Neisseria meningitidis ist ein humaner Infektionserreger, der Meningitis und Sepsis hervorruft. Das asymptomatische Trägertum im Nasenrachenraum ist entscheidend für die Übertragung des Bakteriums und dessen Interaktion mit dem menschlichen Wirt. Frühere Beobachtungen legen die Annahme nahe, dass Meningo¬kokken im Tonsillengewebe in einem biofilmähnlichen Stadium vorliegen. Daher werden in vitro Biofilme als Modell für das Trägertum verwendet. Expressionsunterschiede zwischen Biofilmen und planktonisch gewachsenen pathogenen Neisserien wurden in wenigen Transkriptomanalysen untersucht, während bisher keine Proteomanalysen durchgeführt wurden. Kartierungen des Proteoms und des Immunoproteoms von Meningokokken liegen allerdings vor. In dieser Studie wurde das Biofilmproteom des unbekapselten N. meningitidis Stammes WUE3671 im Vergleich zum Proteom der planktonisch gewachsenen Bakterien untersucht. Dazu wurde ein auf Silikonschläuchen basierendes Biofilmmodell mit kontinuierlichem Fluss etabliert. Es erfolgte eine Anreicherung bakterieller Biomasse über 48 h, wobei die kolonie-bildenden Einheiten bei 24 h ein Plateau erreichten. Licht- und Elektronen¬mikroskopie belegten die deutliche Zunahme der Biomasse über 48 h und zeigten zudem eine Struktur-ierung des 48 h Biofilms in eine apikale Region mit überwiegend vitalen Meningokokken und eine basale Region mit einer verstärkten Anzahl von Bakterien mit avitalem Erscheinungs-bild. Das Proteom von N. meningitidis Biofilmen, die 24 beziehungsweise 48 h gewachsen waren, wurde mit dem einer exponentiell gewachsenen planktonischen Kultur mit 2D-Gelelektro¬phorese verglichen. Unterschiedlich exprimierte Proteine wurden mit Massen-spektrometrie identifiziert und die Ergebnisse mit Spectral Counting und, wenn möglich, mit spezifischen Antikörpern abgesichert. Die Expression von ungefähr 2 % aller Proteinspots im Biofilm unterschied sich von der in planktonischen Zellen wenigstens um das 2-fache. Es wurden Veränderungen beobachtet, die mit einem Nährstoff- und Sauerstoffmangel sowie einer Zunahme von reaktiven Sauerstoffspezies (reactive oxygen species, ROS) in Verbindung gebracht werden können. Die Expression der Proteine SodC und MntC war im Biofilm deutlich erhöht, was mutmaßlich auf ROS im Biofilm zurückzuführen ist. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass MntC in der Tat essentiell für Biofilmwachstum, nicht aber für planktonisches Wachstum ist. Die Daten zu SodC und MntC legen die Hypothese nahe, dass Meningokokken im Biofilm trainiert werden mit Mediatoren des Immunsystems, wie ROS, umzugehen. Zudem wird NMB0573, ein Lrp-Homolog, als wesentlicher globaler Regulator für metabolische Anpassungen im Biofilm postuliert. Es konnte über die Proteomanalyse hinaus gezeigt werden, dass die Adhäsine Opc und Opa, die unter der Kontrolle von NMB0573 stehen, im Biofilm vermindert exprimiert werden. / Neisseria meningitidis is a human pathogen that causes meningitis and sepsis. Asymptomatic nasopharyngeal carriage is crucial for the transmission of the bacterium and its interaction with the human host. Previous observations led to the assumption that meningococci persist in the tonsillar tissue in a biofilm-like state. Therefore in vitro biofilms are used to model carriage. Despite successful mapping of the meningococcal proteome and immuno-proteome, no proteome and only a few transcription analyses investigated the differences between biofilm and planktonic growth in pathogenic Neisseria. This study investigated the biofilm proteome of the unencapsulated N. meningitidis strain WUE3671 in comparison to planktonically grown bacteria. A continuous flow biofilm model based on silicone tubes was established. There was an accumulation of bacterial biomass over 48 h with the number of colony forming units reaching a plateau at 24 h. Light- and electron microscopy confirmed biomass accumulation and revealed a structuring of the 48 h biofilm in an apical region with predominantly vital meningococci and a basal region with increased numbers of bacteria with avital appearance. The proteomes of N. meningitidis biofilms grown for 24 or 48 h, respectively and of exponentially grown planktonic cultures were compared by 2D-gelelectrophoresis. Differentially expressed proteins were identified by mass spectrometry. The results were confirmed by spectral counting and, if available, with specific antibodies. Approximately 2 % of all protein spots in the biofilm were at least 2 fold differentially expressed in comparison to planktonic cells. Changes related to nutrient and oxygen limitation and increase of reactive oxygen species (ROS) were observed. There was an increased expression of SodC and MntC in the biofilm that supposedly is caused by ROS in the biofilm. MntC was specifically required for meningococcal biofilm formation, but not for planktonic growth. Data for SodC and MntC suggest that meningococci in the biofilm are trained to cope with mediators of the immune system like ROS. Moreover, NMB0573, an Lrp-like global regulator, was implicated as a possible mediator of metabolic adaption in the biofilm. Independent of the proteome analysis, the NMB0573-dependent adhesions Opc and Opa were in addition shown to be down-regulated within the biofilm.

