A manipulação seletiva de alvos epigenéticos usando pequenas moléculas inibidoras das enzimas histona-desacetilases (HDACs) e DNA metiltransferases (DNMTs) é uma estratégia para estimular a expressão das vias biossintéticas e a produção de novos metabólitos secundários em fungos. Neste trabalho, inibidores de histonadesacetilases (butirato de sódio, ácido hidroxâmico suberoilanilida e ácido valproico) e inibidores de DNA metiltransferases (5-azacitidina, hidralazina, procaína e procainamida) foram suplementados em culturas líquidas e sólidas dos fungos endofíticos Fusarium oxysporum SS46, Hyphodermella corrugata FLe8.2 e Chaetomium globosum VR10, das linhagens comerciais Fusarium oxysporum ATCC MYA 4623 e Chaetomium globosum ATCC 56726 e do fitopatógeno Botrytis cinerea B0510. O fungo endofítico H. corrugata FLe8.2, em meio PDB, produziu o composto 2-(2-metoxifenil)-4H-piran-4-ona, e sua cultura em meio Czapek suplementada com hidralazina levou ao isolamento de 3-metil-1,2,4-triazolo[3,4-a]-ftalazina. O tratamento de F. oxysporum SS46 e F. oxysporum ATCC MYA 4623 com hidralazina em meio Czapek levou ao isolamento de um novo composto, 2H-[1,2,4]triazino[3,4- a]-ftalazina. Nestas culturas houve biotransformação da hidralazina pelos fungos, provavelmente como mecanismo de desintoxicação. Ainda, a hidralazina teve um efeito inibidor sobre a biossíntese do ciclohexadepsipeptídeo beauvericina em F. oxysporum SS46. Nas culturas de C. globosum VR10 em meio Czapek os inibidores de HDACs e de DNMTs suprimiram a biossíntese de chaetoglobosinas. A adição de ácido valproico na cultura de C. globosum VR10 em meio PDB eliciou a produção da chaetoviridina B. A adição de 5-azacitidina nas culturas de C. globosum VR10 em meio sólido PDA não modificou a produção da chaetoglosina A. A produção de chaetoviridina B por C. globosum ATCC 56726 em meio PDA foi inibida na menor concentração de 5-azacitidina, 50 ?M, e retomada na concentração de 150 ?M. O tratamento de B. cinerea B0510 com ácido hidroxâmico suberoilanilida SAHA levou à biossíntese de um novo composto, ácido 5-benzil-2,3-di-hidroxi-3-isopropil-4- oxotetrahidrofuran-2-carboxílico, o qual também foi isolado da linhagem geneticamente modificada B. cinerea Bc ?STC2. No geral, considerando as linhagens fúngicas estudadas, os resultados mostram que a adição de moduladores químicos que atuam em mecanismos epigenéticos promove mudanças no perfil de metabólitos secundários. / The selective manipulation of epigenetic targets using small molecule inhibitors of histone deacetylase (HDAC) and DNA methyltransferase (DNMT) activities is a strategy to elicit the expression of biosynthetic pathways and production of new secondary metabolites in fungi. In this work, HDAC inhibitors (sodium butyrate, suberohydroxamic acid and valproic acid) and DNMT inhibitors (5-azacitidine, hydralazine, procaine and procainamide) were supplemented in liquid and solid cultures of the endophytic fungi Fusarium oxysporum SS46, Hyphodermella corrugata FLe8.2 and Chaetomium globosum VR10, of the commercial fungal strains Fusarium oxysporum ATCC MYA 4623 and Chaetomium globosum ATCC 56726 and of the phytopathogenic fungus Botrytis cinerea B0510. The endophytic fungus H. corrugata FLe8.2 produced 2-(2-methoxyphenyl)-4H-pyran-4-one in PDB medium, while in the presence of hydralazine in Czapek medium the fungus produced 3- methyl-1,2,4-triazolo[3,4-a]-phthalazine. Treatment of F. oxysporum SS46 and F. oxysporum ATCC MYA 4623 with hydralazine in a Czapek medium led to the isolation of new compound, 2H-[1,2,4]triazino[3,4-a]-phthalazine. Hydralazine was biotransformed by these three fungi probably as a detoxification strategy. In addition, hydralazine also inhibited the biosynthesis of the cyclodepsipeptide beauvericin by F. oxysporum SS46. HDAC and DNMT inhibitors suppressed chaetoglobosins\' biosynthesis by C. globosum VR10 cultures in Czapek medium. The biosynthesis of chaetoviridin B by C. globosum VR10 was elicited by acid valproic in PDB medium. The production of chaetogosin A by C. globosum VR10 in PDA medium has not been affected by 5-azacitidine. The biosynthesis of chaetoviridin B by C. globosum ATCC 56726 in PDA medium was inhibited in the presence of lower concentration 5- azacitidine (50 ?M) and recovered in the higher concentration (150 ?M). Treatment of B. cinerea B0510 with suberohydroxamic acid led to the biosynthesis of the new compound 5-benzyl-2,3-dihydroxy-3-isopropyl-4-oxotetrahydrofuran-2-carboxylic acid, which was also isolated from the genetically modified strain B. cinerea Bc ?STC2. Results showed that chemical compounds that act in epigenetic mechanisms can induce changes in the secondary metabolite profiles in the fungal strains studied in this work.

