As espécies patogênicas do gênero Colletotrichum apresentam importância mundial, pois causam danos a várias culturas de interesse agronômico. Diversas medidas de controle são empregadas, mas estas nem sempre são eficazes devido à ocorrência de linhagens resistentes. Desta forma, se faz necessário a busca por novos compostos que possam ser utilizados no manejo integrado desta doença. Os produtos naturais isolados de micro-organismos podem ser uma alternativa para o desenvolvimento de novos defensivos agrícolas. Dentre os micro-organismos, as actinobactérias são conhecidas pela produção de inúmeros compostos antimicrobianos. Neste contexto, o presente estudo teve como objetivo o isolamento e a identificação de compostos antifúngicos produzidos por actinobactérias da rizosfera de guaranazeiros. Para isto, a seleção de actinobactérias foi baseada em dois ensaios. No primeiro, as 65 actinobactérias foram avaliadas em ensaio de cultivo pareado frente ao fitopatógeno Colletotrichum gloeosporioides. Destas, os isolados mais promissores foram AM1 (43,78 % de inibição do crescimento micelial), AM3 (43,98 %), AM18 (37,86 %), AM25 (43,17 %), AM30 (47,12 %), AM61 (40,12 %) e AM68 (47,94 %). No segundo ensaio, estes isolados foram cultivados em meio BD e, após o cultivo, o meio metabólico foi submetido a três métodos de extração: (a) partição líquido-líquido com n-butanol; (b) partição líquido-líquido com acetato de etila e (c) coluna sílica gel C18. As frações obtidas a partir das três metodologias foram avaliadas pelo método de difusão em disco de papel contra C. gloeosporioides. Neste ensaio de difusão em disco foram selecionadas as linhagens AM1(n-butanol), AM3 (acetato de etila) e AM25 (C18) para o estudo de bioprospecção. Estas foram identificadas por técnicas moleculares como pertencentes ao gênero Streptomyces. A partir do extrato bruto da Streptomyces sp. AM1 foi isolado um composto análogo do ácido proclavamínico, o qual apresentou atividade mínima inibitória (MIC) de 1,25 mg mL-1 contra o fitopatógeno C. gloeosporioides. Da linhagem Streptomyces sp. AM3 foi isolado o composto streptimidona que apresentou MIC de 1,25 mg mL-1. Já no estudo de Streptomyces sp. AM25 um composto não identificado apresentou MIC de 2,50 mg mL-1. Estes três compostos apresentaram atividade superior aos fungicidas Captan SC® (Captana) e Dithane NT® (Mancozeb), e inferior ao Score® (Difenoconazol). A atividade antifúngica destes compostos ao C. gloeosporioides está sendo relatada pela primeira vez. / The pathogenic species of the genus Colletotrichum present importance worldwide because they cause damage to numerous crops of agronomic interest. Several control methods are employed, but they are not always effective due to the occurrence of resistant strains. Thus, it is necessary searching for new compounds that can be used in the integrated management of this disease. Natural products isolated from microorganisms can be an alternative for the development of new agricultural pesticides. Among microorganisms, actinobacteria are known to produce numerous antimicrobial compounds. In this context, the present study aimed to isolate and identify antifungal compounds produced by actinobacteria from guarana rhizosphere. For this, the selection of actinobacteria was based on two tests. In the first one, the 65 actinobacteria were evaluated in paired cultivation test against the plant pathogen Colletotrichum gloeosporioides. Among them, the most promising isolates were AM1 (43.78% inhibition), AM3 (43.98%), AM18 (37.86%), AM25 (43.17%), AM30 (47.12%), AM61 (40.12%) and AM68 (47.94%). In the second assay, these isolates were cultured in BD medium and, after culturing, the metabolic medium was subjected to three extraction methods: (a) liquid-liquid partition with n-butanol; (B) liquid-liquid partition with ethyl acetate and (c) silica gel column C18. The fractions obtained from the three methodologies were evaluated by paper disc diffusion method against C. gloeosporioides. In this disk diffusion assay, the strains AM1 (n-butanol), AM3 (ethyl acetate) and AM25 (C18) were selected for the bioprospecting study. These were identified by molecular techniques as belonging to the genus Streptomyces. From the crude extract of Streptomyces sp. AM1 the analogous compound proclavaminic acid was isolated, which presented minimal inhibitory activity (MIC) of 1.25 mg mL -1 against the plant pathogen C. gloeosporioides. From Streptomyces sp. AM3, the compound streptimidone was isolated, which presented MIC of 1.25 mg mL-1. In the study of Streptomyces sp. AM25 an unidentified compound had MIC of 2.50 mg mL-1. These three compounds presented superior activity to the fungicides Captan SC® (Captan) and Dithane NT® (Mancozeb), and inferior to the Score® (Difenoconazole). The antifungal activity of these compounds to C. gloeosporioides is being reported here for the first time.

