Les cancers hépatiques, bronchiques et mammaires sont responsables de 35 % de décès par le cancer en 2012. Les études sur des facteurs contribuant à la progression tumorale devraient approfondir nos connaissances sur la biologie de ces cancers et ouvrir de nouvelles voies pour le développement de stratégies thérapeutiques. Dans ce contexte, nous avons étudié l'impact de la neurotensine (NTS) et de son récepteur NTSR1 sur la progression tumorale et son rôle potentiel pour de futures applications cliniques. J’ai initié ce projet dans le carcinome hépatocellulaire (CHC) et participé aux projets dans le cancer du poumon et du sein qui avaient été initiés par les anciens doctorants de l’équipe. Dans le CHC, sur une série de 73 patients, la NTS et le NTSR1 ont été détectés dans respectivement 56 % et 64 % des cas. En utilisant deux modèles cellulaires nous avons montré que l’expression du NTSR1 est une cible de la voie wnt/β-caténine. Le couple NTS/NTSR1 augmente l’expression et l’activation de l’EGFR et favorise la croissance des tumeurs expérimentales et la capacité de migration et d’invasion des cellules. La régulation entre le complexe NTS/NTSR1 et les récepteurs des HERs a également été observée dans les cancers bronchiques et mammaires, la NTS induit l'expression et l'activation constitutive des récepteurs EGFR, HER2 et HER3, par l'intermédiaire de l'activation des métalloprotéinases qui libèrent les ligands “EGF-like” spécifiques d'EGFR et d’HER3. L’activation constitutive des HER par le couple NTS/NTSR1 mime les mutations activatrices des HERs, ainsi la réponse des tumeurs aux inhibiteurs de tyrosine kinase est potentialisée dans le cancer du poumon, du sein et du foie. / In 2012, Liver, lung and breast cancers represented 30% of new cancer cases, and 35% of cancer related deaths. Identification of factors contributing to tumor progression can strengthen our understanding of the cancer biology and suggest new therapeutic strategies. In this context, we studied the impact of neurotensin (NTS) and its receptor NTSR1 on tumor progression and its potential clinical application. I have initiated the project in hepatocellular carcinoma (HCC) and participated in the projects on lung and breast cancers initiated by former PhD students. In HCC, on a series of 73 patients, NTS and NTSR1 were detected in 56% and 64% of the cases, respectively. Meanwhile, I showed that NTSR1 expression is the target of the Wnt/¦Â-catenin pathway. The NTS / NTSR1 complex increases the expression and activation of EGFR and promotes the growth of experimental tumors and the ability of the cell for migration and invasion. The regulation between the NTS/NTSR1 complex and EGF receptors were also thoroughly studied in lung and mammary cancers. Indeed, NTS induced the expression and the constitutive activation of EGFR, HER2, and HER3, through the activation of metalloproteinases which released specific "EGF-like" ligands for EGFR and HER3. Constitutive activation of HERs by the NTS/NTSR1 complex mimics the activating mutations of HERs and therefore potentiates the tumor response to tyrosine kinase inhibitors treatment in liver, lung and breast cancers.

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) représentent la famille de récepteurs membranaires la plus étendue. Présentement, 30% des médicaments disponibles sur le marché agissent sur plus ou moins 4% des RCPG connus. Cela indique qu’il existe encore une multitude de RCPG à explorer, qui pourraient démontrer un potentiel thérapeutique intéressant pour des pathologies encore sans traitement disponible. La douleur chronique, qui affecte 1 canadien sur 5, fait partie de ces affections pour lesquelles les thérapies sont faiblement efficaces. Dans le but éventuel de pallier à ce problème, le projet de ce mémoire consistait à mieux comprendre les mécanismes régissant l’adressage membranaire du récepteur de la neurotensine de type 2 (NTS2), un RCPG dont l’activation induit des effets analgésiques puissants de type non opioïdergique. Des données du laboratoire ayant révélé une interaction entre la 3e boucle intracellulaire de NTS2 et la sécrétogranine III (SgIII), une protéine résidente de la voie de sécrétion régulée, notre objectif était de caractériser le rôle de SgIII dans la fonctionnalité du récepteur NTS2. Pour ce faire, l’interaction entre les deux protéines a d’abord été vérifiée par co-immunoprécipitation, GST pull down, essais de colocalisation subcellulaire et par FRET. Nous avons également utilisé un outil d’interférence à l’ARN (DsiRNA) pour invalider la protéine SgIII dans un modèle cellulaire neuronal et chez l’animal. Des essais de radioliaison sur le modèle cellulaire ont révélé une diminution de l’adressage de NTS2 à la membrane plasmique lorsque SgIII était supprimée. De la même façon, une invalidation de SgIII chez le rat inhibe les effets analgésiques d’un agoniste NTS2-sélectif (JMV-431), qui sont normalement observés dans le test de retrait de la queue (douleur aiguë). Nous avons cependant identifié que des stimulations au KCl, à la capsaïcine et à la neurotensine induisaient plutôt une insertion du récepteur à la membrane dans les cellules neuronales. Puisque l’interaction entre SgIII et la 3e boucle intracellulaire du récepteur NTS2 est peu probable selon un système de sécrétion classique, un modèle hypothétique de transition dans les corps multi-vésiculaires a été vérifié. Ainsi, la présence de NTS2 et de SgIII a été révélée dans des préparations exosomales de DRG F11, en plus d’une transférabilité du récepteur par le milieu extracellulaire. En somme, ces résultats démontrent la dépendance du récepteur NTS2 envers SgIII et la voie de sécrétion régulée, en plus d’identifier certains facteurs pouvant augmenter son expression à la surface cellulaire. Le projet contribue ainsi à ouvrir la voie vers des approches pour potentialiser les propriétés de NTS2 in vivo¸ en plus d’une piste d’explication concernant le trafic intracellulaire du récepteur.

