nanostructures et la possibilité d‟intégrer cette famille de matériaux à la filière silicium.

Le système des nano-colonnes auto-assemblées de GeMn, riches en Mn et entourées d'une matrice de germanium quasi pure, est un matériau prometteur pour la spintronique. Selon les paramètres de croissance, les échantillons contiennent des nano-colonnes de type cohérents sur la matrice de Ge, de type amorphe, ou/et des nano-inclusions de Ge3Mn5. Ce manuscrit présente notre étude des propriétés électroniques, magnétiques et structurales des nano-colonnes de GeMn à l'aide du rayonnement synchrotron. Les mesures de la diffusion et diffraction des rayons X en incidence rasante dans des échantillons contenant des nano-colonnes cohérentes et sans précipités de Ge3Mn5 montrent un certain désordre dans les nano-colonnes. Les cartographies de l'espace réciproque ont pu être quantitativement expliquées en considérant la déformation de la matrice de germanium due à l'inclusion des nano-colonnes dans celle-ci, ainsi que par leurs corrélations de position, sans avoir recours à d'autres phases cristallines. La spectroscopie d'absorption et le dichroïsme circulaire magnétique de rayons X ont permis de sonder spécifiquement les propriétés magnétiques des atomes de Mn dans des échantillons sans précipités de Ge3Mn5. On observe une allure des spectres XAS-XMCD des nano-colonnes très similaire à celle observée dans le cas de Ge3Mn5. Le moment magnétique local sur le manganèse possède une composante orbitale faible mais non-nulle et une amplitude totale (0.8 +/- 0.1 µB) plus faible que celle attendue pour Ge3Mn5 (~2.6 µB) ou pour des atomes de Mn substitutionnels (~3 µB). Ceci indique une origine différente de la phase des nano-colonnes. Les spectres XAS-XMCD ont été calculés pour différentes structures modèles, incluant des défauts simples ainsi de nouvelles phases cristallines, les paramètres critiques des calculs ayant été identifiés. Le meilleur accord est observé pour une nouvelle phase de type Ge2Mn. / The system of self-assembled Mn-rich GeMn nanocolumns embedded in a Mn-poor germanium matrix is a promising material for spintronics applications. Depending on the growth parameters, coherent GeMn nanocolumns, amorphous GeMn nanocolumns and/or Ge3Mn5 nanoclusters can be observed. In this manuscript, we report on the investigation on the electronic, magnetic and structural properties of the GeMn nanocolumns using synchrotron techniques. Measurements using grazing incidence x-ray scattering techniques in samples containing coherent nanocolumns, free from Ge3Mn5 precipitates, show some disorder in the nanocolumns. Reciprocal space maps are quantitatively explained by considering the scattering of the Ge matrix strained by the inclusion of the nanocolumns in the matrix and their correlations in position, without requiring the consideration of different additional phases. X-ray absorption spectroscopy and x-ray magnetic circular dichroism allow for the specific probing of the Mn magnetic properties in samples free of Ge3Mn5 clusters. The lineshapes of the XAS-XMCD spectra in the nanocolumns are found to be very similar to those in Ge3Mn5. The local magnetic moment on the Mn atom possess a small but non-zero orbital component and its total magnitude is much smaller (0.8 +/- 0.1 µB) than that in Ge3Mn5 (~2.6 µB) or than that expected for fully substitutional Mn atoms (~3 µB). This points to a different nature of the nanocolumns. The XAS-XMCD spectra have been calculated for several structural models, including simple defects and new crystalline phases, and critical parameters for the calculations have been identified. The best agreement is found for a new Ge2Mn crystalline phase.