Foram avaliados as atividades quimiopreventivas da β-ionona (BI) e do geraniol (GR) durante a etapa de promoção da hepatocarcinogênese. Ratos Wistar foram submetidos ao modelo de hepatocarcinogênese do \"Hepatócito Resistente\" e receberam durante 5 semanas consecutivas: 16 mg/100 g p.c. de BI, 25 mg/100 g p.c. de GR, 16 mg/100 g p.c. de BI + 25 mg/100 g p.c. de GR ou somente 25 ml/100 g p.c. de óleo de milho (grupo OM, controle). Em comparação ao grupo OM, o grupo BI apresentou menor multiplicidade de nódulos hepáticos e os grupos BI, GR e GR+BI apresentaram menor número de lesões pré-neoplásicas (LPN) persistentes e maior porcentagem de LPN em remodelação. Comparados ao grupo OM, o grupo BI apresentou menor área de LPN em remodelação e menor porcentagem da área do corte histológico ocupado por LPN persistentes enquanto o grupo GR apresentou menor porcentagem da área do corte histológico ocupado por LPN em remodelação. O tratamento com BI tendeu a reduzir o colesterol plasmático e inibir a proliferação celular em LPN. O grupo GR apresentou maior número de corpúsculos apoptóticos em LPN persistentes em comparação ao grupo OM. Comparados ao grupo OM, os grupos BI e GR+BI apresentaram menor porcentagem de LPN hepáticas em remodelação positivas para a proteína p53 citoplasmática. Já o grupo GR apresentou maior porcentagem de LPN hepáticas persistentes positivas para p53. Os níveis da proteína RhoA nas membranas celulares hepáticas foram menores no grupo GR quando comparados aos do grupo OM. Assim, BI e GR são quimiopreventivos supressores promissores da hepatocarcinogênese. / Chemopreventive activities of β-ionone (BI) and geraniol (GR) were evaluated during promotion phase of hepatocarcinogenesis. Wistar rats received GR (25 mg/100 g body weight), BI (16 mg/100 g body weight), GR (25 mg/100 g body weight) +BI (16 mg/100 g body weight) or corn oil (CO, control). Multiplicity of hepatic nodules were smaller in BI group, compared to CO group. BI, GR and GR+BI groups presented decreased number of persistent preneoplastic lesions (PNL) and increased % of remodeling PNL. BI group presented decreased % liver section area occupied by persistent and remodeling PNL. GR group presented decreased % liver section area occupied by remodeling PNL. BI group tended to present reduced cholesterol concentration and inhibited cell proliferation. GR group increased number of apoptotic bodies in persistent PNL. BI and GR+BI groups reduced the % of remodeling and increased the % of persistent p53 positive PNL. RhoA protein in cellular membranes was reduced in GR group. Thus, BI and GR could be considered as chemopreventive agents against hepatocarcinogenesis.

A manipulação seletiva de alvos epigenéticos usando pequenas moléculas inibidoras das enzimas histona-desacetilases (HDACs) e DNA metiltransferases (DNMTs) é uma estratégia para estimular a expressão das vias biossintéticas e a produção de novos metabólitos secundários em fungos. Neste trabalho, inibidores de histonadesacetilases (butirato de sódio, ácido hidroxâmico suberoilanilida e ácido valproico) e inibidores de DNA metiltransferases (5-azacitidina, hidralazina, procaína e procainamida) foram suplementados em culturas líquidas e sólidas dos fungos endofíticos Fusarium oxysporum SS46, Hyphodermella corrugata FLe8.2 e Chaetomium globosum VR10, das linhagens comerciais Fusarium oxysporum ATCC MYA 4623 e Chaetomium globosum ATCC 56726 e do fitopatógeno Botrytis cinerea B0510. O fungo endofítico H. corrugata FLe8.2, em meio PDB, produziu o composto 2-(2-metoxifenil)-4H-piran-4-ona, e sua cultura em meio Czapek suplementada com hidralazina levou ao isolamento de 3-metil-1,2,4-triazolo[3,4-a]-ftalazina. O tratamento de F. oxysporum SS46 e F. oxysporum ATCC MYA 4623 com hidralazina em meio Czapek levou ao isolamento de um novo composto, 2H-[1,2,4]triazino[3,4- a]-ftalazina. Nestas culturas houve biotransformação da hidralazina pelos fungos, provavelmente como mecanismo de desintoxicação. Ainda, a hidralazina teve um efeito inibidor sobre a biossíntese do ciclohexadepsipeptídeo beauvericina em F. oxysporum SS46. Nas culturas de C. globosum VR10 em meio Czapek os inibidores de HDACs e de DNMTs suprimiram a biossíntese de chaetoglobosinas. A adição de ácido valproico na cultura de C. globosum VR10 em meio PDB eliciou a produção da chaetoviridina B. A adição de 5-azacitidina nas culturas de C. globosum VR10 em meio sólido PDA não modificou a produção da chaetoglosina A. A produção de chaetoviridina B por C. globosum ATCC 56726 em meio PDA foi inibida na menor concentração de 5-azacitidina, 50 ?M, e retomada na concentração de 150 ?M. O tratamento de B. cinerea B0510 com ácido hidroxâmico suberoilanilida SAHA levou à biossíntese de um novo