Les résultats présentés dans ce manuscrit décrivent la synthèse et l'étude de silices hybrides organiques-inorganiques visant des applications dans le domaine de la santé. Les précurseurs polysilylés synthétisés sont des dérivés de la triazine comportant des motifs de reconnaissance moléculaire du type donneur-accepteur-donneur qui peuvent complexer des molécules complémentaires, tel que l'acide cyanurique, via des liaisons H. La préparation de matériaux hybrides à partir de ces précurseurs complexés ou non, ainsi que leur mise en forme pour obtenir des nanoparticules, sont réalisées dans des conditions nucléophiles. Ces matériaux sont sensibles aux pH puisque des pH légèrement acides peuvent entrainer la dissociation du complexe. Des précurseurs du même type sont également utilisés pour la fonctionnalisation de nanoparticules de type MCM-41 afin de créer des nanomachines. Ces dernières se sont révélées très efficaces lors d'études in vitro en présentant une mort cellulaire significative pour le cancer du sein. / In this thesis hybrid organic-inorganic silicas have been synthesized and studied for applications in health field.The synthesized polysilylated precursors are based on triazine derivatives including donor-acceptor-donor molecular recognition motifs which can complex complementary compounds, like cyanuric acid, via hydrogen bonds. Hybrid bulk materials as well as nanoparticles, with or without complex, are obtained upon nucleophilic catalysis from these precursors and are shown to be pH-sensitive since a slightly acidic pH could destabilize the complex.In addition, such type of precursors is also used to functionalize MCM-41 nanoparticles in order to prepare nanomachines. In vitro studies showed the efficiency of these systems with significant cell death for breast cancer.

Le système de sécrétion de type II (SST2) permet la sécrétion de protéines repliées à travers la membrane externe chez les bactéries à Gram-négatif. Le SST2 est une nano-machine enchâssée dans l’enveloppe bactérienne, proche par sa composition et structure aux systèmes d’assemblage des pili de type IV (PT4) impliqués, entre autres, dans d’adhésion et motilité. Chez Klebsiella oxytoca, la surexpression des gènes pul codant le SST2 permet l’assemblage de pili composées des sous-unités PulG. Ceci suggère qu’en conditions physiologiques l’assemblage d’un pseudopilus périplasmique permet la sécrétion du substrat spécifique du SST2, la pullulanase. Dans ce projet nous avons exploré le mécanisme moléculaire de l’assemblage du pseudopilus en se focalisant sur les interactions de PulG avec les composants du SST2 dans la membrane interne. En utilisant l’approche de double-hybride bactérien, nous avons établi le réseau d’interactions de PulG avec les pseudopilins mineures PulH, I, J et K et avec la plateforme d’assemblage (PA). Pour valider ces interactions, nous avons combiné des techniques de biochimie (co-purification par affinité, pontage cystéine et chimique) avec des analyses fonctionnelles de sécrétion et de formation du pseudopilus. Nous avons mis en évidence des interactions entre PulG et les protéines de la PA, PulF et PulM, et nous avons analysé en détail l’interface PulG-PulM. Les résultats suggèrent la formation d’un complexe PulK-I-J-H-G dans la membrane interne impliqué dans des étapes précoces de la formation du pseudopilus, à travers les interactions de PulG et PulH avec PulM et PulF. Nos données expérimentales suggèrent un rôle majeur de PulM dans la sécrétion, vraisemblablement durant l’assemblage du SST2 et l’élongation du pseudopilus. Nos travaux collaboratifs mettant en jeu l'analyse par spectroscopie de masse et en dynamique moléculaire in silico révèlent le rôle essentiel des résidus conservés Glu5 et Thr2 de PulG, requis pour l’interaction avec PulM. Ces données suggèrent que Glu5 participe à l'extraction de PulG de la membrane, en neutralisant la charge positive de son peptide N-terminal par des interactions intramoleculaires. Ces résultats permettent d'établir un modèle détaillant les étapes initiales de l’assemblage des pseudopili dans la membrane interne, relevant pour de futures études sur le SST2 et nanomachines homologues. sécrétion de protéinespili de type 4 assemblage de fibres complexes protéiques membranairesinteractions protéine-protéinemicroscopie à immuno-fluorescence simulations en dynamique moléculairedouble-hybride bactérien spectrométrie de masse nanomachines bacteriennes / The type II secretion system (T2SS) drives the translocation of folded, periplasmic proteins across the outer membrane in Gram-negative bacteria. Secretion is carried out by an envelope-spanning nanomachine that is similar to the