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The DNA origami method was established by Paul Rothemund in 2009. It allows to produce self-assembling 2D nanostructures with precise geometry and tunable mechanical properties that can be equipped with a broad range of functionalizations. It was extended to 3D by the group of William Shih in 2009 which also presented caDNAno, a software that made the design of nanostructures easier and more accessible. Since then, DNA origami nanostructures were utilized in a broad range of applications, which enabled unprecedented insight into mechanisms and processes of biological systems at the nanoscale. In this thesis multiple nanostructures were designed and manufactured to perform studies at the single-molecule level, which yielded a number of scientifically relevant contributions in the fields of biophysics and nanotechnology. Development of DNA origami nanostructures to mimic the properties and function of membrane proteins As a first application, DNA origami nanostructures with defined geometric and mechanical properties were designed, that mimic the behaviour and function of membrane proteins. To this end, rod-shaped nanostructures were equipped with precisely placed, lipid-integrating cholesterol modifications as well as fluorescent dyes. Subsequently their interaction with lipid membranes was studied. It was found that the prepared nanostructures specifically bound to lipid membranes and could diffuse on their surface, for which the rotational and translational diffusion coefficients were determined. The presence of magnesium thereby promoted the nanostructures to migrate into specific lipid domains in a reversible, switchable manner. Furthermore, their high aspect ratio allowed to investigate crowding effects, which are considered important mechanisms for the self-organisation of membrane proteins. In addition, block-shaped DNA origami nanostructures that organized into micrometre-sized super-structures were designed and produced. They were capable of deforming lipid membranes on the scale of micrometres in a similar fashion to biological counterparts. Establishing ultra-fast twist and torque measurements using DNA origami nanorotors In an additional application, DNA origami nanorotors were developed to perform ultra-fast single-molecule twist and torque measurements, allowing to resolve subtle changes in real-time. This also required the development of a new measurement setup that extended magnetic tweezers with the capability to detect the scattered light of gold nanoparticles. Hence, a complex setup was constructed and calibrated that enabled magnetic tweezers measurements with up to 4 kHz and simultaneously track gold nanoparticles at 4 kHz as well. In an alternative configuration the setup allowed simultaneous magnetic tweezers and single-molecule fluorescence and FRET measurements. DNA origami nanorotors which were embedded within DNA constructs and carried the gold nanoparticles were then obtained and used to perform ultra-fast twist and torque measurements. This constituted improvements in the spatio-temporal resolution over previous methods by one to three orders of magnitude, as demonstrated by direct measurements on the torsional response of DNA to external twists and the unwinding of DNA by an enzyme. Direct measurements of the energy landscape and dynamics of the R-loop formation by the CRISPR-Cas surveillance complex Cascade Using the DNA origami nanorotor enhanced ultra-fast twist measurements, the target recognition process of the CRISPR-Cas surveillance complex Cascade was directly observed. Effector complexes of CRISPR-Cas systems have been widely applied in genome editing recently, since they can be programmed to bind practically any genomic target by their intrinsic RNA (crRNA) component. They have, however, considerable tolerance for mismatches between their RNA and their intended DNA target. For Cascade, after binding with a protein motif to a DNA target, base-pairing between crRNA and the double-stranded DNA target is initiated, resulting in the formation of an R-loop structure which leads to unwinding of the DNA. This was directly measured using the nanorotor, which provided unprecedented insight in the R-loop formation by Cascade, allowing to determine the underlying energy landscape and the dynamics of the process. It was shown that R-loop progression occurs on 6-bp kinetic intermediate steps with an underlying single base pair stepping on fast time scales. Furthermore the effect of mutations in the target DNA on the R-loop formation process was investigated, indicating that the global shape of the