composto, ácido 5-benzil-2,3-di-hidroxi-3-isopropil-4- oxotetrahidrofuran-2-carboxílico, o qual também foi isolado da linhagem geneticamente modificada B. cinerea Bc ?STC2. No geral, considerando as linhagens fúngicas estudadas, os resultados mostram que a adição de moduladores químicos que atuam em mecanismos epigenéticos promove mudanças no perfil de metabólitos secundários. / The selective manipulation of epigenetic targets using small molecule inhibitors of histone deacetylase (HDAC) and DNA methyltransferase (DNMT) activities is a strategy to elicit the expression of biosynthetic pathways and production of new secondary metabolites in fungi. In this work, HDAC inhibitors (sodium butyrate, suberohydroxamic acid and valproic acid) and DNMT inhibitors (5-azacitidine, hydralazine, procaine and procainamide) were supplemented in liquid and solid cultures of the endophytic fungi Fusarium oxysporum SS46, Hyphodermella corrugata FLe8.2 and Chaetomium globosum VR10, of the commercial fungal strains Fusarium oxysporum ATCC MYA 4623 and Chaetomium globosum ATCC 56726 and of the phytopathogenic fungus Botrytis cinerea B0510. The endophytic fungus H. corrugata FLe8.2 produced 2-(2-methoxyphenyl)-4H-pyran-4-one in PDB medium, while in the presence of hydralazine in Czapek medium the fungus produced 3- methyl-1,2,4-triazolo[3,4-a]-phthalazine. Treatment of F. oxysporum SS46 and F. oxysporum ATCC MYA 4623 with hydralazine in a Czapek medium led to the isolation of new compound, 2H-[1,2,4]triazino[3,4-a]-phthalazine. Hydralazine was biotransformed by these three fungi probably as a detoxification strategy. In addition, hydralazine also inhibited the biosynthesis of the cyclodepsipeptide beauvericin by F. oxysporum SS46. HDAC and DNMT inhibitors suppressed chaetoglobosins\' biosynthesis by C. globosum VR10 cultures in Czapek medium. The biosynthesis of chaetoviridin B by C. globosum VR10 was elicited by acid valproic in PDB medium. The production of chaetogosin A by C. globosum VR10 in PDA medium has not been affected by 5-azacitidine. The biosynthesis of chaetoviridin B by C. globosum ATCC 56726 in PDA medium was inhibited in the presence of lower concentration 5- azacitidine (50 ?M) and recovered in the higher concentration (150 ?M). Treatment of B. cinerea B0510 with suberohydroxamic acid led to the biosynthesis of the new compound 5-benzyl-2,3-dihydroxy-3-isopropyl-4-oxotetrahydrofuran-2-carboxylic acid, which was also isolated from the genetically modified strain B. cinerea Bc ?STC2. Results showed that chemical compounds that act in epigenetic mechanisms can induce changes in the secondary metabolite profiles in the fungal strains studied in this work.

Este trabalho objetivou o estudo de rotas de formação de metabólitos secundários utilizando precursores isotopicamente marcados com 13C. Os experimentos de crescimento com adição de [1-13C]acetato, [1,2-13C2]acetato e [U-13C315N1]-L-cisteína para o fungo do ambiente marinho Penicillium sp. DRF2 mostrou que as ciclotiocurvularinas são provenientes da rota de formação de policetídeos e pela incorporação de L-cisteína, depois da transformação desta em 3-mercaptopiruvato. Os resultados sugerem que a formação das ciclotiocurvularinas provém de um processo de detoxificação da α,β-desidrocurvularina. O estudo do metabolismo secundário de Aspergillus sp. DLM3-8, também do ambiente marinho, mostrou que o seu perfil metabólico produzido em experimentos de crescimento sob diferentes condições é constante. Os experimentos de incorporação de precursores isotopicamente marcados com 13C na naftoquinonaimina, produzida por Aspergillus sp. DLM3-8 foram inconclusivos, indicando que outras abordagens experimentais devem ser realizadas para se investigar a biossíntese deste metabólito. / This investigation aimed investigated the formation routes of secondary metabolites using 13C-labelled precursors. Feeding experiments with [1-13C]acetate, [1,2-13C2]acetate and [U-13C315N1]-L-cysteine within the growth medium of the marine-derived fungi Penicillium sp. DRF2 showed that cyclothiocurvularins are derived from polyketides and from the incorporation of a L-cysteine residue, after its transformation into 3-mercaptopyruvate. The results suggest that the formation of cyclothiocurvularins is derived from a detoxification process ofα,β-dehydrocurvularin. Investigation of the secondary metabolism of a marine-derived Aspergillus sp. DLM3-8 indicated a stable metabolic profile under a variety of growth conditions. Feeding experiments with 13C-labelled precursors for the biosynthesis investigation of naphthoquinoneimine were inconclusive, indicating that other methodologies should be envisaged in order to investigate the biosynthesis of this metabolite.