Foram determinadas as estruturas de dois compostos naturais, um fosfato sintético, um complexo de cobre e refinada a estrutura de outro complexo de cobre. As intensidades das reflexões foram medidas com um difratômetro automático CAD-4. As estruturas foram resolvidas por métodos diretos com MULTAN-80 ou pela função de Patterson e refinadas por míninos quadrados com matriz completa. Neste trabalho apresenta-se um capítulo sobre métodos direto. Epiheineanina, C21H26N2 . C3H6 O, é um alcalóide extraído de Peschiera affinis, pertence ao sistema ortorrômbico, P212121, a= 8,626 (1), b=13,490 (4), c=19,181(3) &#197 Z= 4, do(flot)= 1,16 (1) Mg.m-3 dc=1,22 Mg.m-3, V=2232 (1) &#1973. O empacotamento molecular é constituído por tiras de moléculas interligadas por pontes de hidrogênio entre N(1) de uma molécula e 0(1) de outra relacionada com a primeira através de uma translação em Z, atuando N(1) como doador.Uma segunda ponte de hidrogênio de uma molécula de acetona presente como resultado do processo de cristalização. Acetonídeo do ácido rotúndico, C33H52O5.C6H6, foi obtido a partir do extrato etanólico de Guettarda angelica, é ortorrômbico, P212121, a= 11,353 (2), b=13,111 (4), c=24,049 (3) &#197, Z= 4, do(flot)= 1,05 Mg.m-3, dc= 1,12 Mg.m-3, V= 3580 (2) &#1973. A estrutura é constituída de 6 anéis hexagonais, com quatro em conformação de cadeira, um em meio bote e o último entre cadeira e meio bote, apresentando-se distorcido. O empacotamento é constituído por moléculas inter-ligadas por pontes de hidrogênio. Fosfato ácido de ferro tetra-hidratado, Fe2+Fe3+2 (HPO4)4. 4H2O, foi obtido por síntese hidrotérmica, é monoclínico, P21/n, &#914= 90,84(1) 0,a= 5,152 (1)0, b= 16,629 (2)0, c= 8,749(1) &#197, Z=2 fórmulas/cela, do (flot)= 2,7(1) Mg.m-3, dc=2,76 Mg.m-3, V= 749,5 (5) &#1973. Íon Fe2+ em posição especial e Íon Fe3+ ocupando posição geral, são octaedricamente coordenados por ligantes água e oxigênios dos (HPO4)&#8254 e (PO4)2-, formando um arranjo de poliedros acoplados entre si pelos vértices. As águas e os OH&#8254 participam de pontes de hidrogênio. Tetraclorocuprato de bis-ll amino undecanóico (CuCl4)2-(NH+3 - (CH2)10 - COOH) 2, foi derivado a partir do ácidoll-amino undecacóico, é triclínico, p&#8254l&#8254, a= 7,237(l), b=7,536(1), c=27,605(1) &#197, &#945= 97,98(8) o, &#946= 92,45(8) o, &#978= 90,02(8) o, Z=2, d=o= 1,35 Mg.m-3, dc= Mg.m-3, V= 1489(l) &#1973. Os dois Cu2+ em posição especial são octaedricamente coordenadas por ligantes Cl&#8254. Os octaedros, com coordenação (4+2) e (6) compartilham vértices e estão arranjados no plano da face C. Duas cadeias de aminoácidos estendem-se aproximadamente nos planos (100) e (200), dimerizadas através de suas carboxilas em torno dos centros de simetria ½, ½, ½ e 0, 0, ½. Três carbonos de uma das cadeias apresentam-se desordenados. Os carbonos e nitrogênio terminais das cadeias estão fora do plano médio das respectivas cadeias. Sulfato de cobre de bis-ll amino undecanóico TR-hidratado, [Cu(NH+ - CH2)10) COO&#8254)2] SO4.3H2O, foi derivado a partir do ácido ll-amino undecanóico, é triclínico, Pl&#8254, a=7,745(2), b=9,535 (4), c=20,343 (5) &#197, &#945= 80,91 (3)o, &#946= 79,28 (2)o, &#978= 87,58(3)o, Z=2, do(flot)= 1,38 (2) Mg.m-3, dc= 1,40 (1) Mg.m-3, V= 1460(1) &#1973. O sulfato tem coordenação tetraédrica e o Cu+2 octaédrica distorcida (4+1+1), com distâncias Cu-O longas de 2,238 e 2,785 &#197. Todos os nitrogênios e as águas participam extensivamente de pontes de hidrogênio. O conjunto de tetraedros e octaedros dispõem-se em torno no plano (0 0 1). / The structure of two natural compounds, a synthetic phosphate and a cooper complex were determined and the structure of another copper complex was refined. The reflection intensities were measured with a CAD-4 automatic diffractometer. The structures were solved by direct methods using either MULTAN-80 or the Patterson function and were refined by the least squares method, with a full matrix. Epiheyneanine, C21H26N2O3 . C3H6 O, is a alcaloid extracted from Peschiera affinis, belongs to the orthorhombic system, P212121, a= 8,626 (1), b=13,490 (4), c=19,181(3) &#197, Z= 4, do(flot)= 1,16 (1) Mg.m-3 dc=1,22 Mg.m-3, v= 2232 (1) &#1973. The molecular packing is in strips which are interlinked by hydrogen bonds between the N(1) atom of one molecule and O(1) of another which is translated along the X axis, with the nitrogen acting as the donor. A second hydrogen bond occurs between the O(1) of the first molecule and the oxigena tom of an acetone molecule present as a result of the crystallization process. Acetonide of rotundic acid, 33H52O5.C6H6, was extracted from Guettarda angélica in ethanol, is orthombic, P212121, a= 11,353 (2), b=13,111 (4), c=24,049 (3) &#197, Z= 4, do(flot)= 1,05 Mg.m-3, dc= 1,12 Mg.m-3, V= 3580 (2) &#1973. The structure consists of six hexagonal rings, with four of them in a chair conformation, one in a half boat conformation and the last is between a chair and a half conformation that is distorced. The molecular packing consists of molecules interlinked by hydrogen bonds. Tetra-hydrated iron phosphate acid, Fe2+Fe3+2+ (HPO4)4. 