Na,K-ATPase é uma proteína de membrana que tem como função manter o equilíbrio osmótico nas células pela hidrólise de ATP. A ouabaína (OUA) se liga a Na,K-ATPase e é capaz de ativar cascatas de sinalização. As subunidades a da Na,K-ATPase possuem 4 isoformas que são distribuídas de forma diferenciada nos tecidos. As células da glia são importantes na resposta contra lesões no cérebro e também controlam a inflamação. Dados na literatura mostram que a OUA tem efeito protetor em alguns tipos de dano. O objetivo do estudo é avaliar a função da isoforma a2 na cultura de células da glia em resposta à OUA e ao LPS. Nós investigamos a ação da OUA em diversas concentrações e LPS (1g/mL) na viabilidade celular (LDH) e proliferação celular (MTT). O LPS foi utilizado como modelo de inflamação e uma das perguntas era se o tratamento prévio com OUA, seria capaz de reverter a ativação do fator de transcrição NF-kB que está envolvido com inflamação. O pré-tratamento com OUA diminuiu a ativação do NF-kB induzida pelo LPS. Após, nós silenciamos a isoforma a2 das células da glia com RNAi. Os nossos dados mostram que o pré-tratamento com OUA reverte o efeito na ativação do NF-kB causado pelo LPS. Provavelmente, a isoforma a2 está relacionada com alguma via de sinalização que interage com a via do LPS. / Na,K-ATPase is a conserved membrane protein which maintains the osmotic balance in the cell by the hydrolysis of ATP. Ouabain (OUA) binds to Na,K-ATPase and it can activate signaling pathways. The a subunits of Na,K-ATPase have 4 isoforms which are distributed in a different pattern in the tissues. Glial cells have an important role in the response against injury and they also control inflammation. Some data have reported that OUA can protect against some types of injury. The aim of this study is to evaluate the role of a2 isoform in glial cells in response to OUA and LPS stimulus. We investigated the action of OUA and LPS in cell viability (LDH) and cell proliferation (MTT). LPS was used as a model of inflammation and one of our questions was if the treatment with OUA before LPS was capable of reduce the activation of the transcription factor NF-kB which is involved in inflammation. The pre-treatment with OUA decreased the NF-kB activation induced by LPS. We also silenced the a2 isoform in culture glial cells with iRNA. Taken together our data showed that OUA pretreatment reversed the NF-kB activation induced by LPS in primary cultures of glial cells from mice. Probably,the a2 isoform is related with some signaling pathway that interacts with the LPS pathway.