Furanoeliangolidos são produtos naturais bioativos com peculiar estrutura macrocíclica. A síntese orgânica destes compostos tem despertado grande interesse por parte de vários pesquisadores. Particularmente, há alguns anos, o nosso grupo de pesquisa vem se dedicando, entre outras atividades, ao estudo de métodos sintéticos para a preparação do esqueleto estrutural dos furanoeliangolidos, mais especificamente do goiazensolido. A estrutura simplificada deste produto natural corresponde a um sistema 7-oxabiciclo[6.2.1]undecano. Este produto natural possui as seguintes atividades biológicas: esquistossomicida, citotóxica e antiinflamatória. Nossa metodologia utiliza, como etapa chave, a reação de Diels-Alder. Após a preparação do sistema policíclico, a clivagem da ligação interna dos anéis poderia fornecer o macrociclo desejado. Neste trabalho, foram estudadas três rotas sintéticas para preparação do núcleo básico dos furanoeliangolidos. Na proposta sintética inicial, a reação de Diels-Alder realizada entre o 2-metil-furano e o 3-bromopropiolato de metila, apresentou um aspecto surpreendente, uma alta regiosselevidade. A reação de anelação para formação do sistema policíclico foi investigada com três compostos diferentes. Todavia, nenhuma destas reações forneceu o produto desejado, mas sim resultaram em misturas complexas de produtos. Estes resultados revelaram a dificuldade em se realizar reações de anelação em compostos deste tipo. Outros substratos poderiam ser usados, mas considerando esses resultados insatisfatórios, nós preferimos iniciar o estudo de uma nova rota sintética. Na segunda rota, tentamos introduzir um grupo contendo três carbonos para formar o anel de seis membros, a partir de modificação na parte ?superior? da molécula (éster metílico). O aldeído intermediário pôde ser obtido com bom rendimento, mas o produto resultante da condensação aldólica deste composto com a acetona, é muito instável. A hidrólise de cetais deste tipo, conforme verificamos em experimentos com um cetal mais simples, requer tratamento com ácido forte. O produto obtido da reação aldólica, portanto não poderia resistir a essas condições, então abandonamos a rota. Na terceira rota sintética, a metodologia consistiu na construção do sistema policíclico através de duas reações de Diels-Alder e utilizando uma reação de ozonólise para clivar a dupla ligação central. A estereoquímica do aduto obtido na segunda reação de Diels-Alder foi confirmada por estudos de RMN. A ozonólise deste composto deu origem ao macrociclo desejado, contendo o núcleo estrutural dos furanoeliangolidos. Como o grupo imida presente neste macrociclo é muito resistente à hidrólise e outras reações, nós também desenvolvemos uma modificação que produz um produto mais tratável. O dieno utilizado nesta segunda reação de Diels-Alder não fornece aduto com anidrido maleico, mas ele reage bem com o acetilenodicarboxilato de dimetila dando o aduto correspondente. As duas duplas ligações deste composto são suficientemente diferentes uma da outra para permitir a ozonólise seletiva da dupla ligação central, mais nucleofílica. Nesta última rota sintética, dois macrociclos foram preparados em sete etapas, envolvendo duas reações de Diels-Alder, com rendimento total de 36,3% e 42,1%, respectivamente. / Furanoheliangolides are bioactive natural products containing a peculiar macrocyclic structure. The synthesis of these compounds has been a matter of considerable interest to several researchers. In the last few years, our research group has dedicated some efforts to develop synthetic methods for the preparation of the core structure of the furanoheliangolides, particularly goyazensolide. The core structure of this natural product corresponds to the 7- oxabicyclo[6.2.1]undecane system. This natural product has several biological activities, such as schistosomicidal, cytotoxic and anti-inflammatory. Our methodology uses, as a key step, the Diels-Alder reaction. After the preparation of the polycyclic system, the cleavage of the internal bond of the rings should furnish the desired macrocycle. In this work, three synthetic routes to the preparation of the core structure of the furanoheliangolides were studied. In the first route, the Diels-Alder reaction between 2-methylfuran and methyl 3-bromopropiolate, occurred with unusually high regioselectivity The cyclization reaction for the formation of the polycyclic system was investigated with three different compounds. However, none of these reactions furnished the desired product, but resulted instead in complex mixtures of products. These results showed the difficulty to perform cyclization reactions in compounds of this type. Other substrates could have been used, but considering these discouraging initial results, we preferred to start the studies of a new synthetic route. In the second route we were still attempting to introduce a three-carbon group to form the new six-membered ring; the main modification was that we would now start from the other side of the molecule. The aldehyde could be obtained in good yield, but the aldol reaction product of this aldehyde with the ketone is very unstable. As we have found in experiments with a simple ketal, the hydrolysis of ketals of this type require rather strong acidic treatment. Therefore, the aldol product would not withstand these conditions, so we abandoned these studies. In the third synthetic route, the methodology consisted of building the polycyclic system through two Diels-Alder reactions followed by an ozonolysis reaction to cleave the central double bond. The stereochemistry of the addut obtained in the second Diels-Alder reaction was confirmed by NMR studies. The ozonolysis of this product produced the desired core of the furanoheliangolides. As the imide group of this macrocycle is very resistant to hydrolysis and other reactions, we have also developed a modification that produces a more treatable product. The diene used in this second Diels-Alder reaction does not give Diels-Alder adduct with maleic anhydride, but it reacts well with dimethyl acetylenedicarboxylate to give correspondent addut. The two double bonds of this addut are sufficiently different from each other to permit the selective ozonolysis of the more nucleophilic central bond. In this last synthetic route, two macrocycles were prepared in seven steps, involving two Diels-Alder reactions, with overall yields of 36.3% and 42.1%, respectively.

