Aging human brains are prone to neurodegenerative disorders, the most common being the Alzheimer’s disease (AD). Currently, there is no cure for AD, and patients progressively lose neurons leading to reduction in the brain mass. Humans cannot circumvent and counteract this disease. For instance, chronic inflammation that manifests through mild to late stages of the pathology cannot be resolved. The synaptic degeneration that underlies cognitive decline cannot be reversed. As a general outcome, neurons deteriorate and new neurons cannot replace the lost ones. This is in part due to reduced proliferative and neurogenic ability of neural stem cells (NSCs), which normally produce neurons, albeit rather a limited lineage. Recently, in AD patients, neurogenic outcome was shown to reduce dramatically (Moreno-Jimenez et al., 2019; Tobin et al., 2019). This lack of neurogenic input from NSCs in human brains is emerging as a new aspect through which we might find a chance to counteract AD. One prominent question is to find ways to re-activate our NSCs in pathology conditions. Zebrafish is known to have a remarkable regenerative ability enabling it to regenerate its brain as well. Zebrafish brain possesses several neurogenic regions that harbor NSCs to allow continuous neurogenesis throughout adulthood and during regeneration. Radial glial cells in the zebrafish brain act as NSCs that respond to neuronal damage by enhancing brain plasticity and initiating neuroregeneration. Special molecular mechanisms are involved in activating NSCs to form new neurons and initiate the regenerative response. In my PhD project, I aimed to identify such regenerationassociated molecular mechanisms in AD-like neurodegenerative conditions. To investigate the molecular programs that mediate regenerative response in neurodegenerative conditions, we first generated an amyloid-mediated neurodegeneration model in adult zebrafish to mimic certain pathophysiological aspects of AD. We used synthetic Amyloid-β-42 (Aβ42) peptides and injected into the zebrafish brain using cerebroventricular microinjection (CVMI) method. These peptides were tagged with robust cell-penetrating peptide, which were previously shown to efficiently deliver cargo molecules into the zebrafish brain. This approach led to an acute model of neurodegeneration in which Aβ42 deposition was prominent in neurons in adult zebrafish brain, and also exhibited phenotypes reminiscent of human AD5 pathophysiology: apoptosis, inflammation, synaptic degeneration, and cognitive deficits. In contrast to the mammals, zebrafish brain induced the NSC proliferation and enhanced the neurogenesis to initiate a regenerative response. To identify the mechanisms behind this response, we performed whole-RNA transcriptome analyses, which revealed that several genes associated with immune-related signaling pathways were significantly enriched. We further found that Interleukin-4 (IL-4) is activated primarily in neurons and microglia in response to Aβ42, and is sufficient to increase NSC proliferation and neurogenesis. IL-4 binds to its cognate receptor IL4R that is expressed in NSCs, and activates the downstream signaling cascade via STAT6 phosphorylation. These results indicate that Aβ42-induced neurodegeneration in adult zebrafish brain leads to regenerative response mediated by direct activation of NSCs through a neuro-immune cross talk mediated by IL-4 signaling via STAT6 phosphorylation. In an approach to further elucidate how IL-4 signaling would mediate the NSCs response, we performed another whole-RNA transcriptome analyses after IL-4 treatment in homeostatic brains. We found that, apart from direct activation of NSC proliferation, IL-4 also has an indirect effect on NSCs through factors secreted by neurons. Single-cell transcriptomics further revealed the heterogeneity of the NSCs pool in the zebrafish brain, which responds directly or indirectly to