energy landscape allows for a highly specific kinetic discrimination of mismatched targets. Investigations into the locking transition, a conformational change that occurs after the full formation of the R-loop and is a prerequisite for subsequent DNA degradation, completed the study. Overall, the findings provide a better understanding of the target recognition process of Cascade, which will contribute to the construction of more precise gene-editing tools in the future. Furthermore, the nanorotor-assisted measurements are applicable to many twist and torque inducing mechanisms and processes that can be investigated in further studies.:1. Introduction 2. Multifunctional magnetic tweezers 3. Applications of DNA origami 4. Ultra-Fast torque measurements on supercoiled DNA 5. R-loop dynamics of the CRISPR-Cas Cascade complex 6. Summary and Discussion Bibliography List of Figures List of Tables List of Publications A. Appendix / Die DNA Origami Methode wurde im Jahr 2006 durch Paul Rothemund begründet. Sie erlaubt es selbst-assemblierende 2D Nanostrukturen mit präzisen Geometrien und kalibrierbaren mechanischen Eigenschaften zu erstellen, die zudem mit einer Vielzahl an Funktionalisierungen ausgestattet werden können. Die Methode wurde 2009 in der Gruppe von William Shih auf 3D Nanostrukturen erweitert, wobei zudem caDNAno präsentiert wurde, eine Software die die Erstellung solcher Nanostrukturen wesentlich einfacher und zugänglicher machte. Seitdem wurden DNA Origami Nanostrukturen in vielfältigen Anwendungen genutzt, die nie dagewesene Einblicke in Mechanismen und Prozesse von biologischen Systemen auf der Nanoskala erlaubten. In dieser Arbeit wird anhand mehrerer Beispiele gezeigt, wie solche Nanostrukturen genutzt werden können, um Studien auf der Einzelmolekül-Ebene durchzuführen. Entwicklung von DNA Origami Nanostrukturen, welche die Eigenschaften und Funktionen von Membranproteinen imitieren In einer ersten Anwendung wurden DNA Origami Nanostrukturen mit definierten geometrischen und mechanischen Eigenschaften entworfen, welche das Verhalten und die Funktion von Membranproteinen nachahmten. Dazu wurden stabförmige Nanostrukturen mit präzise platzierten, lipidintegrierenden Cholesterinmodifikationen und fluoreszierenden Farbstoffen ausgestattet. Anschließend wurde ihre Interaktion mit Lipidmembranen untersucht. Es zeigte sich, dass die Nanostrukturen spezifisch an Lipidmembranen binden und auf deren Oberfläche diffundieren konnten. Hierbei wurden die Diffusionskoeffizienten der Rotations- und Translationsbewegungen bestimmt. Zudem bewirkte die An- oder Abwesenheit freier Magnesiumionen die steuerbare und reversible Anreicherung in verschiedenen Lipiddomänen. Die längliche Form der Nanostrukturen erlaubte es zudem, Verdrängungseffekte zu untersuchen, die als wichtiger Mechanismus für die Selbstorganisation von Membranproteinen gelten. Des weiteren wurden blockartige, multimerisierende DNA Origami Nanostrukturen entwickelt, die mikrometer-große Superstrukturen bilden konnten. Im ähnlichen Maße wie biologische Vorbilder, waren diese Strukturen in der Lage, Lipidmembranen über mehrere Mikrometer hinweg zu verformen. Etablierung ultraschneller Verdrehungs- und Torsionsmessungen mit DNA Origami Nanorotoren In einer weiteren Anwendung wurden DNA Origami Nanorotoren entwickelt, um ultraschnelle Einzelmolekül-Verdrehungs- und Torsionsmessungen durchzuführen, bei denen kleinste Veränderungen in Echtzeit beobachtet werden konnten. Dazu wurde eine neue Messapparatur entwickelt, bei der eine Magnetische Pinzette um die Fähigkeit Goldnanopartikeln zu detektieren erweitert wurde. Dies erlaubte die Konstruktion und Kalibrierung eines komplexen Messaufbaus, mit dem es möglich war Magnetische-Pinzetten-Messungen mit 4 kHz durchzuführen und gleichzeitig Goldnanopartikel mit ebenfalls 4 kHz zu verfolgen. Zudem konnten in einer alternativen Konfiguration Magnetische-Pinzetten-Messungen mit Einzelmolekül-Fluoreszenz- und FRET-Messungen kombiniert werden. Mit Goldnanopartikeln funktionalisierte DNA-Origami-Nanorotoren wurden anschließend in DNA-Konstrukte eingebettet und mit Hilfe des Messaufbaus für ultraschnelle Verdrehungs- und Torsionsmessungen genutzt. Gegenüber vorheriger Methoden wurde dadurch die räumlich-zeitliche Auflösung um eine bis drei Größenordnungen verbessert. Dies wurde anhand der Bestimmung der Torsionsreaktion von DNA auf Verdrehungen sowie deren Entwindung durch ein Enzym demonstriert. Direkte Bestimmung der Energielandschaft und Dynamiken der R-loop Entstehung des CRISPR-Cas Überwachungskomplexes Cascade Die entwickelten DNA Origami Nanorotoren ermöglichten zudem ultraschnelle