Este trabalho descreve o estudo do metabolismo secundário em folhas diferenciadas e em suspensões celulares de Piper crassinervium (Piperaceae). Este estudo foi monitorado pela análise do extrato de folhas por CLAE, assim como pela comparação entre os diferentes tecidos desta espécie (folhas, caule e raízes). Do extrato das folhas foram isoladas duas flavanonas, duas hidroquinonas preniladas e uma hidroquinona com um endoperóxido na cadeia lateral. A análise do óleo volátil das folhas através de CG e CG-EM, revelou a presença de trinta e seis componentes, sendo majoritários o germacreno-D (10,05%) seguido por β-cariofileno (9,91 %) e 6-metil-5-hepten-2-ona (7,47%). Todas as substâncias isoladas foram submetidas ao ensaio antifúngico bioautográfico contra Cladosporium sphaerospermun, sendo que as flavanonas, as duas hidroquinonas e o óleo volátil mostraram-se ativos. As suspensões celulares foram desenvolvidas a partir de calos, iniciados a partir de ápices, em meio B5 modificado, contendo ácido naftalenoacético (ANA) e 6-benzilamino purina (BAP) como reguladores de crescimento. As células não produziram flavonóides, mas alcalóides do tipo aristolactamas, que são parcialmente excretados para o meio de cultura. A curva de crescimento estabelecida para as células foi analisada quanto à atividade específica da fenilalanina amônia-liase (PAL), à variação do pH e o acúmulo dos alcalóides. Alguns experimentos de eliciação demonstraram respostas positivas face ao uso de luz UV, adição de L-fenilalanina e uso de extratos de levedura. / The present work studies the secondary metabolism in leaves of Piper crassinervium (Piperaceae) and in its cell suspension culture as well. The profile of secondary compounds in differenciatted and undifferenciated tissues were evaluated by HPLC. The aerial parts of Piper crassinervium yielded two flavanones and three prenylated hydroquinones, one having an endoperoxide group in the side chain. The analysis of the volatile oil of Piper crassinervium by GC-MS allowed the identification of 36 compounds, germacrene-D (10,05%), β-cariofilene (9,91 %) and 6-methyl-5-heptene-2-one (7,47%) being detected as the major ones. Ali isolated substances were evaluated using a bioautography technique against the fungus Cladosporium sphaerospermun. The isolated flavanones, two hydroquinones and the essential oil were found to be active against the fungus. The cell suspensions had their growth curve established on basis of the dry weight and pH variations. The cells were showed to accumulate several aristolactams alkaloids instead. Determinations of these alkaloids by HLPC indicated that the cells excreted them partially to the culture media. Determinations of specific activity of PAL and concentration of alkaloids during the growth cycle were further performed. Additional experiments revealed that UV light and the addition of either phenylalanine or yeast extract cause elicitation response with increased production of alkaloids.

Naturstoffe sind eine der wichtigsten Quellen für die Entwicklung neuer Pharmazeutika. Eine Vielzahl von bioaktiven Substanzen mit potentieller Anti-Krebs, Anti-HIV oder antimikrobieller Wirkung wurde aus der Gruppe der Cyanobakterien isoliert. Die meisten dieser Metabolite sind Peptide oder besitzen peptid-ähnliche Strukturen und werden nicht-ribosomal von großen, modular aufgebauten Enzymkomplexen gebildet. Vor kurzem konnte anhand der Patellamide gezeigt werden, dass zyklische Peptide auch ribosomal hergestellt werden können. Microcystis aeruginosa NIES298 produziert eine Reihe von Sekundärmetaboliten, unter anderem die nicht-ribosomalen Peptide Microcystin und Aeruginosin. Zwei weiteren von diesem Stamm produzierten Peptiden, Microcyclamid und Microviridin B, konnten bislang noch keine Gene zugeordnet werden. In dieser Studie wurden ribosomale Biosynthesewege für beide Peptidfamilien identifiziert. Die zur Biosynthese des cytotoxischen Hexapeptids Microcyclamid notwendigen Enzyme zeigen eine hohe Ähnlichkeit zu den Patellamid-Enzymen und weisen auf ähnliche Biosynthesemechanismen hin. Ein völlig neuer Syntheseweg, in dem bis dahin unbekannte ATP-grasp-Ligasen eine Rolle spielen, konnte für den trizyklischen Proteaseinhibitor Microviridin gefunden werden. Die erfolgreiche heterologe Expression dieses Peptids in E. coli bietet die Möglichkeit Bibliotheken von Microviridin-Varianten mit neuen oder verbesserten Bioaktivitäten zu konstruieren. Die systematische Suche nach ähnlichen Biosynthesegenen in Microcystis Laborstämmen und Gewässerproben zeigte eine weite Verbreitung und eine große Diversität der untersuchten Peptidklassen in Cyanobakterien, und stellt die Frage nach der natürlichen Funktion dieser Metabolite. Um erste Hinweise zu erhalten, wurden Trankriptions- und Expressionsstudien der Biosynthesegene durchgeführt. Schließlich konnten, mit Hilfe des so genannten „genome-mining“, neue Varianten der untersuchten Peptidklassen gefunden und aufgeklärt werden. / Microbial natural products represent a major source for the development of new therapeutic agents. A diverse array of compounds is produced by cyanobacteria, a heterogenous group of aerobic photoautotrophs. A variety of bioactive metabolites with potential anti-cancer, anti-microbial and anti-HIV activities have been isolated. Most of the compounds are peptides or possess peptidic structures and are usually made by large nonribosomal assembly lines. However, a ribosomal origin has recently been demonstrated for the biosynthesis of patellamides, cytotoxic cyclic peptides produced by cyanobacterial symbionts of ascidians. Microcystis aeruginosa NIES298 produces various peptides including microcystin, aeruginosin, microviridin and microcyclamide. For the latter two classes of peptides ribosomal biosynthesis pathways could be identified in the course of this study. The cytotoxic hexapeptide microcyclamide is formed through the activity of a set of enzymes closely related to those involved in patellamide biosynthesis. The multicyclic microviridin family of protease inhibitors are synthesised from a precursor peptide by a unique pathway involving uncharted ATP-grasp type ligases as well as an N-acetyltransferase and a specialised transporter peptidase. The successful expression of microviridin B in E. coli provides a promising base for engineering novel variants. Screening of Microcystis laboratory strains and field samples revealed a wide-spread occurrence and a great natural variety for both peptide classes, raising the question of the ecological role of such small cyclic peptides. Attempting to obtain some first hints to answer that question, transcription and expression studies of biosynthetic genes were performed. Finally, this work showed that such scanning approaches could lead to the discovery of novel peptide variants and demonstrated new examples of succesful genome mining.