4H2O, was obtained by hydrothermal synthesis, is monoclinic, P21/n, &#914= 90,84(1) 0,a= 5,152 (1)0, b= 16,629 (2)0, c= 8,749(1) &#197, Z=2 fórmulas/cela, do (flot)= 2,7(1) Mg.m-3, dc=2,76 Mg.m-3, V= 749,5 (5) &#1973. The Fe2+ íon is in a special position and the Fe3+ion is in a general position, both are octahedricaly coorfinated by water and the oxygen of the (HPO4) and (PO4)2-, forming a net of polyhedral joined at the vertices. The water molecules and the OH&#8254 ions participate in the hydrogen bonds. Bis-ll amino undecanoic chlorocuprate, (CuCl4)2-(NH+3 - (CH2)10 - COOH) 2, was obtained from the ll-amino undecanoic acid, is triclinic, p&#8254l&#8254, a= 7,237(l), b=7,536(1), c=27,605(1) &#197, &#945= 97,98(8) o, &#946= 92,45(8) o, &#978= 90,02(8) o, Z=2, d=o= 1,35 Mg.m-3, dc= Mg.m-3, V= 1489(l) &#1973. The two Cu2+ ions in special position are octahedrical co-ordinated by Cl&#8254. The octahedral, with (4+2) and (6) co-ordination , share vertices and are distributed in the C face plane. Two aminoacid chains are stretched along the (1 0 0 ) and the (2 0 0 ) planes, dimerized through their carboxyl groups around the symmetry centers ½, ½, ½ and 0, 0, ½. Three carbons of one of the chains are disordered. The terminal carbons and nitrogen chains are out of the mean plane of their respective chains. Bis-ll amino undecanoic Cu(II) sulphate tri-hydrate, [Cu(NH+3.(CH2)10) COO&#8254)2] SO4.3H2O, was derived from the ll-amino undecanoic acid, is triclinic, Pl&#8254, a=7,745(2), b=9,535 (4), c=20,343 (5) &#197, &#945= 80,91 (3)o, &#946= 79,28 (2)o, &#978= 87,58(3)o, Z=2, do(flot)= 1,38 (2) Mg.m-3, dc= 1,40 (1) Mg.m-3, V= 1460(1) &#1973. The sulphate has tetrahedral co-ordination and the Cu2+ ion has distorted (4 + 1 + 1) co-ordination with Cu-O long distances of 2,238 and 2,785 &#197. All the nitrogen atoms and water molecules participate extensively in the hydrogen bonds. The tetrahedral and the octahedral groups are located around the (0 0 1) plane

A espécie vegetal Piper solmsianum (Piperaceae) é um arbusto que ocorre tanto na Mata Atlântica do Brasil quanto na Amazônia. O estudo fitoquímico aqui apresentado descreve o acúmulo dos fenilpropanóides isoelemicina, elemicina, apiol, dilapiol, mirisiticina e lignanas tetraidrofurânicas na planta adulta. Contudo, suas plântulas cultivadas e micropropagadas, com idade inferior a 9 meses, acumulam apenas fenilpropanóides. Entre as lignanas tetraidrofurânicas, a grandisina é o principal produto natural e possui potente atividade contra formas tripomastigotas de Trypanossoma cruzii, o parasita causador da Doença de Chagas. O aminoácido fenilalanina radioisotopicamente marcado é convertido nas lignanas tetraidrofurânicas. A atividade específica da enzima fenilalanina amônialiase, que converte a fenilalanina em ácido cinâmico, é dez vezes maior em plantas adultas que em plântulas. A etapa de acoplamento oxidativo que leva à formação das lignanas tetraidrofurânicas em P. solmsianum foi investigada através do E-5-metóxiisoeugenol radioisotopicamente marcado preparado por meio de uma reação de Wittig. Observou-se um acoplamento estereosseletivo e enantioespecífico formando a (-)-di-O-4,4\'-desmetilgrandisina, o precursor direto da (-)-grandisina, através do uso de preparações enzimáticas. A enzima capaz de converter o fenilpropanóide em dímero faz parte do citocromo P-450 encontrado nos microssomos celulares e é dependente de H2O2 e NADPH. Estes dados corroboram a hipótese de que os dímeros encontrados em P. solmsianum podem ser classificados como neolignanas, uma vez que são formados pelo acoplamento oxidativo de um fenilpropanóide não oxigenado na posição 9. / Piper solmsianum (Piperaceae) is a shrubb tree which occurs in both Atlantic and Rain Forests from Brazil. The phytochemical study of this species showed the accumulation of the phenylpropanoids isoelemicin, elemicin, apiol, dillapiol and myristicin and also tetrahydrofuran lignans in the adult plant. However, its cultivated and germinated seedlings of ages under 9 months accumulate phenylpropanoids only. The radioisotopically labelled aminnoacid phenylalanine is converted into tetrahydrofuran lignans. Specific activity of this enzyme, which converts phenylalanine into cinnamic acid, is ten-fold higher to adult plants than to seedlings. The oxidative coupling step which leads to the formation of the tetrahydrofuran lignans in P. Solmsianum was investigated by reaction of the isotopically labeled substrate E-5-methoxy-isoeugenol, obtained by means of a Wittig reaction, with enzyme preparations. It was observed a stereoslective and enantioespecific oxidative coupling affording (-)-di-O-4,4\'-demethyl grandisin, which is the direct precursor of (-)-grandisin. The enzyme which is able to convert the phenylpropanoid into dimer is part of cytochrome P-450 system, found in cell microssomes. This enzyme is NADPH and H2O2-dependent. These data confirm the hypothesis that these dimers found in P. Solmsianum are neolignans since they are formed by the coupling of two phenylpropanoids non-oxygenated in C-9.