Aβ42-induced IL-4. We found that IL-4 induces NSC proliferation and subsequent neurogenesis by suppressing the tryptophan metabolism and reducing the production of the neurotransmitter Serotonin. NSC proliferation was suppressed by Serotonin via downregulation of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) in Serotonin-responsive periventricular neurons. BDNF itself enhanced NSC plasticity and neurogenesis via NGFRA/NFkB signaling in zebrafish. This regulatory network is not active in rodents. With these results, we identified a novel IL-4-dependent molecular mechanism of NSC proliferation that is mediated by Serotonin-BDNF-NGFRA regulatory axis. Our results elucidated a novel crosstalk through neuron-glia interaction that regulates regenerative neurogenesis in adult zebrafish AD model. Additionally, we identified two functionally distinct populations of NSCs, which mediate NSCs plasticity through distinct gene expression profiles and versatile signaling mechanisms. Collectively, we propose that zebrafish serves as an excellent model to investigate regeneration-associated mechanisms that enables the inherent capacity of enhanced regenerative neurogenesis upon neurodegeneration. We found that specific signaling6 mechanisms are active in specific subtypes of NSC populations in adult zebrafish brain. Since these mechanisms are normally inactive in NSCs of mammalian brains, particularly in rodents after AD-like conditions, we speculate that activating such candidate mechanisms in distinct NSCs population in mammalian brains could induce NSCs plasticity response. Indeed, our studies also suggested that some of these candidates could be harnessed to force human NSCs to become proliferative and neurogenic. Therefore, my PhD work opened up a new avenue of research that utilizes zebrafish for understanding what it takes for a vertebrate NSC to remain neurogenic even after AD pathology. Overall, I believe that this research route will be instrumental in designing nature-inspired therapeutic strategies for AD in regenerative medicine.

Der Cortex von Säugetieren ist der Hirnbereich, der fundamental für höhere kognitive Funktionen wie Lernen, Gedächtnis, Aufmerksamkeit und komplexes Denken ist. Die Entwicklung des Cortex wird von neuralen Vorläuferzellen gesteuert, die schnell proliferieren, um ihren Pool zu expandieren, bevor sie zu differenzierenden Zellteilungen wechseln, um alle Neuronen zu generieren, aus denen der reife sechs schichtige Neokortex besteht. Der schrittweise Wechsel von Selbsterneuerung zu Neurogenese ist ein zeitlich regulierter Prozess, dessen Fehler schwere lebenslange kognitive Erkrankungen verursachen können. Aus diesem Grund ist es enorm wichtig zu verstehen, welche Faktoren die Schicksalsentscheidung der neuralen Vorläuferzellen regulieren. In den letzten zwei Jahrzehnten haben mehrere Studien die Wichtigkeit von nicht-kodierenden RNAs, wie lange nicht-kodierende und micro RNAs, für diese zeitliche Regulierung hervorgehoben. Mithilfe der Generierung einer kombinatorischen RFP/GFP Reporter Mauslinie, die die Isolierung von proliferierenden und differenzierenden Vorläuferzellen und neugeborenen Neuronen erlaubt, wurde berichtet, dass die lange nicht-kodierende RNA Miat als ein Regulator des neuralen Vorläuferzellen-Schicksals mittels Spleißen fungiert. Die Arbeit dieser Thesis zeigt, dass die Überexpression von Miat den Wechsel der neuralen Vorläuferzellen von proliferierenden zu neurogenen Zellteilungen verzögert und etabliert eine Strategie, um Miat-gespleißte Ziele auf Einzelpopulationslevel während der Corticogenese zu entdecken. Außerdem wurde die doppelte Reporter Mauslinie genutzt, um einen umfassenden und kompletten Katalog von micro RNAs, die in neuralen Vorläuferzellen und Neuronen exprimiert sind, zu erstellen. Dies führte zur Identifizierung von miR-486-5p als ein neuer Regulator der neuralen Vorläuferzellen-Schicksalsentscheidung.