Orientador: Sara Teresinha Olalla Saad / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-22T11:44:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ribeiro_ThiagoBorsoi_D.pdf: 4887111 bytes, checksum: 5ba29a0d383225adef5209fb35a27d81 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: A avulsão de raízes motoras, na interface do sistema nervoso central e periférico, já bem descrito na literatura, promove uma significativa perda sináptica com degeneração de cerca de 80% dos motoneurônios afetados. Não existem estratégias eficazes que propiciem uma reversão ou amenização deste quadro, mas alguns estudos já mostram que o passo fundamental é preservar os motoneurônios afetados. Pesquisas em diferentes áreas com células-tronco (CT) adultas estão sendo realizadas nos últimos anos e apresentam resultados promissores para a medicina regenerativa. Investigações recentes têm apontado para diferentes fontes de CT em tecidos adultos tais como de medula óssea, de sangue de cordão umbilical, tecido muscular, tecido nervoso, líquido amniótico entre outras. De modo geral, estas células apresentam como características principais a capacidade de proliferação e a diferenciação para outros tipos celulares. Entretanto, os principais problemas para o uso clínico das CT adultas são: i) pequena quantidade de células multipotentes, ii) o controle da diferenciação, iii) insuficiência no número de células viáveis e iiii) difícil obtenção. Como alternativa às dificuldades anteriormente citadas, o tecido adiposo tem sido foco de intensos estudos, pois este tecido possui rica fonte de células pluripotentes, além de apresentarem características positivas como fácil acesso ao tecido adiposo subcutâneo, obtenção em quantidade abundante e processo de isolamento celular relativamente simples. Apesar deste tecido apresentar organização complexa, é na fração celular do estroma vascular que se encontra uma rica população de células pluripotentes. Dados de literatura demonstram que as células mesenquimais derivadas de tecido adiposo (AT-MSC - Células mesenquimais de tecido adiposo), mediante incubação com meios de cultura variados, diferenciam-se em adipócitos, osteócitos, mioblastos, hepatócitos, células vasculares entre outras. A diferenciação de AT-MSC em células neuronais ainda é alvo de discussões e críticas na literatura, pois não há protocolos estabelecidos que induzam a diferenciação em células neuronais funcionais absolutas. Ainda, recentes estudos atribuem um potencial neuroprotetor e uma capacidade imunomodulatória à produção de fatores neurotróficos e a produção de fatores solúveis pelas AT-MSCs, constituindo talvez o principal mecanismo de ação destas células in vivo. O xenotransplante também é alvo de criticas de diversos trabalhos. Células humanas em modelo animal têm sido usadas constantemente em diversos trabalhos e o uso ou não de imunossupressores é um dos motivos de questionamento dos resultados, uma vez que sistemas imunológicos diferentes podem causar reações imunológicas não pretendidas nos estudos e, consequentemente, os resultados não seriam confiáveis. Entretanto, artigos de revisões x bibliográficas demonstram que diversos estudos envolvendo células-tronco mesenquimais e modelos animais têm resultados promissores e corroboram entre si. Com objetivo de investigar a ação de células-troncos de tecido adiposo de lipoaspirado humano em modelo animal, o presente trabalho propôs analisar a capacidade de sobrevivência das AT-MSCs humanas no modelo de avulsão da raiz ventral de ratos, bem como sua capacidade de neuroproteção dos motoneurônios lesionados e sua competência de imunossupressão no período de 2 semanas pós lesão (período agudo). Análise da dinâmica das sinapses, da reação astroglial e microglial e da reação de linfócitos T tiveram o objetivo de identificar condições que promovessem a sobrevivência e regeneração dos motoneurônios axotomizados assim como a capacidade de atuação das células humanas em ratos. Deste modo, foi observado que o tratamento com as AT-MSC humanas tiveram efeito neuroprotetor, uma vez que houve aumento significativo de sobrevivência neuronal e promoveram a estabilidade sináptica. As células humanas também tiveram ação imunomodulatória, reduzindo a astrogliose reativa e ativação microglial, bem como inibiu a atividade de linfócitos T. Pode-se dizer que no modelo a ação das células-tronco mesenquimais humanas ocorre semelhante ao de transplantes alogênicos em modelos animais / Abstract: It is well described in the literature that avulsion motor at the interface of the central and peripheral nervous system, promotes a significant loss of synaptic degeneration and 80% of motor neurons death. There is no effective strategies that favor a reversal or mitigation of this framework, but some studies have shown that the key step is to preserve motor neurons affected. Researches in different areas with stem cell (CT) adults are being undertaken in recent years and show promising results for regenerative medicine. Recent investigations have pointed to different sources of CT in adult tissues such as bone marrow, umbilical cord blood, brain, muscle tissue, amniotic fluid, among others. Generally, these cells have as main characteristics capacity for proliferation and differentiation to other cell types. However, the main problems for the clinical use of adult SC are: i) small amount of multipotent cells, ii) differentiation control, iii) low number of viable cells and iiii) difficulty to obtain. As an alternative to the difficulties mentioned above, adipose tissue has been the focus of intense study, because this tissue has a rich source of stem cells, in addition to having positive characteristics such as easy access to subcutaneous adipose tissue, obtained in abundant quantities and isolation process relatively simple. Despite the complex tissue organization, the stromal vascular fraction is rich of pluripotent population cells. Literature data show that stromal cells derived from adipose tissue (AT-MSC-adipose tissue mesenchymal stem cells) can differentiate by incubation with various culture media into adipocytes, osteocytes, myoblasts, hepatocytes, vascular cells, among others. The AT-MSC differentiation into neuronal cells is still subject of discussion and criticism in literature, since no established protocol has induced differentiation into function neuronal cells. Still, many studies attribute a potential neuroprotective and immunomodulatory capacity for the production's AT-MSC of neurotrophic factors and the soluble factors, constituting perhaps the main mechanism of action of these cells in vivo. Xenotransplantation is the target of criticism of many studies. Human cells constantly used in animal models have been used in several works and the use of immunosuppressants or not is subject to questioning of the results, since different immune systems can cause unwanted immune reactions in studies and, consequently, the results would not be reliable. Literature reviews show that several studies involving mesenchymal stem cells and animal models have shown promising results and corroborate each other. xii To investigate the action of stem cells from human adipose tissue lipoaspirate animal model, this study proposes to analyse the survivability of the human AT-MSC in ventral root avulsion model in rats as well as its ability to neuroprotection in moto neurons and their competence in the period of immunosuppression 2 weeks post injury (acute period). To identify conditions that promote the survival and regeneration of axotomized motoneurons as well as the capacity for action of human cells in mice, synapses dynamic analysis, astroglial and microglial reaction and reaction of T lymphocytes was examined. Thus, it was observed that treatment with AT-MSC had neuroprotective effect, since there was a significant increase in neuronal survival and the AT-MSC human promoted synaptic stability. Human cells also have immunomodulatory action, reducing reactive astrogliosis and microglial activation and inhibited the activity of T lymphocytes. It is possible that the model action of human mesenchymal stem cells is similar to that of allogeneic / Doutorado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Doutor em Fisiopatologia Medica