In the present thesis, two projects on the use of microarray technology for molecular epidemiology of Neisseria meningitidis have been followed. The first one evaluated microarrays based on polymorphism-directed oligonucleotide design for typing of N. meningitidis adopting the multilocus sequence typing (MLST) concept. The number of oligonucleotides needed to cover all known polymorphisms was much lower compared to the number needed if a tiling strategy would have been chosen. Initial experiments using oligonucleotides 28-32 nucleotides in length, revealed that the applied hybridisation protocols were highly specific. However, despite of several optimisation steps, the rate of misidentification of oligonucleotides remained >1.8% in consecutive validation experiments using arrays representing the genetic diversity at three MLST loci. This finding led to the assumption that the high density of polymorphic sites and extensive GC-content variations at N. meningitidis MLST loci hindered the successful implementation of MLST microarrays based on polymorphism-directed oligonucleotide design. In the 1980s, the ET-15 clone emerged within the ST-11 complex of N. meningitidis. This new clone was associated with severe meningococcal disease and outbreaks world-wide. Therefore, the goal of the second project was to identify genetic differences between ET-15 strains and other ST-11 strains using whole genome microarray technology. Three genes encoding hypothetical proteins were identified to be present in all ET-15 strains but absent in other ST-11 strains. This finding together with unpublished observation from our group suggested that several genome alterations occurred before the clonal expansion of the ET-15 clone started. The role that these three genes play in the pathogenicity of the ET-15 clone is unclear. The genome comparisons revealed furthermore that studies of the ET-15 clone displayed approximately two-fold less gene content variation than ST-11 strains not belonging to the ET-15 clone. This finding is in accordance with the recent emergence and clonal expansion of the ET-15 variant. / In der vorliegenden Doktorarbeit wurden zwei Projekte zum Einsatz der microarray-Technologie in der molekularen Epidemiologie von Neisseria meningitidis bearbeitet. Im Rahmen des ersten Projektes wurde die Einsatzmöglichkeit der microarray-Technologie unter Verwendung von Oligonukleotiden, die von bekannten Polymorphismen abgeleitet waren, für die Typisierung von N. meningitidis nach dem Prinzip der Multilokus-Sequenztypisierung (MLST) untersucht. Um alle bekannten Polymorphismen abzudecken, wurde im Vergleich zu der so genannten tiling-Methode eine deutlich geringere Anzahl an Oligonukleotiden benötigt. Vorversuche mit Oligonukleotiden einer Länge von 28-32 Nukleotiden zeigten, dass unter den angewandten Hybridisierungsbedingungen eine hohe Spezifität erzielt werden konnte. Dennoch lag die durchschnittliche Fehlidentifikationsrate der Oligonukleotide von microarrays, die die genetische Diversität von drei MLST-Loci repräsentierten, trotz mehrerer Optimierungsschritte der Oligonukleotide über 1,8%. Es ist anzunehmen, dass die hohe Dichte an Polymorphismen und die große Variation des GC-Gehaltes der MLST-Loci von N. meningitidis den erfolgreichen Einsatz eines MLST-microarrays mit Oligonukleotiden, die von bekannten Polymorphismen abgeleitet waren, verhinderten. In den achtziger Jahren des letzten Jahrhunderts tauchte der ET-15-Klon als Abkömmling des Sequenztyp (ST-) 11-Komplexes von N. meningitidis auf. Dieser neue Klon ist assoziiert mit schweren Meningokokkenerkrankungen und weltweiten Erkrankungsausbrüchen. Deshalb war es das Ziel des zweiten Projektes dieser Arbeit, genetische Unterschiede zwischen ET-15-Stämmen und anderen ST-11-Stämmen mit Hilfe von Gesamtgenom-microarrays zu identifizieren. Drei Gene, die hypothetische Proteine kodieren, waren in allen ET-15-Stämmen vorhanden, während sie in den anderen ST-11-Stämmen fehlten. Dieses Ergebnis, zusammen mit weiteren bisher nicht publizierten Beobachtungen aus unserer Arbeitsgruppe, deutet daraufhin, dass vor der klonalen Ausbreitung des ET-15-Klons mehrere Veränderungen im Genom auftraten. Die Bedeutung dieser drei Gene für die Pathogenität des ET-15-Klons ist unklar. Die Genomvergleiche zeigten weiterhin, dass Stämme des ET-15-Klons eine nur halb so große genetische Variabilität aufwiesen wie die ST-11-Stämme, die nicht zum ET-15-Klon gehörten. Dieses Ergebnis steht in Einklang mit der erst kürzlich erfolgten klonalen Expansion der ET-15-Meningokokken.

Eine Infektion durch das ausschließlich human-spezifische Pathogen Neisseria gonorrhoeae manifestiert sich bei einer symptomatischen Kolonisierung in der sog. Gonorrhö, einer venerischen Erkrankung, die durch akute Inflammation des befallenen Gewebes und durch die massive Infiltration von Granulozyten charakterisiert ist. Die Gonokokken können im Verlauf einer symptomatischen Infektion über ihre OpaCEA-Adhäsine mit CEACAM Proteinen unterschiedlicher Wirtszellen interagieren. In der vorliegenden Doktorarbeit sollten anhand verschiedener zellbiologischer, biochemischer und genetischer Methoden die molekularen Vorgänge während der OpaCEA-Gonokokken-Phagozyten-Interaktion untersucht werden. Der Kontakt von OpaCEA-Gonokokken mit primären Granulozyten induziert die Formation von Lamellipodien-ähnlichen Membranausstülpungen und führt zur CEACAM-abhängigen Phagozytose der OpaCEA Gonokokken. Schon in früheren in vitro Versuchen konnte die Reorganisation des Zytoskeletts und die Opsonin-unabhängige, CEACAM-vermittelte Aufnahme OpaCEA-exprimierender Gonokokken in differenzierte promyelomonzytären Zellen und Granulozyten mit der Stimulation von Kinasen der Src-Familie und der GTPase Rac in Verbindung gebracht werden. Erste in vitro Infektionsversuche mit CEACAM-exprimierenden 293 Zellen, in denen pharmakologische oder genetische Inhibitoren gegen Kinasen der Src-Familie eingesetzt wurden, deuteten darauf hin, dass ausschließlich die CEACAM3-vermittelte Internalisierung der Gonokokken die katalytische Aktivität von Kinasen der Src-Familie benötigt. Dies konnte auch in CEACAM3-exprimierenden, Src-Kinase defizienten Maus-Fibroblasten bestätigt werden, da nur c-Src rekonstituierte Zellen OpaCEA Gonokokken internalisieren. Die Adhäsion der OpaCEA Gonokokken an CEACAM3 induziert eine Src-abhängige Tyrosinphosphorylierung der zytoplasmatischen CEACAM3-Domäne und die Kinase selbst kann über ihre SH2-Domäne direkt an das phosphorylierte CEACAM3 binden. Auch die Stimulation der GTPase Rac verläuft über