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Die embryonale Neurogenese in Drosophila ist eine hochgradig koordinierte Abfolge von Zellschicksalsentscheidungen, die viele Ähnlichkeiten mit der Entwicklung des Nervensystems in Wirbeltieren aufweist. Diese Zellschicksalsentscheidungen sind räumlich und zeitlich koordiniert. Diese Zellen entstehen an stereotypen Positionen in jedem Segment und sind entlang zweier räumlicher Achsen angeordnet: der dorsoventralen und der anteroposterioren Achse. Neuroblasten teilen sich, um stereotype Zelllinien zu bilden, und die Zellen weisen charakteristische Zellmorphologien und -ziele auf, wobei die molekularen Mechanismen, die diese Merkmale bestimmen, noch weitgehend unbekannt sind. Jahrzehnte der Genetik haben einige Faktoren aufgedeckt, die für viele dieser Entscheidungen notwendig sind, aber ein Verständnis der einzelnen neurogenen Linien auf Genomebene war bis vor kurzem in vivo unmöglich. Ich habe mRNA aus Einzelzellen verwendet, um die Transkriptomdynamik von Schicksalsentscheidungen in der frühen Entwicklung des Nervensystems zu untersuchen. Mein Ziel ist es, zu entschlüsseln, wie sich Zellen unterscheiden, wenn Entscheidungen getroffen werden, die für die Entwicklung des Nervensystems wesentlich sind. Ich habe Transkriptomdaten von einzelnen Zellen aus Zehntausenden von Neuroblasten während der gesamten embryonalen Neurogenese erstellt. Es gelang mir, spezifische neurogene Populationen und ihre Genexpressionsprofile entlang ihrer Differenzierungswege zu identifizieren. Ich konnte die komplizierten zeitlichen Achsen, die das sich entwickelnde embryonale Nervensystem formen, teilweise entschlüsseln - ein Prozess, der von der Fliege bis zum Menschen konserviert ist. Diese Arbeit hat die Identifizierung lokalisierter Marker und sogar spezifischer Neuroblasten ermöglicht. Dieses Verständnis kann nun mit Informationen über die einzelnen Zellschicksale kombiniert werden, aus denen diese Neuroblasten hervorgehen, wie z. B. ihre spezifischen neuronalen und glialen Schicksale. / Embryonic neurogenesis in Drosophila is a highly coordinated sequence of cell fate decisions that bears many similarities to the development of the nervous system in vertebrates. These cell fate decisions are spatially and temporally coordinated. These cells arise at stereotypic positions in each segment and are arranged along two spatial axes: the dorsoventral axis and the anteroposterior axis. Neuroblasts divide to give rise to stereotypic lineages and the cells exhibit characteristic cell morphologies, branching patterns, and targets, the molecular mechanisms that determine these characteristics are still largely unknown. Decades of genetics have uncovered some factors necessary for many of these decisions, but understanding individual neurogenic lineages at the genome level has been impossible in vivo until recently. I have used Single cell mRNA to study the transcriptome dynamics that accompany important fate decisions in early nervous system development. My goal is to decipher how cells differ when decisions are made that are essential for nervous system development. This knowledge is invaluable for developing models for the in vivo mechanisms that allow individual cells in the nervous system to specify and differentiate. I have generated transcriptome data of single cells from tens of thousands of neuroblasts throughout embryonic neurogenesis. I was able to identify specific neurogenic populations and their gene expression profiles along their differentiation pathways. I was able to partially decipher the intricate temporal axes that shape the developing embryonic nervous system, a process that is conserved from fly to human. Single-cell transcriptomics has enabled the identification of localized markers and even specific neuroblasts. This understanding can now be combined with information about the individual cell fates that give rise to these neuroblasts, such as their specific neuronal and glial fates.