published_or_final_version / Anatomy / Doctoral / Doctor of Philosophy

published_or_final_version / Biochemistry / Master / Master of Philosophy

O uso de culturas de células do Sistema Nervoso Central é extensivamente aplicado na compreensão dos mecanismos celulares, moleculares e bioquímicos do cérebro, sendo que a maioria dos protocolos utilizados faz uso de animais neonatos para a obtenção das células. Neste estudo, propomos e caracterizamos um protocolo de obtenção de cultura de astrócitos corticais de ratos Wistar adultos, de 90 dias de idade. Para a elaboração da cultura, os cérebros foram cuidadosamente dissecados e o córtex foi dissociado mecanicamente e enzimaticamente com tripsina e papaína. As células foram cultivadas com DMEM/F12 (10% SFB) nas duas primeiras semanas e DMEM/F12 (20% SFB) nas últimas semanas. Ao final deste período, as células apresentavam morfologia poligonal caracteristicamente astrocitária, extensiva marcação para a Proteína Glial Fibrilar Ácida (GFAP) e para a Glutamina Sintetase (GS), ambas importantes marcadores gliais. Também foi avaliada a captação de glutamato, a atividade da GS e o conteúdo de glutationa (GSH). Ainda, verificamos a expressão de outras proteínas características de astrócitos, como vimentina, S100B e ALDH1L1, além dos transportadores glutamatérgicos GLAST e GLT-1. Sob exposição ao H2O2 e Zn2+, podemos verificar que os astrócitos são suscetíveis ao estresse oxidativo, o qual pode causar alterações morfológicas e funcionais. Também, verificamos que estas células são suscetíveis a estímulos inflamatórios. Assim, concluímos que o protocolo proposto é efetivo para gerar uma cultura funcional e caracteristicamente astrocitária, utilizando-se ratos adultos, os quais já têm conexões celulares estabelecidas, ao contrário dos neonatos, que estão ainda no processo de formação das células e conexões. Isto pode representar um importante modelo de estudo para doenças neurodegenerativas, neurotoxicidade e neuroproteção, visto que astrócitos adultos cultivados in vitro apresentam características mais similares ao cérebro adulto in vivo, e podem ser usados para se obter respostas mais fidedignas aos estímulos aos quais serão submetidos. / The use of cell cultures of central nervous system is extensively applied to understand the cellular, molecular and biochemical mechanisms of the brain, and most part of the protocols makes use of newborns to obtain cells. In this study we have characterized a protocol to obtain astrocyte cultures of adult Wistar rats, 90 days old. For the preparation of culture, brains were carefully dissected and the cortex was dissociated mechanically and enzymatically with trypsin and papain. The cells were cultured with DMEM/F12 (10% FBS) in the first two weeks and DMEM/F12 (20% FBS) until it reaches confluence. Thereafter, the cells presented typical polygonal morphology of astrocytes, extensive marking for glial fibrillary acidic protein (GFAP) and Glutamine Synthetase (GS), both important glial markers. We also evaluated glutamate uptake, GS activity and intracellular levels of glutathione (GSH). We observed the expression of other characteristic proteins of astrocytes, such as vimentin, S100B, ALDH1L1 and, in addition, the main glutamate transporters in the brain, GLT-1 and GLAST. Upon exposure to H2O2 and Zn2+, we found that astrocytes are susceptible to oxidative stress, which may cause morphological and functional changes. Also, we found that these cells are susceptible to inflammatory stimuli. Thus, we conclude that the proposed protocol is effective to generate a functional and characteristic astrocytic culture, using adult rats, which already have established neural connections compared to newborns. This may represent an important study model for neurodegenerative diseases, neuroprotection and neurotoxicity, as adult astrocytes cultured in vitro have similar characteristics to the adult brain in vivo, and can be used to obtain more reliable responses to stimuli to which they will be exposed.