apparatus that builds type IV pili (T4P), bacterial surface filaments involved in adhesion, motility and other functions. In the Pul T2SS of Klebsiella oxytoca, overexpression of pul genes in plate-grown bacteria allows the assembly of T4P-like surface fibres made of PulG subunits, suggesting that a periplasmic pseudopilus fibre plays a role in the secretion of the type II substrate pullulanase under physiological conditions. In this project, we explored the molecular mechanism of pseudopilus assembly by focusing on the interaction between PulG and the T2SS inner membrane and pseudopili components. The network of interactions of PulG with the minor pseudopilins PulH, I, J and K and the assembly platform (AP) components was established using bacterial two-hybrid analysis. To validate these interactions, we combined biochemical approaches (affinity co-purification, chemical or cysteine cross-linking) with functional assays of secretion and pseudopilus formation. We provide evidence of the interaction between PulG and the AP proteins PulF and PulM, and delve into the PulG-PulM interface. Our results point to the formation of a PulK-I-J-H-G complex in the plasma membrane involved in early steps of fibre assembly, with a determinant role for PulG and PulH interaction with PulM and PulF. We obtained experimental evidence supporting a major role for PulM in pseudopilus assembly and protein secretion, probably by intervening in the assembly of the T2SS apparatus and in pseudopilus elongation. The results of experimental and in silico studies in collaboration with experts in mass spectrometry and molecular dynamics support the essential role of the highly conserved PulG residues Glu5 and Thr2, which participate in PulM binding. In addition, Glu5 probably favours PulG membrane extraction by neutralising its N-terminal positive charge through intra-molecular interaction. These findings shed new light on early membrane events during fibre assembly, and open new and exciting avenues in research on T2SSs and related nanomachines.protein secretiontype 4 pilifibre assemblymembrane protein complexprotein-protein interactionsimmunofluorescence microscopymolecular dynamics simulationsbacterial two-hybrid assaymass spectrometrybacterial nanomachines

This dissertation describes the synthesis of molecular machines designed to operate on surfaces (nanocars) or in the solution phase (nanosubmarines), and the study of their diffusion using fluorescence techniques. The design of these molecular machines is aimed to facilitate monitoring of their movement and incorporation of a source of energy for propulsion. To complement previous scanning tunneling microscopy studies of the translation of nanocars on surfaces, chapter 1 describes the synthesis of a family of fluorescently tagged nanocars. The nanocars were functionalized with a tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC) fluorescent dye. Single-molecule fluorescence microscopy (SMFM) studies of one of these nanocars revealed that 25% of the nanocars moved on glass. The SMFM results also suggested that the dye hindered the mobility of the nanocars. Seeking to improve the mobility, chapter 2 presents the synthesis of a new set of fluorescent nanocars, featuring a 4,4-difluoro-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene (BODIPY) dye embedded in their axles. The mobility of these inherently fluorescent nanocars on glass was nearly double than that of their TRITC-tagged predecessors. Their diffusion was also studied on reactive-ion-etched glass, and amino-functionalized glass. The results showed that the mobility is affected by the substrate. To equip the nanocars with an energy input for propulsion, two nanocars functionalized with an olefin metathesis catalyst were synthesized, as described in chapter 3. The catalytic activity of these nanocars toward ring-opening metathesis polymerization (ROMP) in solution was similar to that of their parent catalysts. As an alternative approach to investigate if chemical propulsion through a ROMP process can be achieved at the molecular level, chapter 4 presents the synthesis of a fluorescent ROMP catalyst, termed a nanosubmarine, and the study of its diffusion using fluorescence correlation spectroscopy (FCS). FCS results showed an increase of 20 ± 7% in the diffusion constant of this nanosubmarine in presence of its fuel, cis,cis-1,5-cyclooctadiene. Overall, the work accomplished in this dissertation constitutes a step forward toward development of easily tracked and highly mobile nanocars, and paves the way for the synthesis of truly nanosized chemically propelled molecular machines that operate in the solution phase.