Die Alzheimer-Krankheit ist eine gewaltige Bedrohung für eine alternde Gesellschaft. Millionen von Menschen leben weltweit mit der Alzheimer-Krankheit, für die es keine aktuelle Behandlung gibt. Die Amyloidkaskaden-Hypothese (AKH) ist die aktuell am meisten akzeptierte Hypothese zur Ursache der Alzheimer-Krankheit. Die AKH bietet eine mechanistische Sicht auf die pathologische Kaskade, ausgehend von der Amyloid-Aggregation über die chronische Entzündung bis hin zur TAU-Pathologie. Die Medikamente, die auf der Grundlage der AKH entwickelt wurden, konnten Amyloid-Plaques bei Alzheimer-Patienten entfernen, brachten aber keine Verbesserung der kognitiven Fähigkeiten. Diese Misserfolge legen nahe, dass die Alzheimer-Krankheit nicht nur theoretisch im Rahmen der AKH betrachtet werden kann. Neuere Hypothesen kulminieren die Auswirkungen verschiedener Zelltypen (z.B. neurale Stammzellen, Astrozyten, Oligodendrozyten) auf den Ausbruch der Alzheimer-Erkrankung. Komplexe Rückkopplungs- und Feed-Forward-Mechanismen sind in der Pathophysiologie der Alzheimer-Demenz wahrscheinlich. Das Zusammenspiel zwischen der Pathologie und der Beteiligung anderer Zelltypen macht diese Krankheit multifaktoriell und komplex. Kürzlich zeigten zwei Studien (Moreno-Jimenez et al., 2019; Tobin et al., 2019), dass die Produktion neuer Neuronen im menschlichen Gehirn bei der Alzheimer-Erkrankung dramatisch abnimmt. Eine interessante Hypothese wurde durch diese Studien gestützt: Die pathologisch induzierte Erzeugung neuer Neuronen (regenerative Neurogenese) bei Alzheimer-Patienten könnte helfen, die Pathologie der Alzheimer-Erkrankung rückgängig zu machen. Da die Regenerationsfähigkeit bei Säugetieren entwicklungsmäßig wenig ausgeprägt ist (Tanaka und Ferretti, 2009), kann uns die Untersuchung der Neurodegeneration in einem Modellorganismus mit Regenerationsfähigkeit daher lehren, wie man die Proliferation und Neurogenese neuraler Stammzellen unter pathologischen Bedingungen induzieren kann. Für diese spezielle Frage können uns Modellorganismen mit natürlicher Regenerationsfähigkeit zeigen, wie man Proliferation und Neurogenese unter den pathologischen Bedingungen der Alzheimer-Erkrankung induzieren kann. Der Zebrafisch bietet eine beispiellose Möglichkeit, die Neurodegeneration und Regeneration zu modellieren, um die molekularen Mechanismen zu untersuchen, wie anhand der Neurogenese in Wirbeltiergehirnen die Alzheimer-Krankheit verbessert werden kann. Dies wurde in unserem Labor bereits in mehreren Publikationen gezeigt. Aus diesem Grund habe ich in meiner Doktorarbeit Zebrafische verwendet, um die Plastizität neuraler Stammzellen (NSZ) zu untersuchen. Besonders interessierte mich die Heterogenität von NSZ-Populationen in Bezug auf ihre molekularen Programme und die molekulare Grundlage der regenerativen Neurogenese von NSZ auf das Amyloid-β-42 (Aβ42) und TAU-Pathologien.

Der Hippocampus ist eine von zwei Gehirnregionen, in der zeitlebens kontinuierlich neue Nervenzellen gebildet werden. Er spielt eine wichtige Rolle bei der Gedächtniskonsolidierung und wird mit der funktionellen Entstehung neurodegenerativer Erkrankungen in Verbindung gebracht. Strukturveränderungen im erwachsenen Gehirn, die mit einer Depression einhergehen, sind laut Literatur auf einen geringen Serotoninspiegel und reduzierte hippocampale Neurogenese zurückzuführen. Selektive Serotonin-Wiederaufnahmehemmer (SSRI) erhöhen die Serotoninkonzentration im synaptischen Spalt und üben einen positiven Effekt auf die adulte Neurogenese aus. In der vorliegenden Arbeit wird untersucht, wie Veränderungen in der Serotonin (5-HT)-Neurotransmission durch einmalige oder chronische Gaben von Fluoxetin und speziellen Agonisten und Antagonisten für die Serotoninrezeptoren 5-HT1a und 5-HT2 in der erwachsenen Maus die Proliferation und Differenzierung von neugebildeten Nervenzellen im Gyrus dentatus beeinflussen. Die Ergebnisse zeigen, dass ein konträres Agieren beider Rezeptoren zu einem ausgewogenen Serotoninspiegel führt. 