Verdrehungsmessungen durchzuführen, um den Zielerkennungsprozess des CRISPR-Cas Überwachungskomplexes Cascade direkt zu beobachten. Effektorkomplexe von CRISPR-Cas Systemen werden zunehmend als Geneditierwerkzeuge eingesetzt, da sie aufgrund ihrer intrinsischen RNA-Komponente (crRNA) darauf programmiert werden können an praktisch jede DNA-Sequenz zu binden. Allerdings zeigen Sie eine beträchtliche Toleranz gegenüber Abweichungen zwischen der Sequenz ihrer RNA und der bestimmungsgemäßen DNA-Zielsequenz. Grundsätzlich bindet Cascade zunächst mit einem Protein-Motiv an eine kurze DNA-Sequenz, woraufhin es zur Basenpaarung zwischen der crRNA und der doppelsträngigen DNA-Zielsequenz kommt. Dabei entsteht ein R-loop, was zur Entwindung der DNA führt. Dies wurde direkt mit Hilfe der Nanorotoren gemessen, was nie dagewesene Einblicke in diesen Prozess erlaubte und die Bestimmung der zugrundeliegenden Energielandschaft und Dynamiken ermöglichte. Es wurde gezeigt, dass Längenänderungen des R-loops in kinetischen Zwischenschritten von 6 Basenpaaren erfolgen, denen Einzel-Basenpaar-Schritte auf schnelleren Zeitskalen zugrunde liegen. Des weiteren wurde der Effekt von Mutationen der DNA-Zielsequenz auf die R-loop Entstehung untersucht. Hierbei zeigte sich, dass die globale Form der Energielandschaft eine hochspezifische kinetische Differenzierung von inkongruenten Zielsequenzen erlaubt. Untersuchungen des 'locking' Mechanismus, ein struktureller Übergang der nach der vollständigen Ausbildung des R-loops erfolgt und eine Voraussetzung für die nachfolgende Zersetzung von DNA darstellt, rundeten die Untersuchungen ab. Insgesamt wurde gezeigt, dass mit Hilfe der ultraschnellen Verdrehungsmessungen, neue, detaillierte Einblicke in den Zielerkennungsprozess von Cascade gewonnen wurden, die zur Erstellung präziserer Genmanipulationswerkzeuge in der Zukunft beitragen können. Darüber hinaus eignen sich die Nanorotoren zur Untersuchung weiterer verdrehungs- und torsionserzeugender Mechanismen und Prozesse, die in weiteren Studien erforscht werden können.:1. Introduction 2. Multifunctional magnetic tweezers 3. Applications of DNA origami 4. Ultra-Fast torque measurements on supercoiled DNA 5. R-loop dynamics of the CRISPR-Cas Cascade complex 6. Summary and Discussion Bibliography List of Figures List of Tables List of Publications A. Appendix

The DNA origami method was established by Paul Rothemund in 2009. It allows to produce self-assembling 2D nanostructures with precise geometry and tunable mechanical properties that can be equipped with a broad range of functionalizations. It was extended to 3D by the group of William Shih in 2009 which also presented caDNAno, a software that made the design of nanostructures easier and more accessible. Since then, DNA origami nanostructures were utilized in a broad range of applications, which enabled unprecedented insight into mechanisms and processes of biological systems at the nanoscale. In this thesis multiple nanostructures were designed and manufactured to perform studies at the single-molecule level, which yielded a number of scientifically relevant contributions in the fields of biophysics and nanotechnology. Development of DNA origami nanostructures to mimic the properties and function of membrane proteins As a first application, DNA origami nanostructures with defined geometric and mechanical properties were designed, that mimic the behaviour and function of membrane proteins. To this end, rod-shaped nanostructures were equipped with precisely placed, lipid-integrating cholesterol modifications as well as fluorescent dyes. Subsequently their interaction with lipid membranes was studied. It was found that the prepared nanostructures specifically bound to lipid membranes and could diffuse on their surface, for which the rotational and translational diffusion coefficients were determined. The presence of magnesium thereby promoted the nanostructures to migrate into specific lipid domains in a reversible, switchable manner. Furthermore, their high aspect ratio allowed to investigate crowding effects, which are considered important mechanisms for the self-organisation of membrane proteins. In addition, block-shaped DNA origami nanostructures that organized into micrometre-sized super-structures were designed and produced. They were capable of deforming lipid membranes on the scale of micrometres in a similar fashion to biological counterparts. Establishing ultra-fast twist and torque measurements using DNA origami nanorotors In an additional application, DNA origami nanorotors were developed to perform ultra-fast single-molecule twist and torque