das CEACAM3 Protein, da die Expression einer dominant negativen Version der Rho GTPase ausschließlich mit der CEACAM3-, aber nicht mit der CEACAM6-abhängigen Internalisierung der OpaCEA Gonokokken interferiert. Zudem induziert nur die CEACAM3-vermittelte Aufnahme die Rekrutierung und GTP-Beladung des endogenen Rac. Eine zentrale Rolle dabei spielt die Integrität der ITAM-ähnlichen Sequenz von CEACAM3. Die Mutation beider Tyrosinreste innerhalb der ITAM-ähnlichen Sequenz oder die komplette Deletion der zytoplasmatischen Domäne inhibieren die CEACAM3-vermittelte Rac-Stimulation und blockieren die Internalisierung der OpaCEA Gonokokken. Aber nicht nur OpaCEA Gonokokken interagieren mit CEACAM3, sondern auch die CEACAM-bindenden Adhäsine von Moraxella catarrhalis und Haemophilus influenzae führen zur Rac-Stimulation und damit zur Internalisierung der Pathogene. Im letzten Teil der Arbeit konnte das molekulare Bindeglied zwischen der CEACAM3-induzierten Signalkaskade und der Stimulation der kleinen GTPase Rac identifiziert werden. Das Vav Protein fungiert dabei als GEF für die kleine GTPase Rac. Eine dominant negative Version von Vav oder eine spezifische Vav-siRNA inhibieren die CEACAM3-vermittelte Aufnahme von OpaCEA-Gonokokken bzw. die GTP-Beladung von Rac. Interessanterweise bindet das Vav Protein über seine SH2 Domäne direkt an CEACAM3 und zwar nach Phosphorylierung durch aktive Src Kinasen an den Tyrosinrest 230 der ITAM-ähnlichen Sequenz. Die distinkte CEACAM3-induzierte Signalkaskade erlaubt es, die Bedeutung von CEACAM3 für die Phagozytose CEACAM-bindender Pathogene auch in primären Granulozyten zu untersuchen. Interessanterweise inhibiert PP2 die Aufnahme der Gonokokken dosisabhängig, wohingegen die Blockade der CEACAM1- bzw. CEACAM6-vermittelten Internalisierung der Gonokokken durch Nystatin keine Auswirkungen zeigt. Auch die Proteintransduktion der dominant-negativen Version von Vav (TAT-Vav-dn) bzw. Rac (TAT-Rac-dn) in primäre Granulozyten interferierte effektiv mit der Phagozytose der OpaCEA Gonokokken. Dementsprechend verhindert ausschließlich die Blockade der CEACAM3-vermittelten Phagozytose, aber nicht der CEACAM1- bzw.CEACAM6-vermittelten Aufnahme durch monoklonale Antikörper die Internalisierung bzw. die Elimination von CEACAM-bindenden Pathogenen. Diese Arbeiten beschreiben das exklusiv auf Granulozyten exprimierte CEACAM3 Protein als einen neuen gegen CEACAM-bindende Erreger gerichteten phagozytischen Rezeptor der angeborenen Immunantwort. / The exclusivley human specific pathogen Neisseria gonorrhoeae is the causative agent of gonorrhoea a veneric disease characterized by an acute inflammation of infected area and a massive infiltration of granulocytes. During an acute, symptomatic gonorrhoeae the pathogen is able to interact with CEACAM proteins of different cells by the means of their so called OpaCEA-adhesins. In this doctaral thesis the pathogen-phagocyte-interaction was to be investigated by cell biology, biochemical and genetical methods. The contact of OpaCEA-expressing gonococci with primary granulocytes induces ruffling of the membrane and lammelipodia-like protrusion finally leading to the CEACAM-dependent phagocytosis of the pathogenic bacteria. Earlier infection-studies with pro-myelomonocytic cells were able to show that the phenotypic cytoskeleton rearrangement and the internalisation of gonococci was dependet on the stimulation of Src-family kinases and the small GTPase Rac. Initial in vitro infection studies with transiently transfected human epithelial 293 cells showed that exclusively CEACAM3-mediated internalisation of OpaCEA-expressing gonococci depends on the catalytic activity of Src-family kinases. This was further corroborated by infecting CEACAM3-expressing, genetic manipulated S-/Y-/F--deficient mouse fibroblasts with gonococci, as only cells reconstituted with c-Src were able to internalise OpaCEA-expressing gonococci. Bacterial ligation of CEACAM3 leads to Src-family kinase dependent tyrosin phosphorylation within the cytoplasmatic-tail of CEACAM3 and on the molecular level the kinase itself is able to directly interact with phosphorylated CEACAM3 via its SH2-domain. Accordingly, stimulation of the small GTPase Rac is connected to bacterial CEACAM3 ligation, as expression of a dominant negative Rac constructs only interferes with CEACAM3, but not with CEACAM6 mediated internalisation of gonococci. In addition recruitment of Rac to adhering bacteria and Rac stimulation is dependent on CEACAM3 mediated uptake and expression of the OpaCEA-adhesins. A critical part of CEACAM3 mediated signal transduction turned out to be it’s ITAM like sequence. Either mutation of both tyrosine residues or deletion of the whole cytoplasmatic tail inhibited CEACAM3-mediated Rac stimulation and accordingly internalisation of OpaCEA-expressing gonococci. However CEACAM3-mediated internalisation is not restricted to gonococci as CEACAM-binding Moraxella catarrhalis and Haemophilus influenzae also stimulate Rac-GTP-loading while taken up via CEACAM3. In the last part of the doctoral thesis I was able to identify the molecular link between Rac stimulation and bacterial CEACAM3 engagement. Vav serves as a specific GEF towards the stimulation of the small GTPase Rac, as a dominant negative version of Vav or a specific Vav-siRNA blocks CEACAM3-mediated uptake of OpaCEA-expressing gonococci and GTP-loading of Rac respectively. Vav directly binds to CEACAM3 via it’s SH2 domain leading to a CEACAM3-Vav protein complex after phosphorylation of tyrosinresidue 230 of CEACAM3. by stimulated Src-family kinases. The uniqueness of CEACAM3-initiated signal transduction provided a method to identify it’s relevance during phagocytosis of CEACAM binding bacteria in primary human granulocytes. Especially the pharmacological inhibitor PP2 interferes in a concentration dependent manner with the uptake of gonococci in granulocytes while Nystatin which inhibits CEACAM1 and CEACAM6 dependent internalisation in vitro has no effect on bacterial uptakte in human granulocytes. Accordingly, interference of CEACAM3 mediated stimulation of Vav (TAT-Vav-dn) or Rac (Tat-Rac-dn) inhibited uptake of OpaCEA-gonococci into primary cells. In addition a CEACAM3-specific but not a CEACAM1 or CEACAM6 specific monoclonal antibody inhibited internalisation and elimination of CEACAM-binding bacteria. Therefore, the results presented in this doctoral thesis describe CEACAM3 which is exclusively expressed on human granulocytes as a novel single-chain phagocytic receptor of the innate immune system.