5-HT1a- und 5-HT2c-Rezeptoren haben einen Einfluss auf das Überleben neugebildeter Nervenzellen, wobei sie unterschiedliche Entwicklungsstadien innerhalb der adulten Neurogenese kontrollieren. Die vorliegende Arbeit bekräftigt außerdem, dass die chronische Gabe von Fluoxetin die adulte Neurogenese steigert. / The hippocampus as one region with ongoing neurogenesis throughout life contributes to the formation of long-term memory and has also been implicated in the pathology of major depression. Studies suggest that depression might be due to decreased levels of serotonin and reduced neurogenesis in the adult brain and that the beneficial effects of selective serotonin reuptake inhibitors would require adult hippocampal neurogenesis. Here, I investigated how modulation of serotonergic neurotransmission by acute and chronic treatment with the antidepressant fluoxetine, and selective serotonin receptor agonists and antagonists in adult mice influences precursor cell activity during development. I focused on 5-HT1a and 5-HT2 receptors as major mediators of serotonin action. The present findings suggest that an opposed action of 5-HT1a and 5-HT2c receptor subtypes result in a balanced regulation of serotonin levels in the dentate gyrus. Both receptors differentially affect intermediate cell stages in adult hippocampal neurogenesis and play an important role in the survival of newly generated neurons. Furthermore, this study confirms that chronic fluoxetine treatment increases adult neurogenesis. In conclusion, the latency of onset of fluoxetine action can be explained by a balanced interplay of 5-HT1a and 5-HT2c receptor subtypes.

Das erwachsene Gehirn enthält neuronale, multipotente Stammzellen, aus denen in den beiden bekannten neurogenen Regionen des Gehirn, im Hippocampus und im olfaktorischen System, neue Nervenzellen hervorgehen. Aus Transplantationsstudien und anderen Untersuchungen weiß man, daß es die zelluläre Umgebung ist, die die neurogene Permissivität und damit die Entwicklung einer reifen neuen Nervenzelle aus einer Stamm- oder Vorläuferzelle, bestimmt. Die Schlüsselfrage lautet daher: Was macht eine neurogene Region neurogen? Neurogenität ist mehr als die Präsenz von neuralen Stammzellen. Die aktivitätsabhängige Regulation adulter hippocampaler Neurogenese stellt eine physiologische, positive Modulation von Neurogenität im erwachsenen Gehirn dar. Aktivitätsabhängige Regulation adulter hippocampaler Neurogenese ist vielstufig und kein An/Aus-Phänomen. Die unterschiedlichen Stufen der Regulation unterliegen unterschiedlicher genetischer Determination und unterschiedlicher Empfindlichkeit auf aktivitätsabhängige Stimuli. Die Steuerung des Überlebens neugeborener Zellen stellt möglicherweise den entscheidenden Schritt auf dem Weg zu einem neuen Neuron dar. Die aktivitätsabhängige Selektion durch eine überlebensfördernde Wirkung rekrutiert jedoch aus einem Pool proliferierender Vorläuferzellen, die das neurogene Potential darstellen. Die subtile Regulation adulter hippocampaler Neurogenese durch funktionsabhängige Stimuli legt eine Relevanz für hippocampale Funktion, insbesondere Lern- und Gedächtnisvorgänge nahe. Entsprechend muß aber auch eine Bedeutung für hippocampale Pathologie diskutiert werden. Das Verständnis darüber, wie Neurogenität funktions- und aktivitätsabhängig modulierbar ist, ist von größter Relevanz für die Frage, ob und wie sich Neurogenese aus ruhenden neuronalen Stamm- und Vorläuferzellen auch außerhalb neurogener Regionen induzieren und in therapeutischer Absicht nutzen läßt. / The adult brain contains neuronal, multipotent stem cells. In two neurogenic regions of the adult brain, hippocampus and olfactory system, new neurons are generated from these stem cells. From transplantation studies and other investigations it is known that the cellular microenvironment provides the neurogenic permissiveness and determines the development of a mature new neuron from a stem or progenitor cell. Thus, the