measurements, allowing to resolve subtle changes in real-time. This also required the development of a new measurement setup that extended magnetic tweezers with the capability to detect the scattered light of gold nanoparticles. Hence, a complex setup was constructed and calibrated that enabled magnetic tweezers measurements with up to 4 kHz and simultaneously track gold nanoparticles at 4 kHz as well. In an alternative configuration the setup allowed simultaneous magnetic tweezers and single-molecule fluorescence and FRET measurements. DNA origami nanorotors which were embedded within DNA constructs and carried the gold nanoparticles were then obtained and used to perform ultra-fast twist and torque measurements. This constituted improvements in the spatio-temporal resolution over previous methods by one to three orders of magnitude, as demonstrated by direct measurements on the torsional response of DNA to external twists and the unwinding of DNA by an enzyme. Direct measurements of the energy landscape and dynamics of the R-loop formation by the CRISPR-Cas surveillance complex Cascade Using the DNA origami nanorotor enhanced ultra-fast twist measurements, the target recognition process of the CRISPR-Cas surveillance complex Cascade was directly observed. Effector complexes of CRISPR-Cas systems have been widely applied in genome editing recently, since they can be programmed to bind practically any genomic target by their intrinsic RNA (crRNA) component. They have, however, considerable tolerance for mismatches between their RNA and their intended DNA target. For Cascade, after binding with a protein motif to a DNA target, base-pairing between crRNA and the double-stranded DNA target is initiated, resulting in the formation of an R-loop structure which leads to unwinding of the DNA. This was directly measured using the nanorotor, which provided unprecedented insight in the R-loop formation by Cascade, allowing to determine the underlying energy landscape and the dynamics of the process. It was shown that R-loop progression occurs on 6-bp kinetic intermediate steps with an underlying single base pair stepping on fast time scales. Furthermore the effect of mutations in the target DNA on the R-loop formation process was investigated, indicating that the global shape of the energy landscape allows for a highly specific kinetic discrimination of mismatched targets. Investigations into the locking transition, a conformational change that occurs after the full formation of the R-loop and is a prerequisite for subsequent DNA degradation, completed the study. Overall, the findings provide a better understanding of the target recognition process of Cascade, which will contribute to the construction of more precise gene-editing tools in the future. Furthermore, the nanorotor-assisted measurements are applicable to many twist and torque inducing mechanisms and processes that can be investigated in further studies.:1. Introduction 2. Multifunctional magnetic tweezers 3. Applications of DNA origami 4. Ultra-Fast torque measurements on supercoiled DNA 5. R-loop dynamics of the CRISPR-Cas Cascade complex 6. Summary and Discussion Bibliography List of Figures List of Tables List of Publications A. Appendix / Die DNA Origami Methode wurde im Jahr 2006 durch Paul Rothemund begründet. Sie erlaubt es selbst-assemblierende 2D Nanostrukturen mit präzisen Geometrien und kalibrierbaren mechanischen Eigenschaften zu erstellen, die zudem mit einer Vielzahl an Funktionalisierungen ausgestattet werden können. Die Methode wurde 2009 in der Gruppe von William Shih auf 3D Nanostrukturen erweitert, wobei zudem caDNAno präsentiert wurde, eine Software die die Erstellung solcher Nanostrukturen wesentlich einfacher und zugänglicher machte. Seitdem wurden DNA Origami Nanostrukturen in vielfältigen Anwendungen genutzt, die nie dagewesene Einblicke in Mechanismen und Prozesse von biologischen Systemen auf der Nanoskala erlaubten. In dieser Arbeit wird anhand mehrerer Beispiele gezeigt, wie solche Nanostrukturen genutzt werden können, um Studien auf der Einzelmolekül-Ebene durchzuführen. Entwicklung von DNA Origami Nanostrukturen, welche die Eigenschaften und Funktionen von Membranproteinen imitieren In einer ersten Anwendung wurden DNA Origami Nanostrukturen mit definierten geometrischen und mechanischen Eigenschaften entworfen, welche das Verhalten und die Funktion von Membranproteinen nachahmten. Dazu wurden stabförmige Nanostrukturen mit präzise platzierten, lipidintegrierenden Cholesterinmodifikationen und fluoreszierenden Farbstoffen ausgestattet. Anschließend wurde ihre Interaktion mit Lipidmembranen untersucht. Es