O ambiente marinho tem sido reconhecido como uma importante fonte de metabólitos secundários biologicamente ativos. Neste contexto, fungos endofíticos associados a algas ganharam importância nas últimas décadas, como alvos alternativos para a pesquisa de produtos naturais. O presente trabalho teve como o objetivo o estudo químico e biológico de duas linhagens de fungos endofíticos associados à alga vermelha Bostrychia radicans. Inicialmente foi realizada a triagem química e biológica (atividade antitumoral e antimicrobiana) dos extratos brutos das duas linhagens selecionadas, linhagens M20 (Hypocrea lixii) e M23 (Eutypella sp), obtidos a partir de cultivos em escala piloto, tanto variando-se os meios de cultivo e bem como períodos de crescimento. O extrato da linhagem M20 cultivada em arroz apresentou potencial citotóxico interessante quando submetido a ensaios utilizando células tumorais HCT-116. Ainda, após a análise química, esta linhagem foi selecionada para o cultivo em escala ampliada, visando o isolamento e elucidação estrutural dos metabólitos secundários presentes neste fungo. O estudo químico em escala ampliada da linhagem M20, espécie Hypocrea lixii, proporcionou o isolamento e identificação de quatro metabólitos: ácido 3-hidroxi-5-metóxi-6-metil-1,3-diidro-isobenzofurano-4- carboxílico (S1), 3,7-dimetóxi-6-metil-1-oxo-1,3-diidro-isobenzofurano-4-carbaldeído (S3), galactitol (S4), convolvulol (S5), além do isolamento de dois metabólitos que ainda não foram completamente elucidados, S2 e S6. Os metabólitos S1 e S3 são metabólitos inéditos como produtos naturais. Além disso, foi possível a identificação de 14 substâncias via cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM), entre elas hidrocarbonetos, ácidos graxos, inclusive insaturados, aldeídos, aldeídos ?,?-insaturados e esteróide. As substâncias S1 e S4 foram submetidas à avaliação de atividade biológica (atividade antibacteriana, antifúngica, anticolinesterásica e antitumoral), porém nenhum resultado positivo foi constatado. Foi realizada avaliação da atividade tumoral das frações da linhagem M20, e as frações M20F e M20H apresentaram atividade citotóxica seletiva para linhagens de células tumorais. Em um segundo momento foi realizado o cultivo em escala ampliada da linhagem M23 (Eutypella sp) que proporcionou o isolamento da R-5-metilmeleína (S7). Dessa forma, o estudo químico de fungos endofíticos associados à alga Bostrychia radicans mostrou-se promissor na busca de novas estruturas químicas, visto que já foram isoladas e identificadas duas estruturas inéditas como produtos naturais. / The marine environment has been recognized as an important source of biologically active secondary metabolites. In this context, endophytic fungi associated with algae gained importance in recent decades, as alternative to natural products research targets. The present work had as goal the chemical and biological study of two strains of endophytic fungi associated with red algae Bostrychia radicans. The chemical and biological screening (antimicrobial and antitumor activity) of the crude extracts of two selected strains, M20 (Hypocrea lixii) and M23 (Eutypella sp), were obtained from pilot-scale cultivation, by means of culture media and growth period variation. The M20 strain extract, grown in rice, showed an interesting cytotoxic potential front HCT -116 tumor cells and after chemical analysis, this strain was selected for cultivation on a large scale, with the purpose of secondary metabolites isolation. Chemical studies of M20 species strain Hypocrea lixii, performed on an enlarged scale, afforded the isolation and identification of four metabolites: 3-hydroxy-5-methoxy-6- methyl-1,3-dihydro-isobenzofuran-4-carboxylic acid (S1), 3,7 dimethoxy-6-methyl-1-oxo- 1,3-dihydro-isobenzofuran-4-carbaldehyde (S3), galactitol (S4), convolvulol (S5), in addition the isolation of two metabolites which have not yet been fully elucidated, S2 and S6. The S1 and S3 metabolites are novel metabolites as natural products. Furthermore, it was possible to identify 14 compounds by gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS), including hydrocarbons, fatty acids, besides unsaturated ones, aldehydes, ?,?-unsaturated aldehydes and steroid. The S1 and S4 compounds were subjected to biological activity evaluation (antibacterial, antifungal, antitumor and acetylcholinesterase potential), but without any positive result. Assessment of tumor activity of fractions of the M20 strain was performed, and the M20F and M20H fractions showed selective cytotoxicity to tumor cell lines. In a second step, the M23 strain (Eutypella sp) was grown on a large scale, resulting in the R-5-metilmeleina (S7) isolation. Thus, the chemical study of endophytic fungi associated to Bostrychia radicans algae proved to be promising concerning the search for new chemical compounds discovery, since it yielded two new structures as natural products.