key question is, what defines a neurogenic region as neurogenic, if it is not the presence of neural stem cells alone. The activity-dependent regulation of adult hippocampal neurogenesis represents a physiologic and positive modulation of neurogenic permissiveness in the adult brain. Activity-dependent regulation of adult hippocampal neurogenesis occurs on multiple steps and is not an on/off phenomenon. The different levels of regulation are differentially influenced by genetic determination and different susceptibility to activity-dependent stimuli. The regulation of the survival of a newly generated cells might be the key step in the development of a new neuron. The activity-dependent recruitment of new neurons by means of a survival-promoting effect acts upon a pool of proliferating progenitor cells, which represent the neurogenic potential. The subtle regulation of adult neurogenesis by functional stimuli suggests a relevance of adult hippocampal neurogenesis for hippocampal function, in particular learning and memory. Accordingly, a potential relevance for hippocampal pathology has to be considered. Insights on how neurogenic permissiveness can be modulated in response to functional stimuli has important implications for the question, if and how neurogenesis from quiescent neuronal stem or progenitor cells can be induced inside and outside of neurogenic regions of the adult brain and can be used for therapeutic purposes.

Une même hormone peut exercer des effets différents sur le développement des caractéristiques de type femelle selon la période à laquelle elle est produite : lstradiol nous a ainsi dévoilé son double jeu, révélant à la fois des effets déféminisants prénataux pouvant sexercer jusqu5ème jour postnatal et des effets féminisants sexerçant dès le 15ème jour postnatal. / A steroid hormone can have different effects on female characteristics development according to the period it is produced : estradiol has defeminizing effects on brain development until postnatal day 5, and feminizing effects from postnatal day 15.

Tau ist ein Mikrotubuli-assoziiertes Protein, das die Polymerisation von Tubulin fördert und die Mikrotubuli stabilisiert. Folglich wird angenommen, dass Tau essentiell für die neuronale Morphogenese ist, vor allem für die Axonenausbildung und -aufrechterhaltung. Mittels tangentieller Nissl-gefärbter Schnitte von Mäusegehirnen konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass Tau-knockout Mäuse die regelhafte thalamokortikale Barthaar-projektion („Barrel“ Konfiguration) entwickeln. Der Einfluss von Tau auf die Entstehung von Dendriten wurde anhand von Golgi-gefärbten Präparaten untersucht. Die Sholl-Analyse der gefärbten CA1-Pyramidenzellen zeigte, dass die Komplexität apikaler Dendriten durch das Fehlen von Tau reduziert wurde, während die Basaldendriten unbeeinflusst blieben. Das Tau-Protein scheint demzufolge unwesentlich für die Entstehung von axonalen Verbindungen im embryonalen Gehirn zu sein, ist aber beteiligt an der Steuerung des dendritischen Verzweigungsmusters. Ferner wurde beobachtet, dass sowohl die adulte Neurogenese, als auch die Mikrotubuli-Stabilität in den Apikal- und Basaldendriten und die Synapsen von dem Fehlen des Tau-Proteins unbeeinflusst blieben. In primären Zellkulturen aus dem Kleinhirn von Tau-knockout und Tau-wildtyp Mäusen konnten zwischen den zwei Genotypen keine signifikanten Unterschiede in der Länge oder im Verzweigungsmuster der Dendriten und der Axone von Körnerzellen beobachtet werden. Die Untersuchung der Effekte einzelner Tau-Isoformen auf die Morphologie von N2A-Zellen zeigte, dass es Unterschiede sowohl zwischen Tau-defizienten und Tau-positiven Zellen, als auch zwischen Zellen mit den verschiedenen Tau-Isoformen gibt. Das Tau-Protein übt demnach in vivo einen wichtigen Einfluss auf die Morphologie der Nervenzellen und besonders der Dendriten aus, welcher in vitro weiter analysiert wurde.

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