Our target is the engineering of a light-gate molecular switch for the artificial ion channel, which will enable artificial ion channels to operate successfully in microfluidic systems, biomimetic sensors and various technical devices. A stable but reversible switch mechanism design is crucial, because the artificial ion channels known to date are lacking any control mechanism. Our artificial molecular switch is divided in two parts: the body part (calixarene) and a gate part based on light-responsive azo groups. The key to the controlling mechanism is the conformational change between cis and trans isomers, which is translated into movement of the gate. The gate is very robust and can either block or let the ions pass the molecular switch. Patch clamp investigations indicate successful integrations of gated artificial ion channels into lipid membranes. / Unser Ziel ist die Entwicklung eines lichtinduzierten Molekularschalters für künstliche Ionenkanäle, der als Nanobauteil für die Entwicklung von Sensoren in mikrofluiden Systemen, in biomimetischen Sensoren und in verschiedenen technischen Baugruppen eingesetzt werden soll. Für ein stabiles und zugleich reversibles System ist der Schaltmechanismus entscheidend, da die künstlichen Ionenkanäle bisher – soweit bekannt – keinen Regelmechanismus besitzen. Unser künstlicher molekularer Schalter setzt sich aus einem Rumpfteil (Calix[4]resorcinaren) und einer Schalteinheit, basierend auf lichtempfindlichen Azogruppen, zusammen. Die Schalteinheit ist sehr widerstandsfähig, kann den Ionenfluss blockieren oder die Ionen durch den Ionenkanal passieren lassen. Durch Bestrahlung wird die Kanalaktivität unterdrückt und reversibel wiederbelebt. Mittels Patch-Clamp-Untersuchungen wird das Schalten der synthetischen Ionenkanäle überprüft.

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Our target is the engineering of a light-gate molecular switch for the artificial ion channel, which will enable artificial ion channels to operate successfully in microfluidic systems, biomimetic sensors and various technical devices. A stable but reversible switch mechanism design is crucial, because the artificial ion channels known to date are lacking any control mechanism. Our artificial molecular switch is divided in two parts: the body part (calixarene) and a gate part based on light-responsive azo groups. The key to the controlling mechanism is the conformational change between cis and trans isomers, which is translated into movement of the gate. The gate is very robust and can either block or let the ions pass the molecular switch. Patch clamp investigations indicate successful integrations of gated artificial ion channels into lipid membranes. / Unser Ziel ist die Entwicklung eines lichtinduzierten Molekularschalters für künstliche Ionenkanäle, der als Nanobauteil für die Entwicklung von Sensoren in mikrofluiden Systemen, in biomimetischen Sensoren und in verschiedenen technischen Baugruppen eingesetzt werden soll. Für ein stabiles und zugleich reversibles System ist der Schaltmechanismus entscheidend, da die künstlichen Ionenkanäle bisher – soweit bekannt – keinen Regelmechanismus besitzen. Unser künstlicher molekularer Schalter setzt sich aus einem Rumpfteil (Calix[4]resorcinaren) und einer Schalteinheit, basierend auf lichtempfindlichen Azogruppen, zusammen. Die Schalteinheit ist sehr widerstandsfähig, kann den Ionenfluss blockieren oder die Ionen durch den Ionenkanal passieren lassen. Durch Bestrahlung wird die Kanalaktivität unterdrückt und reversibel wiederbelebt. Mittels Patch-Clamp-Untersuchungen wird das Schalten der synthetischen Ionenkanäle überprüft.