Malgré les avancées majeures réalisées dans le monde de la médecine depuis plusieurs années, la gestion de la douleur est encore aujourd’hui un problème médical des plus important. Les patients se voient offrir un nombre limité de composés analgésiques, qui se présentent souvent avec des effets secondaires importants ou tout simplement un manque flagrant d’efficacité pour leur condition douloureuse spécifique. Face à ce constat, le milieu de la recherche en douleur est en profonde réflexion depuis quelques années par rapport à la difficulté d’introduire en clinique de nouveaux composés analgésiques fonctionnels. Parmi les hypothèses soulevées pour tenter de répondre à cette grande problématique, il a été proposé d’améliorer les méthodes d'évaluations précliniques de la douleur, de développer de nouveaux modèles de douleur plus proches de la réalité clinique, de cibler de nouvelles voies moléculaires impliquées dans la douleur, de trouver des alternatives aux approches pharmacologiques classiques, etc. Ces différentes pistes de réponse sont à l’heure actuelle en cours d’études dans de nombreux laboratoires dans le monde. Dans le cadre de mes projets de doctorat, je me suis intéressé à cette problématique de différentes façons. Nous avons tout d’abord validé un nouvel appareil comportemental qui permet d'évaluer des composantes de la douleur chronique qui sont rarement évaluées avec les tests actuellement disponibles. À l’aide de trois modèles de douleur chronique bien établis dans la littérature, soit un modèle de douleur inflammatoire (CFA pour Complete frund Adjuvant), de douleur neuropathique (CCI pour Chronic Constriction Injury) et de douleur cancéreuse osseuse (tumeur fémorale), nous avons montré que le test de distribution pondérale dynamique (ou DWB pour Dynamic Weight Bearing) permet tout d’abord de détecter l’évolution des douleurs de façon comparable au test classique de von fry pour l’allodynie mécanique. De plus, au moins trois autres paramètres pertinents associés à des composantes de qualité de vie ont pu être tirés de nos analyses. En effet, le poids posé sur chacune des pattes, leur temps d’utilisation durant le test et leur surface de contact avec le sol représentent des facettes de l’inconfort s'apparentant à ce qui peut être observé en clinique, mais qui ont rarement été étudié dans un contexte préclinique. Après la démonstration de l’aspect novateur de cet appareil, nous avons voulu valider son efficacité à détecter un effet analgésique, tout en s'interrogeant sur la pertinence clinique de nouvelles cibles thérapeutiques. En effet, notre laboratoire s’intéresse au système neurotensinergique, constitué principalement de la neurotensine (NT) et de deux récepteurs couplés aux protéines G (NTS1 et NTS2), et de son fort potentiel analgésique dans différentes conditions douloureuses. Résultant de plusieurs collaborations avec des équipes de chimie médicinale, le laboratoire est maintenant pourvu d'un grand nombre d'agonistes liant les récepteurs à la NT. Nous avons ainsi évalué l’efficacité d'agonistes sélectifs du récepteur NTS2, soit le JMV431, la lévocabastine et la ?-lactotensine, en plus d'un agoniste non sélectif de dernières générations, le JMV2009, présentant des caractéristiques pharmacologiques particulières. Après injection intrathécale, la plupart de ces agonistes se sont montrés d’une grande efficacité pour réduire l’allodynie mécanique présente chez les animaux atteints de douleur neuropathique, en plus d’améliorer de façon remarquable les différents paramètres de qualité de vie préalablement identifiés par notre étude portant sur la caractérisation du DWB. Il était également important de tester des molécules qui sont actuellement prescrites en clinique. Nous avons ainsi spécifiquement choisi des médicaments de première et de deuxième ligne pour le traitement de la douleur neuropathique, soit l’amytriptyline, la prégabaline et la morphine. Tous ces traitements ont été en mesure de réduire la présence d'allodynie mécanique chez les animaux CCI. Toutefois, la majorité de ces composés se sont avérés incapables de renverser les composantes de qualité de vie durant le test de DWB, et ce en utilisant les mêmes doses qui s’étaient montrées efficaces pour réduire l’allodynie mécanique. Cette dernière observation pourrait, au moins en partie, expliquer pourquoi les patients rapportent souvent une mauvaise gestion de leur douleur lorsqu’ils reçoivent ces traitements. Dernièrement, dans l’optique de mieux comprendre