MSc (Med), Faculty of Health Sciences, University of the Witwatersrand, 2011 / Despite being a fulminant pathogen, Neisseria meningitidis (meningococcus) is part of the commensal flora of the human nasopharynx. Globally, five meningococcal serogroups (A, B, C, Y and W135) cause the majority of invasive disease. Most serogroup B cases occur sporadically but may be endemic or epidemic within a geographic region. In South Africa, there are limited data on invasive serogroup B clones and the antigenic diversity of certain meningococcal outer membrane proteins. This study examined the molecular epidemiology of serogroup B meningococci in South Africa from 2002 through 2006. Invasive meningococcal isolates were submitted to a national laboratory-based surveillance system. For this study, serogroup B isolates were characterised by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE), PorA, FetA and multilocus sequence (MLST) typing. PorA, FetA and multilocus sequence (MLST) typing were performed on all 2005 isolates (n=58) and randomly selected isolates from other years (n=25). A total of 2144 invasive cases were reported over the study period. Of these, 76% (1627/2144) had viable isolates available for serogrouping and 307 (19%) were serogroup B. Serogroup B cases were reported from across the country however the majority were from the Western Cape province. The highest incidence of serogroup B was in children less than 5 years of age. Isolates displayed a high level of diversity by PFGE. Despite this diversity the majority of serogroup B meningococci collected over the 5-year period could be grouped into several clonal clusters representative of global invasive MLST clonal complexes. Overall, the most predominant MLST clones in South Africa were ST-32/ET-5 and ST-41/44/lineage 3. In addition, at least 19 PorA types and 16 FetA types were determined among selected isolates. Globally invasive serogroup B disease is caused by heterogeneous strains however, prolonged outbreaks in several countries have been due to strains of the ST-32/ET-5 and ST-41/44/lineage 3 clonal complexes. At present, serogroup B disease in South Africa is not dominated by an epidemic clone, however, global clonal complexes ST-32/ET-5 and ST-41/44/lineage 3 are circulating in Western Cape and Gauteng, respectively.

Neisseria lactamica, uma bactéria comensal não patogênica, predominantemente humana e usualmente encontrada no trato respiratório superior de crianças, está intimamente relacionada a Neisseria meningitidis patogênica. A colonização com N. lactamica pode ser responsável pelo envolvimento da imunidade natural contra a infecção pelos meningococos em crianças pequenas, quando as taxas de portadores de meningococos são baixas. Estas características levam a sugerir que os componentes de N. lactamica possam ser um elemento-chave para a produção de uma nova vacina para N. meningitidis. Devido ao pouco conhecimento sobre a dinâmica dos portadores e sobre a diversidade da população de N. lactamica em crianças, tem sido difícil escolher um isolado representativo para preparar um adequado produto imunogênico. Em nosso estudo, foi proposto um protocolo para estudar a imunogenicidade de whole cells de N. lactamica, N. meningitidis, N. sicca ou N. meningitidis c (isoladas de portadores), através da imunização intranasal em coelhos, considerando a via de entrada natural do patógeno. Isolados da orofaringe de N. lactamica, N. meningitidis, N. sicca ou N. meningitidis c, foram inoculados em coelhos adultos pela via intranasal, numa concentração de densidade ótica 1.0 a 650nm, num volume de 1000 ?L. Os coelhos foram imunizados por quatro vezes em intervalos de sete dias. Também foram usadas cepas como N. subflava, N. elongata, N. sicca, N. perflava, N. mucosa isoladas do líquido cérebro-espinhal ou sangue de pacientes. Os coelhos desenvolveram níveis de anticorpos IgG específicos no soro, como foi determinado por ELISA usando whole cells de cepas homólogas e heterólogas. O soro dos coelhos imunizados com N. lactamica, N. meningitidis, N.sicca ou N. meningitidis c, apresentaram anticorpos IgG que reagiram com antígenos numa faixa de 5 a 130 kDa por meio de immunoblot. Os anticorpos presentes nos soros dos coelhos imunizados com N. lactamica não induziram altos títulos de anticorpos com atividade bactericida contra as cepas de N. meningitidis, no entanto, esta atividade pode ser observada com anticorpos produzidos pelos coelhos imunizados intranasalmente com N. meningitidis. Anticorpos IgG de alta avidez foram produzidos, embora não tenha sido determinada uma significativa correlação entre atividade bactericida e a indução de anticorpos IgG de alta avidez, principalmente nos coelhos imunizados com N. lactamica. A imunização RESUMO intranasal usando whole cells de N. lactamica foi adequada para sensibilizar eficientemente o sistema imune de mucosa no modelo coelho. / Neisseria lactamica, a commensal bacterium non-pathogenic to human beings and usually found in the upper respiratory tract of children, is closely related to pathogenic Neisseria meningitides. Colonization with N. lactamica can be responsible for evolving natural immunity to meningococcal infection in childhood, when