Viele neue Technologien basieren auf Materialien die im Nanometerbereich strukturiert sind. Damit diese im großen Maßstab zur Anwendung gebracht werden können, werden Methoden benötigt solche nanostrukturierten Materialien kostengünstig zu produzieren. Magnetische Felder sind eine vielversprechende Möglichkeit die Anordnung von Nanostrukturen zu beeinflussen. In dieser Doktorarbeit wird eine Methode für die Herstellung magnetischer Nanostrukturen in Lösung präsentiert. Die Herstellungsmethode ist skalierbar und kostengünstig. Die synthetisierten Strukturen haben zufällige Formen und bewegen sich unter dem Einfluss eines externen rotierenden Magnetfelds im rechten Winkel zu der Ebene in der das Magnetfeld rotiert. Die dimensionslosen Geschwindigkeiten dieser zufällig geformten Propeller sind vergleichbar mit jenen früher publizierter helikaler Propeller. Das beobachtete Verhältnis zwischen Anregungsfrequenz und Propellergeschwindigkeit konnte mittels eines Drehmomentgleichgewichts verstanden werden. Dieses vertiefte Verständnis der Propellerbewegung ermöglichte eine theoretische Studie zur Kontrolle von Propellerschwärmen. Hierbei werden mehrere Propeller entlang frei wählbarer Bahnen gesteuert. Eine Kontrollstrategie wurde gefunden, welche die magnetische Feldstärke minimiert, die zum Erreichen einer vorgegebenen Genauigkeit nötig ist. Schließlich wurde das kollektive Verhalten von großen Mengen von magnetischen Propellern untersucht. Sowohl zufällig geformte als auch helikale Propeller bilden Zusammenballungen, die im dynamischen Gleichgewicht kreisförmig sind und langsam rotieren. Gleichförmig helikale Propeller ordnen sich in diesen Zusammenballungen hexagonal an. Der Vergleich zwischen Beobachtungen und Simulationen zeigte, dass hydrodynamische Interaktionen für die Bildung der Zusammenballungen nicht notwendig sind, aber dazu führen dass sich eine Randregion bildet, in der die Winkelgeschwindigkeit der Propeller erhöht ist. / New ways to cheaply produce and assemble useful micro- and nanostructures are needed to facilitate their deployment in novel technologies. Magnetic fields are a promising possibility to guide the assembly of nanostructures. This thesis presents a method to synthesize magnetic nanostructures in solution which can be actuated by external rotating magnetic fields. The synthesis method is scalable and can cheaply produce randomly shaped magnetic nanostructures in large quantities. The synthesized structures have random shapes and were observed to propel under the influence of an external magnetic field, perpendicular to the plane in which the external field is rotating. The random shapes move with dimensionless speeds that are comparable to those of previously published, nanofabricated propellers with controlled helical geometries. The observed relationship between actuating frequency and propulsion speed could be understood with a simple torque balance model. This improved understanding opened the door for a theoretical study on swarm control, i.e. the steering of several magnetic propellers along independent trajectories. A particular control strategy (critical control) was found, that minimizes the required magnetic field strength needed to achieve a certain control precision. Finally, the collective behavior of large numbers of propellers, moving upwards against gravity and towards a glass surface, was investigated. Both randomly shaped, as well as nanofabricated propellers were observed to form clusters which are circular and rotate slowly in dynamic equilibrium. The nanofabricated propellers displayed hexagonal ordering inside the clusters. Comparing the observed cluster dynamics to simulations revealed that hydrodynamic interactions between the propellers are not necessary for cluster formation, but lead to the formation of a boundary layer at the cluster edge, in which the angular velocity of the propellers is higher than in the rest of the rotating cluster.