le fonctionnement du système neurotensinergique et de chercher des alternatives aux approches pharmacologiques, nous avons utilisé une technique d’interférence de l’ARN pour évaluer le rôle du récepteur NTS2 dans un contexte de douleur tonique. Nous avons alors montré que l’invalidation génique de ce récepteur était en mesure d'inhiber complètement l’effet analgésique induit normalement suivant une injection intrathécale de l’agoniste JMV431. Cette preuve de concept nous indique l’importance de ce récepteur dans la modulation de la douleur et montre également que l’interférence de l’ARN représente une technologie applicable au niveau du système nerveux central. Finalement, à la lumière de nos résultats, il est possible d'affirmer que le système neurotensinergique représente de nouvelles cibles thérapeutiques très prometteuses pour diminuer les signes de douleur neuropathique de type réflexif en plus d’améliorer différents paramètres de qualité de vie. Il est alors possible d’espérer que des agonistes neurotensinergique feront prochainement leur chemin ver la clinique afin d’améliorer le bien-être des patients. [symboles non conformes]

Le trouble dépressif majeur est une pathologie qui atteint 20% de la population et qui représente le premier facteur de morbidité et d’incapacité au niveau mondial. Récemment, le canal potassique TREK-1 est une cible potentielle avérée dans le traitement de la dépression. La délétion de ce canal ou son blocage par un peptide dérivé résultant de la maturation de la sortiline, le propeptide (PE) ou son analogue synthétique la Spadine, résulte en un phénotype de résistance à la dépression. La sortiline est une protéine capable de s’associer à TREK-1 mais également au facteur neurotrophique BDNF important pour la viabilité neuronale et la régulation de l’état dépressif. La sortiline est donc impliquée dans la régulation de l’adressage intracellulaire de TREK-1 et du BDNF. Mes travaux se sont d’abords focalisés sur les conséquences de la délétion du gène codant pour la sortiline (Sort1-/-) sur l’adressage de TREK-1 et du BDNF, et également sur le système neurotensinergique. Les résultats révèlent au niveau cérébral une diminution de l’expression membranaire de TREK-1 et une augmentation de BDNF. L’ensemble de ces modifications conduisent les souris Sort1-/- à développer un phénotype de résistance à la dépression. De plus, ces souris présentent une augmentation de la concentration en neurotensine cérébrale ainsi que de son récepteur 2, ce qui entraine une résistance à la douleur. Par la suite, nous avons montré une diminution de la concentration sérique du PE chez les personnes dépressives, un niveau restauré après traitement avec des antidépresseurs. En conclusion, la sortiline joue un rôle prépondérant dans la régulation du trouble dépressif et aussi dans la nociception. / Major depressive disorder is a condition that affects 20% of the population and is the leading cause of morbidity and disability worldwide. Recently, the TREK-1 potassium channel has been shown to be a potential target in the treatment of depression. The deletion of this channel or its blocking by a derived peptide resulting from the maturation of Sortilin, propeptide (PE), or its synthetic analogue Spadin, results in a phenotype of resistance to depression in mice. Sortilin is a protein able to bind with TREK-1 but also with the neurotrophic factor BDNF, an important factor for neuronal viability and depressive state regulation. Sortilin is therefore involved in regulating the intracellular addressing of TREK-1 and BDNF. Initially, my work focused on the consequences of the deletion of the Sortilin gene (sort1-/-) on the TREK-1 and BDNF addressing, and the neurotensinergic system. The results showed a decrease in TREK-1 membrane expression at the cerebral level and an increase in BDNF. All of these changes lead the Sort1-/- mice to develop a phenotype of resistance to depression. In addition, these mice show an increase in brain neurotensin concentration and its receptor 2, leading to increased resistance to pain perception. In a second phase, I was interested in whether PE, a potential antidepressant, showed serum variations in depressed patients and could be an indicator of depressive syndrome. We showed that the serum PE level is significantly reduced in depressed people, a level restored after treatment with antidepressants. In conclusion, Sortilin plays a major key in the regulation of depressive disorder and also in nociception.