Visando contribuir para o manejo de moscas-das-frutas em parreirais de uva, inicialmente determinou-se, neste estudo, a concentração limiar dos limonoides azadiractina e 3-tigloilazadiractol (AzaMax®) capaz de inibir completamente a oviposição de Ceratitis capitata em frutos de uva. Em seguida, foram averiguados os estímulos envolvidos na inibição da oviposição da praga pelos referidos limonoides. Posteriormente, avaliou-se a proteção do parreiral de uva pelos limonoides contra C. capitata no polo de produção de Petrolina/PE, Brasil. Finalmente, foi avaliada a atividade biológica residual dos limonoides sobre a praga em parreiral de uva no polo de produção de Petrolina. A concentração limiar para a completa inibição da oviposição de C. capitata se dá com 100 ppm de azadiractina (+ 28,5 ppm de 3-tigloilazadiractol) na superfície de frutos de uva. A inibição da oviposição é drástica a partir de 50 ppm de azadiractina (+ 14,3 ppm de 3-tigloilazadiractol) em situação de chance de escolha do hospedeiro. A seleção hospedeira de C. capitata não é afetada por concentração igual ou inferior a 7,5 ppm de azadiractina (+ 2,14 ppm de 3-tigloilazadiractol) na superfície de frutos de uva. A concentração limiar de 100 ppm de azadiractina (+ 28,5 ppm de 3-tigloilazadiractol) impede que o hospedeiro seja reconhecido pela praga em função dos estímulos que promovem a inquietação (irritação), locomoção e consequente dispersão da praga. Assim, os limonoides (AzaMax®) podem ser qualificados como repelentes com baixa capacidade de difusão. Os limonoides em alta concentração ocasionam mortalidade sobre C. capitata, porém não evitam que os cachos ou frutos de uva sejam injuriados e ou infestados por C. capitata numa condição de baixa população natural ou artificial em campo. As conclusões registradas corroboram a hipótese de que são necessárias mais investigações pormenorizadas para avaliação do efeito de limonoides do nim sobre C. capitata em campo. A perspectiva de controle comportamental de moscas-das-frutas utilizando limonoides do nim foi discutida, com especial referência para C. capitata em parreirais de uva. / Aiming to contribute to the management of fruit flies in the vineyards, this research initially determined the concentration threshold of limonoids azadirachtin and 3-tigloylazadirachtol (AzaMax®) able to completely inhibit oviposition of Ceratitis capitata in grape fruits. Then the stimuli involved in the inhibition of oviposition of C. capitata by these limonoids were investigated. Subsequently, we evaluated the vineyard protection by limonoids against fruit flies in the production pole of Petrolina - PE, Brazil. Finally, we evaluated the residual biological activity of limonoids on C. capitata in vineyard in the production pole of Petrolina. The threshold concentration for complete inhibition of oviposition of C. capitata is 100 ppm of azadirachtin (+ 28.5 ppm of 3-tigloylazadirachtol) on the surface of grape fruits. The inhibition of oviposition is drastic from 50 ppm of azadirachtin (+ 14.3 ppm of 3-tigloylazadirachtol) with free choice of the host. The host selection by C. capitata is not affected by concentration equal to or less than 7.5 ppm of azadirachtin (2.14 ppm of 3-tigloylazadirachtol) on the fruits surface. The threshold concentration of 100 ppm of azadirachtin (+ 28.5 ppm of 3-tigloylazadirachtol) prevents the host to be recognized by C. capitata depending of the stimuli that promote caring (irritation), locomotion and consequent dispersion of insect. Thus, the limonoids (AzaMax®) can be qualified as repellents with low diffusion capacity. The limonoids in high concentration (AzaMax®) cause mortality of C. capitata, but do not prevent the injury and or infestation on grape clusters by C. capitata in a condition of low natural or artificial population in the field. The findings reported support the hypothesis that more detailed assessment for the effect of neem limonoids on C. capitata in field investigations are necessary. The perspective of behavioral control of fruit flies using neem limonoids was discussed, with special reference to C. capitata in vineyards.