Emaranhados neurofibrilares intraneuronais, juntamente com as placas beta-amilóide e astrogliose são importantes marcadores neuropatológicos da doença de Alzheimer (DA). Apesar dos mecanismos envolvidos na DA do tipo esporádica ainda não estarem bem esclarecidos, a hiperfosforilação da proteína tau é sugerida como grande fator para o desenvolvimento dos emaranhados neurofibrilares, que podem gerar disfunção neuronal e morte. A toxina ácido ocadáico (AO) é considerada um efetivo inibidor das fosfatases 1 e 2A, as quais podem gerar a hiperfosforilação da tau. Dessa forma, este trabalho tem como objetivo, avaliar alterações neurogliais em hipocampo e líquido cerebroespinhal (LCE) de ratos expostos ao AO intracerebroventricular após 3 e 12 semanas da infusão. E ainda, verificar alterações neurogliais de fatias hipocampais expostas de forma aguda ao AO (in vitro). Como resultados encontramos no modelo in vivo, declínio cognitivo, hiperfosforilação da tau (Ser 396) e alteração astroglial hipocampal principalmente devido a redução da captação de glicose e aumento da expressão da GFAP e ainda, redução da S100B no LCE, a qual pode atuar na sinalização neurônio-astrócito, em condições fisiológicas ou patológicas, como na DA. Ao observar as alterações neurogliais 12 semanas após a infusão, verificamos que o modelo é parcialmente reversível, uma vez que a fosforilação da proteína tau não mostrou alteração, mas foi observado declínio cognitivo em um dos comportamentos realizados e hipometabolismo da glicose. E ainda, in vitro, o AO foi capaz de hiperfosforilar a proteína tau (Ser 396), mas não alterou parâmetros astrogliais. Portanto, o modelo animal se mostra adequado para avaliação de alterações neuroquímicas. Mas nossos resultados também apontam para uma reversibilidade parcial do modelo a longo prazo, indicando a necessidade de cautela na avaliação de estratégias terapêuticas com este modelo. E ainda, nossos dados reforçam a importância de investigar alterações do metabolismo cerebral da glicose em indivíduos com déficit cognitivo. / Intraneuronal aggregates of neurofibrillary tangles (NFTs), together with beta-amyloid plaques and astrogliosis, are important markers of Alzheimer’s disease (AD). The underlying mechanism of sporadic AD remains poorly understood, but abnormal hyperphosphorylation of tau protein is suggested to have a role in NFTs genesis, which leads to neuronal dysfunction and death. The okadaic acid (OKA) toxin is a protein phosphatase 1 e 2A inhibitor and can lead to tau protein hyperphosphorylation. We have investigated the effects of intracerebroventricular (ICV) OKA on neuroglial alterations 3 and 12 weeks after OKA infusion. We have also researched the effects on neuroglial parameters on hippocampal slices treated with OKA in vivo. Our results have shown cognitive impairment, hippocampal astrogliosis, based on GFAP increment, decreased glucose uptake and increase on tau phosphorylation (at Ser396) in hipocamppus and decrease in S100B protein on cerebrospinal fluid 3 weeks after ICV OKA-infusion. Moreover, 12 weeks after ICV OKA infusion we also observed a cognitive impairment and decreased on glucose uptake. In vitro, exposure of hippocampal slices to OKA altered tau phosphorylation at Ser396 without any associated change in astroglial function. In conclusion, the OKA-animal model proved to be a suitable model for neurochemical parameters assessment. Our results also indicate a partial reversibility of long-term animal model, suggesting that therapeutics strategies evaluations must be caution on this model; and reinforce how important is to investigate on brain glucose metabolism alterations on cognitive impairment.

Thesis (Ph. D.)--University of Hong Kong, 2007. / Title proper from title frame. Also available in printed format.

Thesis (Ph. D.)--West Virginia University, 2001. / Title from document title page. Document formatted into pages; contains viii, 84 p. : ill. Includes abstract. Includes bibliographical references (p. 58-84).

abstract / Biochemistry / Doctoral / Doctor of Philosophy

published_or_final_version / Anatomy / Master / Master of Philosophy