rates of meningococcus carriers are low. These features lead to suggest that N. lactamica components can be key-elements in the production of a new vaccine for N. meningitides. As little is known about dynamic carriers and N. lactamica population diversity in children, it has been difficult choosing a representative for preparing an adequate immunogenic product. A protocol was proposed to study immunogenicity of whole cells of N. lactamica, N. meningitidis, N. sicca or N. meningitides c (carrier-isolated) by i.n. immunization in rabbits considering the natural pathogen entry route. Oropharinx-isolated N. lactamica, N. meningitidis, N. sicca, or N. meningitides c were i.n. inoculated into adult rabbits, in a concentration of optical density 1.0 at 650nm in a volume of 1000 ?L. The rabbits were immunized four times at seven-day intervals. N. subflava, N. elongata, N. sicca, N. perflava, N. mucosa strains isolated from CSF and blood from patients were also used. The rabbits developed levels of specific lgG antibodies in serum, as determined by ELISA using whole cells of homologous and heterologous strains. Serum from rabbits immunized with N. lactamica, N. meningitidis, and N. sicca or N. meningitides c, presented lgG antibodies reactive to 5 to 130 kDa antigens on immunoblot. Antibodies in serum from rabbits immunized with N. lactamica failed to induce high concentration of antibodies with bactericidal activity against N. meningitidis; however, this activity could be observed with antibodies produced by rabbits i.n. immunized with N. meningitidis. High avidity lgG antibodies were produced, although a significant correlation between bactericidal activity and induction of lgG antibodies of high avidity could not be determined, mainly in rabbits immunized with N. lactamica. Intranasal immunization of N.lactamica whole cells was suitable to efficiently sensitize mucosal immune system in rabbit model.

Development of a broadly cross-protective capsular group B meningococcal (MenB) vaccine has been hampered by poor capsular immunogenicity and often diverse and poorly cross-protective subcapsular antigens. The MenB MC58 strain genome has facilitated the discovery of novel, relatively conserved vaccine candidates. The four-component MenB (4CMenB) investigational vaccine contains factor H-binding protein (fHbp; variant 1), neisserial heparin-binding antigen (NHBA), Neisserial adhesin A (NadA) and PorA P1.4-containing outer membrane vesicles. The latter are known to elicit protection against homologous strains. Clinical trials have demonstrated protective responses in infants and adults against isolates expressing homologous PorA or fHbp (subvariant 1.P1), or heterologous NadA (variant 2). Cross-protective responses have also been demonstrated in adults and, to a lesser extent, infants, against isolates expressing heterologous fHbp variant 1 subvariants. The contribution of NHBA is still poorly understood. MenB currently accounts for 87% of invasive meningococcal disease in England and Wales. The proportion of disease due to the ST-269 clonal complex (cc269) peaked at 45.6% in 2006 and is currently approximately 24.2%. The aims of this study were (i) to genotypically assess potential 4CMenB coverage against recent English and Welsh invasive disease isolates and, specifically, cc269 isolates from England and Wales and other countries, (ii) to compare phenotypic expression levels of the 4CMenB antigens (excluding PorA) among typical cc269 isolates, and (iii) to assess 4CMenB responses against typical cc269 isolates among healthy adults administered 4CMenB.Full length alleles for fHbp variant 1, NHBA and NadA variants 1, 2 and 3 were present in 64.6%, >99% and 7.1%, respectively, of English and Welsh invasive disease isolates from 2007/8. Between 67.5% and >99% (adults) or 25.7% and 43.5% (infants) of the isolates were predicted to be covered by 4CMenB. cc269 comprised two antigenically distinct lineages (clusters) centred around ST-269 and ST-275, respectively. These accounted for 57% and 40% of cc269 in 2007/8. Both clusters effectively lacked nadA and PorA P1.4. The predominant fHbp;NHBA profiles represented by the respective clusters were 1.P15;P0021 and (1.P13 or 2.P19);P0017. Between 77.4% and 100% (adults) or 2.2% and 27.1% (infants) of cc269 isolates from 2007/8 were predicted to be covered by 4CMenB. Estimates for infants were conservative due to e.g. the exclusion of NHBA. Serum bactericidal antibody (SBA) analyses targeting typical fHbp variant 1-expressing cc269 strains, indicated high levels of coverage among adults administered 4CMenB. Notable differences among genotypically matched isolates e.g. in terms of SBA geometric mean titres, were not reflected in the relative fHbp and NHBA expression levels. Such differences may lead to conflicting estimates of coverage in infant populations. Whilst these are investigated further it seems prudent to use typical isolates giving mid-range responses when assessing SBA, and therefore protection, among infants. Potential 4CMenB coverage of cc269 and the broader meningococcal population in England and Wales was high among adults and encouraging among infants when compared to that of existing MenB vaccines.