zeigte sich, dass die Nanostrukturen spezifisch an Lipidmembranen binden und auf deren Oberfläche diffundieren konnten. Hierbei wurden die Diffusionskoeffizienten der Rotations- und Translationsbewegungen bestimmt. Zudem bewirkte die An- oder Abwesenheit freier Magnesiumionen die steuerbare und reversible Anreicherung in verschiedenen Lipiddomänen. Die längliche Form der Nanostrukturen erlaubte es zudem, Verdrängungseffekte zu untersuchen, die als wichtiger Mechanismus für die Selbstorganisation von Membranproteinen gelten. Des weiteren wurden blockartige, multimerisierende DNA Origami Nanostrukturen entwickelt, die mikrometer-große Superstrukturen bilden konnten. Im ähnlichen Maße wie biologische Vorbilder, waren diese Strukturen in der Lage, Lipidmembranen über mehrere Mikrometer hinweg zu verformen. Etablierung ultraschneller Verdrehungs- und Torsionsmessungen mit DNA Origami Nanorotoren In einer weiteren Anwendung wurden DNA Origami Nanorotoren entwickelt, um ultraschnelle Einzelmolekül-Verdrehungs- und Torsionsmessungen durchzuführen, bei denen kleinste Veränderungen in Echtzeit beobachtet werden konnten. Dazu wurde eine neue Messapparatur entwickelt, bei der eine Magnetische Pinzette um die Fähigkeit Goldnanopartikeln zu detektieren erweitert wurde. Dies erlaubte die Konstruktion und Kalibrierung eines komplexen Messaufbaus, mit dem es möglich war Magnetische-Pinzetten-Messungen mit 4 kHz durchzuführen und gleichzeitig Goldnanopartikel mit ebenfalls 4 kHz zu verfolgen. Zudem konnten in einer alternativen Konfiguration Magnetische-Pinzetten-Messungen mit Einzelmolekül-Fluoreszenz- und FRET-Messungen kombiniert werden. Mit Goldnanopartikeln funktionalisierte DNA-Origami-Nanorotoren wurden anschließend in DNA-Konstrukte eingebettet und mit Hilfe des Messaufbaus für ultraschnelle Verdrehungs- und Torsionsmessungen genutzt. Gegenüber vorheriger Methoden wurde dadurch die räumlich-zeitliche Auflösung um eine bis drei Größenordnungen verbessert. Dies wurde anhand der Bestimmung der Torsionsreaktion von DNA auf Verdrehungen sowie deren Entwindung durch ein Enzym demonstriert. Direkte Bestimmung der Energielandschaft und Dynamiken der R-loop Entstehung des CRISPR-Cas Überwachungskomplexes Cascade Die entwickelten DNA Origami Nanorotoren ermöglichten zudem ultraschnelle Verdrehungsmessungen durchzuführen, um den Zielerkennungsprozess des CRISPR-Cas Überwachungskomplexes Cascade direkt zu beobachten. Effektorkomplexe von CRISPR-Cas Systemen werden zunehmend als Geneditierwerkzeuge eingesetzt, da sie aufgrund ihrer intrinsischen RNA-Komponente (crRNA) darauf programmiert werden können an praktisch jede DNA-Sequenz zu binden. Allerdings zeigen Sie eine beträchtliche Toleranz gegenüber Abweichungen zwischen der Sequenz ihrer RNA und der bestimmungsgemäßen DNA-Zielsequenz. Grundsätzlich bindet Cascade zunächst mit einem Protein-Motiv an eine kurze DNA-Sequenz, woraufhin es zur Basenpaarung zwischen der crRNA und der doppelsträngigen DNA-Zielsequenz kommt. Dabei entsteht ein R-loop, was zur Entwindung der DNA führt. Dies wurde direkt mit Hilfe der Nanorotoren gemessen, was nie dagewesene Einblicke in diesen Prozess erlaubte und die Bestimmung der zugrundeliegenden Energielandschaft und Dynamiken ermöglichte. Es wurde gezeigt, dass Längenänderungen des R-loops in kinetischen Zwischenschritten von 6 Basenpaaren erfolgen, denen Einzel-Basenpaar-Schritte auf schnelleren Zeitskalen zugrunde liegen. Des weiteren wurde der Effekt von Mutationen der DNA-Zielsequenz auf die R-loop Entstehung untersucht. Hierbei zeigte sich, dass die globale Form der Energielandschaft eine hochspezifische kinetische Differenzierung von inkongruenten Zielsequenzen erlaubt. Untersuchungen des 'locking' Mechanismus, ein struktureller Übergang der nach der vollständigen Ausbildung des R-loops erfolgt und eine Voraussetzung für die nachfolgende Zersetzung von DNA darstellt, rundeten die Untersuchungen ab. Insgesamt wurde gezeigt, dass mit Hilfe der ultraschnellen Verdrehungsmessungen, neue, detaillierte Einblicke in den Zielerkennungsprozess von Cascade gewonnen wurden, die zur Erstellung präziserer Genmanipulationswerkzeuge in der Zukunft beitragen können. Darüber hinaus eignen sich die Nanorotoren zur Untersuchung weiterer verdrehungs- und torsionserzeugender Mechanismen und Prozesse, die in weiteren Studien erforscht werden können.:1. Introduction 2. Multifunctional magnetic tweezers 3. Applications of DNA origami 4. Ultra-Fast torque measurements on supercoiled DNA 5. R-loop dynamics of the CRISPR-Cas Cascade complex 6. Summary and Discussion Bibliography List of Figures List of Tables List of Publications A. Appendix