In order to continue with the study of natural products from previously isolated endophytes of the Brazilian medicinal plant Lychnophora ericoides, the main goal of this work focused on the metabolic exchange of endophytic microorganisms from this plant. As it has been demonstrated during the last years, elicitation of different molecules is consequence of microbial interactions, mainly due to the need to compete, survive and establish microbial communities in shared environments. Recent mass spectrometry related approaches, such as imaging and molecular networking, in combination with purification and structural elucidation were applied to the current study of the microbial interactions of endophytes. During this study, several chemical families were identified, such as polyene macrocycles, pyrroloindole alkaloids, leupeptins, angucyclines, siderophores, amongst others. Amongst the polyene macrocycles, the well-known antifungal amphotericin B was identified as a biosynthetic product of the endophytic actinobacteria Streptomyces albospinus RLe7. When S. albospinus RLe7 interacted with an endophytic fungus, Coniochaeta sp. FLe4, a red pigmentation was observed. A new fungal compound was detected from microbial interactions. Isolation and structure elucidation of this new compound enabled to demonstrate the elicitation of fungal secondary metabolites by amphotericin B, an actinobacterial metabolite. It was also demonstrated the elicitation of griseofulvin and its analogue dechlorogriseofulvin from another endophytic fungus, FLe9, as a consequence of exposition to amphotericin B. In addition, investigation of the chemical profile of another endophytic actinobacteria, S. mobaraensis RLe3, led to reveal this strain as angucycline-derivatives producer. Besides that, coculturing of this actinobacteria against Coniochaeta sp. FLe4 also demonstrated elicitation of angucycline analogues. In conclusion, this study demonstrated elicitation of natural products from microbial interactions as well as new compounds from endophytes from L. ericoides and contributed to the identification of microbial metabolites / Com o propósito de continuar com os estudos de produtos naturais de microorganismos endofíticos da planta medicinal Brasileira Lychnophora ericoides, o principal objetivo desse trabalho focou-se no estudo da troca metabólica de microorganismos endofíticos dessa planta. Como tem sido demonstrado durante os últimos anos, a elicitação de diferentes compostos é consequência das interações microbianas, principalmente devido à necessidade de competir, sobreviver e estabelecer comunidades microbianas em diversos ambientes naturais. Abordagens recentes de espectrometria de massas, tais como imageamento e molecular networking, junto com purificação e elucidação estrutural foram aplicadas durante o estudo de interações microbianas de endofíticos. Durante este estudo, várias classes químicas foram identificadas, tais como polienos macrocíclicos, alcaloides pirroloindólicos, leupeptinas, anguciclinas, sideróforos, entre outras. Da classe química de polienos macrocíclicos, foi identificada a anfotericina B como produto da biossíntese da actinobactéria endofítica Streptomyces albospinus RLe7. Durante a interação da S. albospinus RLe7 com o fungo endofítico Coniochaeta sp. FLe4, uma pigmentação vermelha foi observada. Um novo composto de origem fúngica foi detectado a partir de interações microbianas. O isolamento e posterior elucidação estrutural do novo composto permitiu demonstrar a eliciação de metabólitos secundários fúngicos pela anfotericina B, metabólito da actinobactéria S. albospinus RLe7. Foi também demonstrada a eliciação de griseofulvina e desclorogriseofulvina a partir de outro fungo endofítico, FLe9, como consequência da exposição à anfotericina B. Adicionalmente, a investigação do perfil químico de outra actinobactéria endofítica, S. mobaraensis RLe3, evidenciou essa linhagem como produtora de compostos da classe das anguciclinas. Além disso, o cocultivo dessa actinobacteria com o fungo endofítico Coniochaeta sp. FLe4 também eliciou análogos de anguciclinas. Em conclusão, neste estudo demonstrou-se a elicitação de produtos naturais a partir das interações microbianas assim como de novos compostos de endofíticos de L. ericoides e contribuiu-se com a identificação de metabólitos microbianos

Com o surgimento da metagenômica, a descoberta de compostos bioativos aumentou. A Arrabidaea chica é uma planta trepadeira, usada em tatuagens pelos índios. O enriquecimento da extração dos antocianosídeos através da fermentação das folhas com xilanase de Bacillus pumilus foi estudado anteriormente. A análise qualitativa da produção de xilanase por clones de bibliotecas metagenômicas e B. pumilus SG-32 e B. firmus P1-1 foi feita com a finalidade de elaborar um método miniaturizado para encontrar novas fontes dessa enzima. Bem como avaliar o seu potencial enzimático sobre os antocianosídeos. Os clones e o B. firmus não expressaram xilanases em meio sólido de xilana de bétula. Porém, o B. pumilus SG-32 expressou, como confirmado pelo atividade xilanolítica. Por isso, o caldo enzimático desta espécie foi utilizado como inóculo para o tratamento enzimático das folhas de A. chica que liberou suas antocianidianas, como confirmado pelo método de Bial e CLAE-DAD. Uma nova fonte de xilanase foi descoberta com atividade hidrolítica sobre os antocianosídeos de A. chica. / With the advent of metagenomics, the discovery of bioactive compounds increased. The Arrabidaea chica is a climbing plant, used in tattoos by the Indians. The extraction of anthocyanosides enrichment through fermentation of the leaves with xylanase from Bacillus pumilus has been studied previously. Qualitative analysis of xylanase production by clones of metagenomics libraries and B. pumilus SG-32 and B. firmus P1-1 was made in order to develop a miniaturized method to find new sources of this enzyme. And to evaluate the potential enzymatic on the anthocyanosides. The clones and the B. firmus xylanases did not express in solid birch xylan. However, B. pumilus SG-32 expressed as confirmed by the xylanolytic activity. Therefore, the broth enzymatic of this specie was used as inoculum for the enzymatic treatment of the leaves of A. chica that liberated their anthocyanidines, as confirmed by Bial method and HPLC-DAD. A new source of xylanase was discovered with hydrolytic activity on anthocyanosides from A. chica.