Philosophiae Doctor - PhD / Neisseria meningitidis (the meningococcus), the causative agent of meningococcal disease (MD) was identified in 1887 and despite effective antibiotics and partially effective vaccines, Neisseria meningitidis (N. meningitidis) is the leading cause worldwide of meningitis and rapidly fatal sepsis usually in otherwise healthy individuals. Over 500 000 meningococcal cases occur every year. These numbers have made bacterial meningitis a top ten infectious cause of death worldwide. MD primarily affects children under 5 years of age, although in epidemic outbreaks there is a shift in disease to older children, adolescents and adults. MD is also associated with marked morbidity including limb loss, hearing loss, cognitive dysfunction, visual impairment, educational difficulties, developmental delays, motor nerve deficits, seizure disorders and behavioural problems. Antimicrobial peptides (AMPs) are molecules that provide protection against environmental pathogens, acting against a large number of microorganisms, including bacteria, fungi, yeast and virus. AMPs production is a major component of innate immunity against infection. The chemical properties of AMPs allow them to insert into the anionic cell wall and phospholipid membranes of microorganisms or bind to the bacteria making it easily detectable for diagnostic purposes. AMPs can be exploited for the generation of novel antibiotics, as biomarkers in the diagnosis of inflammatory conditions, for the manipulation of the inflammatory process, wound healing, autoimmunity and in the combat of tumour cells. Due to the severity of meningitis, early detection and identification of the strain of N. meningitidis is vital. Rapid and accurate diagnosis is essential for optimal management of patients and a major problem for MD is its diagnostic difficulties and experts conclude that with an early intervention the patient’ prognosis will be much improved. It is becoming increasingly difficult to confirm the diagnosis of meningococcal infection by conventional methods. Although polymerase chain reaction (PCR) has the potential advantage of providing more rapid confirmation of the presence of the bacterium than culturing, it is still time consuming as well as costly. Introduction of AMPs to bind to N. meningitidis receptors could provide a less costly and time consuming solution to the current diagnostic problems. World Health Organization (WHO) meningococcal meningitis program activities encourage laboratory strengthening to ensure prompt and accurate diagnosis to rapidly confirm the presence of MD. This study aimed to identify a list of putative AMPs showing antibacterial activity to N. meningitidis to be used as ligands against receptors uniquely expressed by the bacterium and for the identified AMPs to be used in a Lateral Flow Device (LFD) for the rapid and accurate diagnosis of MD.

Wie das pathogene Bakterium Neisseria meningitidis kolonisiert auch Neisseria lactamica als Kommensale den oberen Nasopharynx des Menschen. Penicillin G ist ein first-line-Therapeutikum gegen Meningokokkeninfektionen. Reduzierte Empfindlichkeit gegenüber Penicillin wird bei Meningokokken durch Mutationen im penA-Gen verursacht. Horizontaler Gentransfer zwischen den verschiedenen Neisseria spp. wurde auch für das penA-Gen beschrieben. Ziel dieser Arbeit war daher eine phänotypische und genotypische Analyse der Penicillinresistenz von N. lactamica. Aus den Versuchen sollten Prognosen über die zukünftige Resistenzentwicklung von Meningokokken abgeleitet werden. Die phänotypische Analyse von 123 N. lactamica-Stämmen (MIC [Minimum inhibitory concentration]-Bereich: 0,064 – 2,0 µg/ml, Median: 0,38 µg/ml) und 129 N. meningitidis- Stämmen (MIC-Bereich: 0,016 – 0,25 µg/ml, Median: 0,064 µg/ml) zeigte signifikant höhere MIC-Werte gegenüber Penicillin G bei den N. lactamica-Stämmen als bei den untersuchten Meningokokken. Bei Meningokokken sind Polymorphismen (fünf spezifische Mutationen betreffend) im penA-Gen (kodiert für das PBP2 (penicillin binding protein 2)) für verminderte Penicillinsensibilität verantwortlich, weshalb der betroffene Abschnitt des penA-Gens in allen N. lactamica-Stämmen und N. meningitidis-Stämmen untersucht und mit den bekannten Allelen der penA-Datenbank verglichen wurde. Bei den 123 N. lactamica-Stämmen konnten 60 verschiedene penA-Allele nachgewiesen werden, wovon 51 neu in die internationale penA-Datenbank eingefügt werden konnten. Im Gegensatz zu Meningokokken trugen die N. lactamica-Stämme entweder drei oder fünf der für intermediär resistente Meningokokken charakteristischen Mutationen im penA-Gen. N. lactamica-Stämme mit fünf Mutationen (MIC-Bereich: 0,25 – 2,0 µg/ml, Median: 0,5 µg/ml) zeigten signifikant höhere MIC-Werte als Stämme mit drei Mutationen (MIC-Bereich: 0,064 – 0,38 µg/ml, Median: 0,125 µg/ml), aber auch als Meningokokken mit fünf Mutationen (MIC-Bereich: 0,064 – 0,25 µg/ml, Median: 0,125 µg/ml). Eine phylogenetische Analyse aller in der penA-Datenbank hinterlegten Allele zusammen mit den 51 neuen dieser Studie ergab, dass die Allele mit fünf Mutationen unabhängig von der Spezies eine gemeinsame phylogenetische Linie bildeten, während sowohl die Allele mit drei Mutationen (N. lactamica) als auch die ohne Mutationen (N. meningitidis) jeweils eine separate phylogenetische Gruppe formten. Im Rahmen von in vitro-Transformationen mit chromosomaler DNA von N. lactamica konnte der MIC-Wert des Penicillin-sensiblen Meningokokkenstamms 14 in einem single-step-Ereignis durch Übernahme des betreffenden penA-Gens von N. lactamica erhöht werden. Allerdings konnten nur MIC-Werte erreicht werden, die mit intermediär-sensiblen Meningokokken vergleichbar waren und somit weit unter den MIC-Werten der benutzten N. lactamica-Stämme lagen. Dieser Befund legt nahe, dass erhöhte MIC-Werte bei N. lactamica wie auch bei Meningokokken mit Mutationen in der Transpeptidaseregion des PBP2 assoziiert sind. Jedoch sind die im Vergleich zu Meningokokken generell höheren MIC-Werte bei N. lactamica auf