O oceano apresenta uma vasta diversidade de espécies, entre elas as algas marinhas, as quais são usadas principalmente como fonte de alimentos, de produtos industriais e para uso medicinal. Considerando a biodiversidade encontrada, são poucos os estudos que verificam a composição química e atividade biológica de algas. Desta forma, o presente trabalho descreve especialmente compostos do metabolismo primário (lipídios, proteínas e aminoácidos), composição química volátil, e potencial antioxidante e antimicrobiano de quatro espécies de algas vermelhas da costa brasileira (Laurencia filiformis, Laurencia intricata, Plocamium brasiliense e Ochtodes secundiramea). As análises de lipídeos revelaram que estas algas são ricas em ácidos graxos poliinsaturados ω3 e ω6, mas que apresentam o ácido palmítico como majoritário. O teor de proteínas encontrado é considerável e aproximadamente 50% da composição de aminoácidos é de aminoácidos essenciais. Para extrair os compostos voláteis das algas selecionadas para o estudo, três métodos foram utilizados: arraste a vapor, extração por solvente e HS-SPME. A caracterização química dos compostos voláteis deu-se principalmente pela utilização de cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM). Ainda foram isolados e identificados dois compostos majoritários do óleo essencial de L. filiformis, o (-)-7-epi-silfiperfolan-6β-ol e o (-)-silfiperfolan-7β-ol, e quatro compostos do extrato acetona/água de P. brasiliense, o 3,4-eritro-7-diclorometil-3-metil-3,4,8-tricloro-1,5(E),7(E)-octatrieno; o 3,4-eritro-7-diclorometil-3-metil-3,4,8-tricloro-1,5(E),7(Z)-octatrieno; o 3,4-eritro-1-bromo-7-diclorometil-3-metil-3,4,8-tricloro-1(E),5(E),7(E)-octatrieno e o 3,4-eritro-1-bromo-7-diclorometil-3-metil-3,4,8-tricloro-1(E),5(E),7(Z)-octatrieno, utilizando diferentes técnicas cromatográficas, como CCDP e CLAE, para isolamento, e técnicas espectroscópicas (RMN uni e bidimensionais) e espectrométricas (HRMS e EIMS) para análise. A atividade antioxidante dos óleos essenciais, dos extratos e das substâncias isoladas foi verificada utilizando-se dois métodos (DPPH e quimioluminescência). Os extratos diclorometano de L. filiformis (IC50 de 48,5 µg/mL) e L. intricata (IC50 de 58,0 µg/mL) mostraram-se como os mais potentes. As mesmas amostras não apresentaram potencial antimicrobiano em concentrações de até 500 µg/mL frente aos nove microrganismos testados. / The ocean provides large diversity of species, among them the seaweeds, which are mainly used as food, industrial products and as medicine. Considering the biodiversity, there are only few studies which analize the algae volatile compounds and their biological activity. So that, this work describes specially compounds from the primary metabolism (lipids, proteins and amino acids), chemical volatile composition, and antioxidant and antimicrobial potencies of four red algae of the Brazilian coast (Laurencia filiformis, Laurencia intricata, Plicamium brasiliense and Ochtodes secundiramea). The lipid analysis showed that these algae have ω3 and ω6 polyunsaturated fatty acids, but the palmitic acid is the most abundant. The protein content observed is considerable and approximately 50% of the amino acid composition is of essential amino acids. To extract the volatile organic compounds from the algae selected for this study, three methods were used: hydrodestilation, solvent extraction and HS-SPME. For chemical characterization of the volatile compounds, the technique used was gas chromatography coupled with mass spectrometry (GC-MS). In addition, the two most abundant compounds from the essential oil of L. filiformis, the (-)-7-epi-silphiperfolan-6β-ol and the (-)-silphiperfolan-7β-ol, and four compounds of the aceton/water extract of P. brasiliense the 3,4-erythro-7-dichloromethyl-3-methyl-3,4,8-trichloro-1,5(E),7(E)-octatriene; the 3,4-erythro-7-dichloromethyl-3-methyl-3,4,8-trichloro-1,5(E),7(Z)-octatriene; the 3,4-erythro-1-bromo-7-dichloromethyl-3-methyl-3,4,8-trichloro-1(E),5(E),7(E)-octatriene and the 3,4-erythro-1-bromo-7-dichloromethyl-3-methyl-3,4,8-trichloro-1(E),5(E),7(Z)-octatriene, were isolated and identified using different chromatographic techniques like preparative TLC and HPLC for isolation and spectroscopic (NMR uni and bidimensional) and spectrometric techniques (HRMS and EIMS) for analysis. The antioxidant activity of the essential oils, of the extracts and of the isolated compounds was verified by two methods (DPPH and chemiluminescence). The dichloromethane extracts of L. filiformis (IC50 of 48.5 µg/mL) and L. intricata (IC50 de 58.0 µg/mL) showed higher potency. The same samples do not have antimicrobial activity in concentrations until 500 µg/mL up against the nine microorganisms tested.