O ambiente marinho, pela própria diversidade orgânica que representa, tem sido reconhecido como fonte promissora de metabólitos secundários biologicamente ativos. Algas marinhas produzem grande variedade de substância terpenoídicas, aromáticas e de origem policetídica, e bioensaios têm demonstrado importante potencial biológico relativo a estes metabólitos. Micro-organismos associados às algas, tais como fungos endofíticos, também representam importante e promissora fonte de produtos naturais com esqueletos estruturalmente diversos. Bostrychia é um gênero algal fisiológica e biogeograficamente bem estudado mas são escassas as informações quanto à sua composição química, predominando a descrição de polióis e de moléculas de baixo peso molecular. Neste trabalho, os resultados da comparação dos perfis cromatográficos de espécies de Bostrychia representam uma primeira abordagem qualitativa dos constituintes polares do conjunto de espécies desse gênero ocorrentes no litoral norte do estado de São Paulo, e deverá ser complementado por meio do isolamento e identificação estrutural de seus constituintes majoritários. O isolamento de fungos endofíticos a partir de B. radicans (coletadas em ambiente de costão rochoso e manguezal) e B. tenella (coletadas no costão rochoso) possibilitou a preservação de 135 linhagens disponíveis para estudos posteriores. Dentre as linhagens isoladas de B. radicans costão, dez foram selecionadas para cultivo em meio sólido e entre estas três (C75, C81 e C82) foram selecionadas para estudos químicos e biológicos. As linhagens C81 e C82 foram identificadas por dados moleculares como Phomopsis longicolla e Penicillium brevicompactum, respectivamente. Foram isoladas e identificadas três substâncias conhecidas a partir de P. longicolla (18-deoxicitocalasina H, ácido micofenólico e dicerandrol C) e duas a partir de P. brevicompactum (ácido micofenólico e seu derivado metilado). Nos ensaios biológicos, a fração hexânica de P. longicolla apresentou alta atividade antimicrobiana (abaixo de 100g.mL-1), bem como um de seus metabólitos isolados (atividade abaixo de 10g.mL-1), frente às bactérias Staphylococcus aureus e S. saprophyticus. Esse mesmo metabólito também apresentou potencial de inibição de degranulação de mastócitos e atividade citotóxica, reforçando o potencial dos micro-organismos endofíticos na biossíntese de compostos que possam auxiliar no desenvolvimento de novos fármacos. Em conjunto, os resultados obtidos mostram que algas marinhas e fungos endofíticos associados representam uma importante área a ser explorada em relação ao potencial biológico de produtos naturais. / The marine environment, due to its organic diversity, has been recognized as a promising source of new biologically active secondary metabolites. Seaweeds produce a large variety of terpenoidic, aromatic and poliketids substances. Bioassays have been demonstrated significant biological potential concerning these metabolites. Microorganisms associated with algae, such as endophytic fungi, also represent important and promising source of natural products with molecularly-diverse structures. Bostrychia is an ecophysiology, biogeographically well-studied algal genus, but information about its chemical composition is scarce, prevailing reports about its polyol and low-molecular-weight contents. In this work, the results of the comparison of the chromatographic profiles of Bostrychia species growing in the north coast of São Paulo State represent a first qualitative approach of the polar constituent in this genus, and may be complemented by isolation and identification of their majority constituents. The isolation of endophytic fungi from B. radicans (collected in rocky shore and mangrove environment) and B. tenella (collected in the rocky shore) allowed the preservation of 135 strains available for posterior studies. Among the strains isolated from B. radicans rocky shore, ten were selected for cultivation in solid medium and three (C75, C81 e C82) were selected for chemical and biological studies. C81 and C82 strains were identified by molecular data as Phomopsis longicolla and Penicillium brevicompactum, respectively. Three known substances were isolated and identified from P. longicolla (18-deoxycytochalasin H, mycophenolic acid and dicerandrol C) and two from P. brevicompactum (mycophenolic acid and its methyl derivative). Biological assays revealed the hexanic fraction of P. longicolla presenting high antimicrobial activity (below of 100g.mL-1) against Staphylococcus aureus and S. saprophyticus, as well as one of its isolated metabolites (activity below of 10g.mL-1). This metabolite also presented mast cell degranulation inhibition and cytotoxic activity, reinforcing the potential of endophytic microorganisms in the byosinthesis of compounds that can be useful in the new drugs development. As a summary, the results show that algae and their endophytic fungi associated represent an important field to be explored in terms of biological potential of natural products.

Bostrychia tenella, proveniente dos costões rochosos da Praia Dura, no Estado de São Paulo. Para atingir este objetivo, foram realizados culturas isoladas dos microrganismos e a co-cultura entre o fungo T68 e a cianobactéria CENA139; técnicas de extração por partição volume/volume; métodos cromatográficos como cromatografia em camada delgada (CCD) e cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), bem como técnicas espectroscópicas e espectrométricas de RMN 1-D e 2-D, CL-EM, CG-EM, além de desreplicação (utilizando o banco de dados MarinLit® e o Dicionário de Produtos Naturais. Foram isoladas três substâncias do fungo estudado: Esterigmatocistina, T68ARf60_a e T68ARf60_b. A micotoxina esterigmatocistina foi isolada também a partir da co-cultura entre o fungo e a cianobactéria. Este trabalho mostrou que houve interações ecológicas competitivas na cultura mista entre Cyanobium sp. CENA139 e o fungo T68, resultando na prevalência da cultura fúngica. Para finalizar, este trabalho avaliou a atividade biológica dos extratos brutos das culturas isoladas e co-cultura, não apresentando atividade antimicrobiana. Entretanto, o extrato bruto T68 mostrou-se fototóxico nos ensaios de fototoxicidade e a substância isolada esterigmatocistina foi citotóxica e fotoxóxica no mesmo ensaio, além de exercer citotoxicidade frente à linhagem tumoral HepG2 no ensaio de citotoxicidade MTT. / This study had as main objective the evaluation of the chemical and biological profiles of two strains of microorganisms, the cyanobacteria Cyanobium sp. CENA139, from Ilha do Cardoso mangroves, São Paulo State, and the endophytic fungus T68, Xylariaceae family, isolated from the red algae Bostrychia tenella, from the rocky shores at Praia Dura, São Paulo State. To accomplish this objective, we performed isolated cultures of the microorganisms and the co-culture between the fungus T68 and the cyanobacteria CENA139; partition extraction techniques; chromatographic methods such as thin layer chromatography and high performance liquid chromatography. Also, we performed spectroscopic and spectrometric techniques of NMR 1-D and 2-D, LC-MS, GC-MS, besides dereplication using data sources as MarinLit® and the Dictionary of Natural Products. Three compounds were isolated from the endophytic fungus culture: Sterigmatocystin, T68ARf60_a and T68ARf60_b. The mycotoxin sterigmatocystin was also isolated from the co-culture. This study showed that there was competitive ecological interactions between Cyanobium sp. CENA139 and the fungus T68 in the co-culture, resulting in the prevalence of the fungal culture. Finally, this study evaluated the biological potential of the crude extract from both isolated cultures and the co-culture, not exerting antimicrobial activity. Nevertheless, the T68 crude extract was shown to be phototoxic on the phototoxicity assays and the isolated sterigmatocystin was both cytotoxic and phototoxic in the same assay, besides exerting cytotoxicity on the tumor cell line HepG2 in the MTT assay.