andere Faktoren zurückzuführen, die bei N. lactamica eine verminderte Empfindlichkeit gegenüber Penicillin bedingen. In den in vitro-Experimenten der vorliegenden Studie konnten diese Faktoren nicht auf Meningokokken übertragen werden. Demnach kann eine Co-Kolonisation mit N. lactamica zwar die MIC-Werte von Meningokokken erhöhen, das Erreichen von bei N. lactamica beobachteten Resistenzniveaus ist allerdings auf diesem Wege nicht möglich. Es ist somit nicht zu befürchten, dass Meningokokken – wie bei Pneumokokken beobachtet – über kommensale Spezies der gleichen Gattung eine massive Reduktion der Empfindlichkeit gegenüber Penicillin entwickeln werden. / Neisseria lactamica colonises the human upper nasopharynx together with the pathogen bacteria Neisseria meningitidis. Penicillin G remains a first line therapy against meningococcal disease. Reduced penicillin susceptibility in N. meningitidis is caused by mutations in penA-gene. Horizontal gene transfer between Neisseria spp. has been described for the penA-gene as well. The aim of this study was to provide a phenotypic and genotypic analysis of penicillin resistance in N. lactamica. Moreover, implications about future developments of penicillin resistance in meningococci should be derived. A phenotypic analysis of 123 N. lactamica-isolates (MIC [Minimum inhibitory concentration]-range: 0.064 – 2.0 µg/ml, median: 0.38 µg/ml) and 129 N. meningitidis-isolates (MIC-range: 0.016 – 0.25 µg/ml, median: 0,064 µg/ml) showed significantly higher MIC values in N. lactamica. Five specific polymorphisms in penA-gene (encoding for PBP2 (penicillin binding protein 2)) are responsible for reduced penicillin susceptibility in meningococci. Therefore the penA-gene of all isolates in this study was analysed and compared with the registered alleles in the penA-database. Sixty different penA-alleles were found in the 123 N. lactamica-isolates of this study. Fifty-one of these alleles could not be found in the penA-database and were added to the database during this study. Unlike N. meningitidis, the analysed N. lactamica-isolates harbored either three or five of the mutations in penA-gene, which are typical for intermediate susceptible meningococci. N. lactamica-isolates with five mutations (MIC-range: 0.25 – 2.0 µg/ml, median: 0.5 µg/ml) showed significantly higher MIC-values than N. lactamica-isolates with three mutations (MIC-range: 0.064 – 0.38 µg/ml, median: 0.125 µg/ml), but also than meningococci with five mutations (MIC-range: 0.064 – 0.25 µg/ml, median: 0.125 µg/ml). A phylogenetic analysis of the 51 new alleles in this study together with all alleles of the penA-database showed, that alleles with five mutations grouped together independently of the species they came from, whereas alleles with three mutations (N. lactamica) as well as alleles without mutations (N. meningitidis) formed separate phylogenetic lines. In vitro-transformations with chromosomal DNA from N. lactamica could raise the MIC-value of the susceptible meningococcus a14 in a single step event by receiving the penA-allele from N. lactamica. However, the MIC-values observed in these transformants were only comparable to those in intermediate susceptible meningococci but considerably below the values of the N. lactamica-isolates used for the transformation. The results of this study showed that high MIC-values in N. lactamica as well as in N. meningitidis are associated with mutations in the transpeptidase region of PBP2. However, the generally higher MIC-values in N. lactamica must be attributed to other factors. These factors could not be transferred to meningococci in this study. As a result of this study it can be stated that co-colonisation with N. lactamica might raise MIC-values in N. meningitidis. However, considerable reductions of penicillin susceptibility by horizontal gene transfer from commensal spezies of the same genus (as observed in pneumococci) cannot be expected for N. meningitidis.

Neisseria gonorrhoeae is a human-specific pathogen that causes gonorrhea. It is defined as a super bacterium by the WHO due to the emergence of gonococci that are resistant to a variety of antibiotics and a rapidly increasing infection incidence. Genome-wide investigation of neisserial gene essentiality and novel virulence factors is urgently required in order to identify new targets for anti-neisserial therapeutics. To identify essential genes and new virulence factors, a high-density mutant library in N. gonorrhoeae MS11 was generated by in vitro transposon mutagenesis. The transposon library harbors more than 100,000 individual mutants, a density that is unprecedented in gonococcal research. Essential genes in N. gonorrhoeae were determined by enumerating frequencies of transposon insertion sites (TIS) with Illumina deep sequencing (Tn-seq). Tn-seq indicated an average distance between adjacent TIS of 25 bp. Statistical analysis unequivocally demonstrated 781 genes that were significantly depleted in TIS and thus are essential for Neisseria survival. A subset of the genes was experimentally verified to comprise essential genes and thus support the outcome of the study. The hereby identified candidate essential genes thus may constitute excellent targets for the development of new antibiotics or vaccines. In a second study, the transposon mutant library was applied in a genome-scale “negative-selection strategy” to identify genes that are involved in low phosphate-dependent invasion (LPDI). LPDI is dependent on the Neisseria porin subtype PorBIA which acts as an epithelial cell invasin in absence of phosphate and is associated with severe pathogenicity in disseminated gonococcal infections (DGI). Tn-seq demonstrated 98 genes, which were involved in adherence to host cells and 43 genes involved in host cell invasion. E.g. the hypothetical protein NGFG_00506, an ABC transporter ATP-binding protein NGFG_01643, as well as NGFG_04218 encoding a homolog of mafI in N. gonorrhoeae FA1090 were experimentally verified as new invasive factors in