As espécies patogênicas do gênero Colletotrichum apresentam importância mundial, pois causam danos a várias culturas de interesse agronômico. Diversas medidas de controle são empregadas, mas estas nem sempre são eficazes devido à ocorrência de linhagens resistentes. Desta forma, se faz necessário a busca por novos compostos que possam ser utilizados no manejo integrado desta doença. Os produtos naturais isolados de micro-organismos podem ser uma alternativa para o desenvolvimento de novos defensivos agrícolas. Dentre os micro-organismos, as actinobactérias são conhecidas pela produção de inúmeros compostos antimicrobianos. Neste contexto, o presente estudo teve como objetivo o isolamento e a identificação de compostos antifúngicos produzidos por actinobactérias da rizosfera de guaranazeiros. Para isto, a seleção de actinobactérias foi baseada em dois ensaios. No primeiro, as 65 actinobactérias foram avaliadas em ensaio de cultivo pareado frente ao fitopatógeno Colletotrichum gloeosporioides. Destas, os isolados mais promissores foram AM1 (43,78 % de inibição do crescimento micelial), AM3 (43,98 %), AM18 (37,86 %), AM25 (43,17 %), AM30 (47,12 %), AM61 (40,12 %) e AM68 (47,94 %). No segundo ensaio, estes isolados foram cultivados em meio BD e, após o cultivo, o meio metabólico foi submetido a três métodos de extração: (a) partição líquido-líquido com n-butanol; (b) partição líquido-líquido com acetato de etila e (c) coluna sílica gel C18. As frações obtidas a partir das três metodologias foram avaliadas pelo método de difusão em disco de papel contra C. gloeosporioides. Neste ensaio de difusão em disco foram selecionadas as linhagens AM1(n-butanol), AM3 (acetato de etila) e AM25 (C18) para o estudo de bioprospecção. Estas foram identificadas por técnicas moleculares como pertencentes ao gênero Streptomyces. A partir do extrato bruto da Streptomyces sp. AM1 foi isolado um composto análogo do ácido proclavamínico, o qual apresentou atividade mínima inibitória (MIC) de 1,25 mg mL-1 contra o fitopatógeno C. gloeosporioides. Da linhagem Streptomyces sp. AM3 foi isolado o composto streptimidona que apresentou MIC de 1,25 mg mL-1. Já no estudo de Streptomyces sp. AM25 um composto não identificado apresentou MIC de 2,50 mg mL-1. Estes três compostos apresentaram atividade superior aos fungicidas Captan SC® (Captana) e Dithane NT® (Mancozeb), e inferior ao Score® (Difenoconazol). A atividade antifúngica destes compostos ao C. gloeosporioides está sendo relatada pela primeira vez. / The pathogenic species of the genus Colletotrichum present importance worldwide because they cause damage to numerous crops of agronomic interest. Several control methods are employed, but they are not always effective due to the occurrence of resistant strains. Thus, it is necessary searching for new compounds that can be used in the integrated management of this disease. Natural products isolated from microorganisms can be an alternative for the development of new agricultural pesticides. Among microorganisms, actinobacteria are known to produce numerous antimicrobial compounds. In this context, the present study aimed to isolate and identify antifungal compounds produced by actinobacteria from guarana rhizosphere. For this, the selection of actinobacteria was based on two tests. In the first one, the 65 actinobacteria were evaluated in paired cultivation test against the plant pathogen Colletotrichum gloeosporioides. Among them, the most promising isolates were AM1 (43.78% inhibition), AM3 (43.98%), AM18 (37.86%), AM25 (43.17%), AM30 (47.12%), AM61 (40.12%) and AM68 (47.94%). In the second assay, these isolates were cultured in BD medium and, after culturing, the metabolic medium was subjected to three extraction methods: (a) liquid-liquid partition with n-butanol; (B) liquid-liquid partition with ethyl acetate and (c) silica gel column C18. The fractions obtained from the three methodologies were evaluated by paper disc diffusion method against C. gloeosporioides. In this disk diffusion assay, the strains AM1 (n-butanol), AM3 (ethyl acetate) and AM25 (C18) were selected for the bioprospecting study. These were identified by molecular techniques as belonging to the genus Streptomyces. From the crude extract of Streptomyces sp. AM1 the analogous compound proclavaminic acid was isolated, which presented minimal inhibitory activity (MIC) of 1.25 mg mL -1 against the plant pathogen C. gloeosporioides. From Streptomyces sp. AM3, the compound streptimidone was isolated, which presented MIC of 1.25 mg mL-1. In the study of Streptomyces sp. AM25 an unidentified compound had MIC of 2.50 mg mL-1. These three compounds presented superior activity to the fungicides Captan SC® (Captan) and Dithane NT® (Mancozeb), and inferior to the Score® (Difenoconazole). The antifungal activity of these compounds to C. gloeosporioides is being reported here for the first time.