O estresse ambiental sobre algas marinhas pode ser causado por poluentes, ausência de nutrientes, variação da temperatura ou da intensidade luminosa. Embora vários grupos estudem os efeitos do estresse ambiental sobre a ecologia de animais marinhos, nos últimos anos, contudo, poucos pesquisadores têm investigado o seu efeito sobre a fisiologia das algas marinhas, sobretudo sobre a biossíntese e função de carotenóides e ácidos graxos. Deste modo, foram abordados experimentalmente a atividade antioxidante in vitro de alguns carotenóides encontrados em algas (determinação da constante de supressão (KQ) de oxigênio singlete (02 (1Δg)) e redução da lipoperoxidação em lipossomos incorporados com carotenóides) bem como a monitoração da biossíntese de pigmentos e os níveis de ácidos graxos em algumas espécies de algas cultivadas em situações de estresse ambiental, como exposição a metais pesados (Gracilaria tenuistipitata e Lingulodinium polyedrum), alta densidade populacional (Amphidinium cartareae, Nitzschia microcephala, Lingulodinium polyedrum, Minutocellus polymorphus e Tetraselmis gracilis), e intensidade luminosa (Lingulodinium polyedrum). Ainda, nas algas expostas a estas condições adversas, parâmetros de estresse oxidativo e indicadores enzimáticos do metabolismo oxidativo foram medidos, como a atividade de superoxido dismutase, catalase, ascorbato peroxidase, e o doseamento dos níveis de malonaldialdeído (MDA), tióis e carbonilas de proteínas. Por RMN de 1H, EM e HPLC com a co-injeção de padrões, foram identificados vários carotenos (β-caroteno e licopeno), xantofilas (peridinina, luteina, diadinoxantina, diatoxantina entre outras) e três tipos de clorofilas (a, b e c) das macro e micro algas estudadas. Paralelamente, seguindo as mesmas técnicas cromatográficas, estudamos a interconversão de tiamina com a identificação das três formas desta vitamina (livre, mono e difosfato). Nos ensaios in vitro, as KQs da peridinina, carotenóide isolado de Lingulodinium polyedrum, em dois sistemas de solventes (CDCl3: 0,95 x 109 M-1.s-1 e D20/CD3COCD3 1:1: 5,0 x 109 M-1.s-1) sugere que este pigmento apresenta uma melhor função protetora contra os efeitos deletérios do O2 (1ΔG) em ambiente hidrofílico. A presença de peridinina e astaxantina incorporadas em lipossomos preenchidos com Fe2+/EDTA foi determinante para diminuir os efeitos danosos de H202 e t-ButOOH, mostrando que a ação desses pigmentos depende da permeabilidade dos agentes oxidantes através da bicamada lipídica. Ambos carotenóides apresentaram atividade quando a peroxidação foi provocada pelo lado externo da bicamada. A concentração dos ácidos graxos em culturas de Lingulodinium polyedrum durante o ciclo claro:escuro sugee que o aumento de C18:3 e C22:6 durante a fase clara ocorreu para compensar a lipoperoxidação (os níveis de MDA foram altos durante a fase clara) e manter a integridade e homeostase celular. Em culturas de G. tenuistipitata expostas a Cd2+ e Cu2+, os níveis do ácido C20:4 (n-6) aumentaram cerca de 30% no tratamento com Cd2+, provavelmente para preservar a integridade de membrana em resposta ao desbalanço redox provocado por esse metal. Em contrapartida, os níveis de C20:4 (n-6) decaíram cerca de 15% no tratamento com Cu2+, evidenciando a especificidade desse metal em atingir as membranas tilacóides no cloroplasto. O ácido C18:3 (n-4) foi detectado apenas no tratamento com Cu2+. Os resultados encontrados para a monitoração da biossíntese de carotenóides abrem novas perspectivas para a compreensão dos mecanismos bioquímicos e fisiológicos adotados por algas marinhas cultivadas em ambientes adversos. Diferentes respostas foram encontradas para os níveis de pigmentos para as micro e macroalgas estudadas, mostrando que a biossíntese e a atividade das enzimas envolvidas no metabolismo oxidativo podem variar nas diferentes espécies e conforme o estímulo empregado. / Environmental stress on marine algae is provoked by pollutants, lack of nutrients, temperature oscillation or high light. Although some researchers have investigated environmental stress effects on marine animais ecology, lately, however, few groups have studied its effects on marine algae physiology, i.e. carotenoid function and biosynthesis and fatty acids contents. Thus, the in vitro activity, such as the quenching of 02 (1ΔG) (KQ) and the reduction of liposome peroxidation incorporated with carotenoids, of some pigments founded in algae were determined as well as the their biosynthesis when some species were growth under stressful condition, for example, heavy metal exposition (Gracilaria tenuistipitata and Lingulodinium polyedrum), cell density (Amphidinium cartareae, Nitzschia microcephala, Lingulodinium polyedrum, Minutocellus polymorphus and Tetraselmis gracilis) and high light (Lingulodinium polyedrum). In addition, some parameters of oxidative stress and enzymatic markers of oxidative metabolism such as superoxide dismutase, catalase and ascorbate peroxidase activities, malondialdehyde (MDA), protein carbonyls and thiols contents, were measured. Some carotenes (β-carotene and licopene), xanthophylls (peridinin, lutein, diadinoxanthin, diatoxanthin, etc) and three chlorophylls (a, b and c) were identified either by 1H NMR and MS or standards spiked in HPLC in the species studied. Also, using HPLC techniques, we studied the thiamine interconversion identifying three forms of this vitamin (free, mono- and diphosphate). The KQs obtained for peridinin, isolated from Lingulodinium polyedrum, using two solvent systems (CDCl3: 0,95 x 109 M-1.s-1 and D20/CD3COCD3 1:1: 