LPDI. NGFG_01605, a predicted protease, was identified to be a common factor involved in PorBIA, Opa50 and Opa57-mediated neisserial engulfment by the epithelial cells. Thus, this first systematic Tn-seq application in N. gonorrhoeae identified a set of previously unknown N. gonorrhoeae invasive factors which demonstrate molecular mechanisms of DGI. / Neisseria gonorrhoeae ist ein human-spezifisches Pathogen, das die Krankheit Gonorrhoe verursacht. Aufgrund der steigenden Anzahl antibiotikaresistenter Gonokokken und der damit verbundenen, rapide zunehmenden Anzahl von Infektionen erklärte die WHO Gonokokken 2012 zum Superbakterium. Daher ist eine genomweite Untersuchung der neisseriellen Genessentiatialität und neuer Virulenzfaktoren dringend erforderlich, um neue Ziele für die antineisserielle Therapie zu identifizieren. Hierzu wurde eine high-density Mutantenbibliothek in N. gonorrhoeae MS11 durch in vitro Transposonmutagenese generiert. Die Transposonbibliothek enthält mehr als 100.000 individuelle Mutanten - eine Dichte, die in der Gonokokken-Forschung beispiellos ist. Essentielle Gene von N. gonorrhoeae wurden durch die Ermittlung der Häufigkeit von Transposon insertion sites (TIS) mit Hilfe von Illumina deep sequencing (Tn-seq) bestimmt. Tn-seq ergab eine durchschnittliche Distanz von 25 Basenpaaren zwischen benachbarten TIS. Die statistische Analyse zeigte eindeutig 781 Gene, die signifikant weniger TIS aufwiesen und deshalb als essentiell für das Überleben der Neisserien verstanden werden können. Für ausgewählte Gene wurde experimentell bestätigt, dass sie essentielle Gene beinhalten, wodurch das Ergebnis der Tn-seq unterstützt wird. Die hierbei identifizierten essentiellen Gene könnten exzellente Targets für die Entwicklung neuer Antibiotika oder Impfstoffe darstellen. In einer zweiten Studie wurde die Transposon Mutanten Bibliothek für eine genomweite „negative Selektionsstrategie“ bereitgestellt. Es sollten Gene identifiziert werden, die an der phosphatfreien Invasion (low phosphate-dependent invasion = LPDI) beteiligt sind. Die LPDI ist vom neisseriellen Porin Subtyp PorBIA abhängig, welches bei Epithelzellen in Abwesenheit von Phosphat als Invasin fungiert und mit einer schweren Pathogenität in disseminierenden Gonokokkeninfektionen (DGI) assoziiert ist. Tn-seq ergab 98 Gene, die an der Adhärenz an die Wirtszelle, und 43 Gene, die an der Wirtszellinvasion beteiligt waren. Zum Beispiel wurden das hypothetische Protein NGFG_00506, ein ABC Transporter, das ATP-bindende Protein NGFG_01643, wie auch NGFG_04218, das für ein Homolog von mafI in N. gonorrhoeae FA1090 kodiert, experimentell als neue Invasionsfaktoren in der LPDI verifiziert. NGFG_01605, bei dem angenommen wird, dass es sich um eine Protease handelt, wurde als ein allgemeiner Faktor identifiziert, der an der PorBIA-, Opa50- and Opa57-vermittelten Einstülpung der Membran von Epithelzellen beteiligt ist. Die erste systematische Anwendung von Tn-seq in N. gonorrhoeae identifizierte eine Reihe bisher unbekannter Invasionsfaktoren von N. gonorrhoeae, die molekulare Mechanismen der DGI zeigen.

Die Interaktion mit Gehirnendothelzellen stellt ein zentraler Schritt in der Infektionspathogenese von Neisseria meningitidis dar. In dieser Promotionsarbeit konnte gezeigt werden, dass die Infektion von menschlichen Gehirnendothelzellen mit N. meningitidis zu einer transienten Aktivierung der sauren Sphingomyelinase (ASM) gefolgt von einer vermehrten Ceramidproduktion führt. Als Antwort auf die Infektion mit N. meningitidis kommt es zu einer vermehrten Präsentation der ASM und von Ceramiden an der äusseren Seite der Plasmamembran und zu einer Ausbildung von großen Ceramid-reichen Membran-Domänen, welche mit cortical plaque assoziierten Proteinen kolokalisieren. Bei dieser N. meningitids vermittelten Aktivierung der ASM spielt das bakterielle Aussenmembranprotein Opc sowie die Aktivierung der Phosphatidylcholin-spezifische Phospholipase C über die Interaktion von Opc mit Heparansulfat-Proteoglykane eine entscheidende Rolle. Die pharmakologische oder genetische Inhibition der ASM Funktion führt zu einer geringeren Invasivität der Meningokokken ohne dabei die Adhärenz zu beeinflussen. Im Einklang mit diesen Ergebnissen steht die Beobachtung, dass die geringere Invasivität von ausgewählten Isolaten des ST-11/ST-8 Komplex in menschlichen Gehirnendothelzellen direkt mit ihrer eingeschränkter Fähigkeit korreliert, die ASM zu aktivieren bzw. eine Ceramidproduktion zu induzieren. Schlussfolgernd ist die ASM Aktivierung und eine nachfolgende Ceramidproduktion essenziell für die Internalisierung von Opc-exprimierende Meningokokken in Gehirnendothelzellen und bietet einen Erklärungsansatz für die unterschiedliche Invasivität von verschiedenen N. meningitidis Stämmen. / The interaction with brain endothelial cells is central to the pathogenicity of Neisseria meningitidis infections. Here, we show that N. meningitidis causes transient activation of acid sphingomyelinase (ASM) followed by ceramide release in brain endothelial cells. In response to N. meningitidis infection, ASM and ceramide are displayed at the outer leaflet of the cell membrane and condense into large membrane platforms which also colocalize with cortical plaque associated proteins. The outer membrane protein Opc and phosphatidylcholine-specific phospholipase C that is activated upon binding of the pathogen to heparan sulfate proteoglycans, are required for N. meningitidis-mediated ASM activation. Pharmacologic or genetic ablation of ASM abrogated meningococcal internalization without affecting bacterial adherence. In accordance, the restricted invasiveness of a defined set of pathogenic isolates of the ST-11/ST-8 clonal complex into brain endothelial cells directly correlated with their restricted ability to induce ASM and ceramide release. In conclusion, ASM activation and ceramide release are essential for internalization of Opc-expressing meningococci into brain endothelial cells, and this segregates with invasiveness of N. meningitidis strains.