5,0 x 109 M-1.s-1) suggest this pigment is more effective against the deleterious effects of O2 (1Δg) in hydrophilic environment. Peridinin and astaxanthin incorporated to liposomes filled with Fe2+/EDTA decreased the lipoperoxidation when H202 e t-ButOOH were added, showing that their function depending on the peroxidation promoters permeability through the membrane. Also, both carotenoids were able to protect the membrane when the lipoperoxidation was promoted outside. The fatty acid contents measured in cultures of L. polyedrum during the light:dark cycle suggest that the increase of C18:3 and C22:6 levels during the light phase occurred to compensate the lipoperoxidation, since the levels of MDA were high in the same phase, and to keep the membrane integrity and cell homeostasis. The levels of C20:4 (n-6) increased about 30% when cultures of G. tenuistipitata were exposed to Cd2+ may be to preserve the cell membranes in response to misbalance caused by this heavy metal. On the other hand, the levels of C20:4 (n-6) decreased almost 15% during the treatment with Cu2+, showing an evidence that this metal can affect the tilakoid membranes. The fatty acid C18:3 (n-4) was only detected in the assay with Cu2+. The carotenoid biosynthesis results bring new perspectives concerning the comprehension of the biochemistry and physiology mechanisms employed by marine algae against stressful environmental conditions. Different responses were founded for the carotenoid contents, showing that the biosynthesis and the activity of the enzymes involved in the oxidative metabolism can vary according to species or stimuli used.

Macroalgas vermelhas da espécie Bostrychia radicans (Rhodomelaceae) foram coletadas em diferentes ecossistemas de Ubatuba, litoral norte do Estado de São Paulo, mais especificamente nos costões rochosos da Praia Dura e no manguezal do Rio Escuro. Os extratos e frações obtidos dos espécimes, provenientes das duas regiões, expressaram diferentes respostas quando avaliadas as atividades tripanocida, leishmanicida, antitumoral, antifúngica e citotóxica. Estes resultados nos levaram a inferir que há uma possível relação entre as variações ambientais e a produção de metabólitos secundários biologicamente ativos nesta espécie. Concomitantemente ao estabelecimento do potencial biológico de extratos e/ou frações, foram realizadas avaliações comparativas do perfil químico da espécie B. radicans, coletada nos diferentes ecossistemas citados anteriormente. Através da comparação dos constituintes voláteis destas amostras, obtidos por microextração em fase sólida, foi possível observar diferenças significativas entre estas; sendo que a amostra proveniente dos costões apresentou uma maior diversidade de metabólitos. Em contrapartida, as análises comparativas dos constituintes apolares, realizadas por CG-EM, não revelaram diferenças significativas quanto à composição química da espécie. Com relação ao perfil cromatográfico das substâncias polares, obtido via CLAE, também foi observada semelhança quanto aos constituintes presentes em ambas as amostras. Ainda, a partir dos estudos químicos desta espécie foi possível o isolamento do colesterol e 4-hidroxi-N-(2-hidroxietil)-benzamida, além de outras substâncias isoladas em mistura, tais como: heptadecano, esqualeno, ácidos tetradecanóico e hexadecanóico, ésteres 9-octadecenoato e hexadecanoato de metila, os diterpenos trans-fitol e neofitadieno; além das substâncias aromáticas: 4-metoximetilfenol, 4-hidroxibenzaldeído, 4-hidroxibenzenoacetato de metila, 4-hidroximandelato de metila, 4-diidroxibenzenopropanoato de metila, hidroquinona, 4-hidroxibenzoato de metila, ácido 4-hidroxibenzenoacético e 4-formilcarbonilfenol. / Red macroalgae from Bostrychia radicans (Rhodomelaceae) species were collected in different ecosystems in Ubatuba, north littoral of São Paulo state, more specifically in Praia Dura rocky shores and Rio Escuro mangrove. The extracts and fractions obtained from specimens, of the two regions, expressed different responses when the trypanocide, leishmanicide, antitumoral, antifungic and citotoxic activities were evaluated. Based on these results, we could infer that there is a possible relation between the environmental variations and the production of secondary metabolites with biological activity, in this specie. At the same time, comparative analyses of chemical profiles of B. radicans from the different ecosystems were done in order to stabilish the influence of the habitat. The chemical profile of volatile compounds of B. radicans, obtained by solid phase microextraction, diverged significantly according to their habitat (mangrove or rocky shore) and the rocky shore specimens showed more variability of compounds. On the other hand, the chemical profile of apolar constituents, performed by GC-MS, were not significantly different in their midst. Concerning the chromatographic profile of polar constituents, obtained by HPLC, it was observed that these compounds were very similar. Moreover the chemical study of this species led to the isolation of cholesterol, and 4-hydroxy-N-(2-hydroxyethyl)-benzamide, and other constituents isolated together, like: heptadecane, squalene, tetradecanoic and hexadecanoic acids, methyl 9-octadecenoate and methyl hexadecanoate, trans-phytol e neophytadiene; behind the phenols: 4-metoxymethylphenol, 4-hydroxybenzaldehyde, methyl 4-hydroxybenzeneacetate, methyl 4-hydroxymandelate, methyl 4-dihydroxybenzenepropanoate, hydroquinone, methyl 4-hydroxybenzoate, 4-hydroxybenzeneacetic acid and 4-fomylcarbonyl-phenol.