Ces dernières années, le ciblage des RCPG avec des ligands radiomarqués est devenu très important en imagerie nucléaire, notamment avec le remplacement progressif d’analogues peptidiques de la somatostatine marqués à l’111In pour la TEMP par d’autres marqués au 68Ga pour l'imagerie TEP qui présente une meilleure efficacité diagnostique. Les récepteurs de haute affinité de la bombésine (GRPR) ou de la neurotensine (NTR1) sont eux aussi des RCPG surexprimés par les cellules tumorales par rapport au tissu sain. Le GRPR est surexprimé dans 83% des carcinomes mammaires canalaires estrogènes dépendants. Dans la première partie de ce travail, nous avons démontré qu’un agoniste du GRPR, l’AMBA marqué au 68Ga, permettait la détection en TEP d’un modèle murin de cancer du sein humain estrogène-dépendant et qu’il permettait de prédire la réponse tumorale à une hormonothérapie de manière plus sensible que le 18F-FDG.L’équipe du Dr. Gruaz-Guyon a développé de nouveaux radioligands analogues de la neurotensine pour le ciblage des tumeurs exprimant le NTR1 et a étudié les propriétés de ces peptides marqués à l'111In dans un modèle de tumeurs d’adénocarcinome colique surexprimant le NTR1. L’obtention d’images TEMP de contraste élevé, permettant une détection des greffes tumorales dans des temps courts après injection, a conduit cette équipe à envisager ce traceur peptidique pour l’imagerie TEP. Dans la seconde partie de ce travail, nous avons réalisé le radiomarquage au 68Ga du meilleur de ces dérivés (DOTA NT20.3) et évalué son potentiel pour l'imagerie TEP et la détection de tumeurs d’adénocarcinome colique. La surexpression de NTR1 a été démontrée dans plusieurs autres cancers comme l’adénocarcinome pancréatique (PDAC) (75-88%). Nous avons donc voulu étudier l'expression du NTR1 dans une tumorothèque locale de PDAC. Nous avons ensuite démontré le potentiel du 68Ga-DOTA-NT20.3 pour l’imagerie TEP dans deux modèles murins de PDAC humains. Nous avons caractérisé sa biodistribution, évalué sa spécificité in vivo et l’avons comparé au 18F-FDG, notamment pour valider sa capacité à discriminer in vivo la pancréatite de l’adénocarcinome pancréatique. / In recent years, the targeting of G protein-coupled membrane receptors (GPCRs) with radiolabeled ligands has become very important in nuclear imaging, particularly with the progressive replacement of somatostatin analogues labelled with 111In for SPECT by others labelled with 68Ga for PET imaging, which improves diagnostic efficacy. High-affinity bombesin receptors (GRPR) or neurotensin receptors (NTR1) are also GPCRs overexpressed in many cancers as compared with normal tissue. GRPR is overexpressed in 83% of estrogen-dependent ductal carcinomas. In the first part of this work, we demonstrated that 68Ga-AMBA, an agonist ligand of GRPR, allowed the PET detection of a mouse model of estrogen-dependent breast cancer and could be more sensitive than 18F-FDG to predict and monitor tumour response to hormone therapy.Dr. Gruaz-Guyon's team has developed new neurotensin radioanalogues for targeting NTR1-positive tumours. They studied the properties of these 111In-labeled peptides in a model of colon adenocarcinoma overexpressing NTR1. Obtaining high-contrast images allowing the detection of cancer within a short time after injection, this team subsequently developed this peptide radiotracer for PET imaging. In the second part of this work, we carried out the 68Ga radiolabeling of the best-performing of these derivatives and evaluated its potential for PET imaging of colon adenocarcinoma in a tumor model. Overexpression of NTR1 has been demonstrated in several human cancers such as PDAC (75-88%). We characterized the expression of NTR1 using specimens of human pancreatic cancer and then demonstrated the potential of this PET radiotracer to image two mouse models of human PDAC. We characterized its biodistribution, assessed its specificity in vivo in comparison with 18F-FDG, in particular its ability to discriminate in vivo pancreatitis from pancreatic adenocarcinoma.

Une personne sur trois sera diagnostiquée d'un cancer au cours de sa vie. Malgré les progrès importants dans le développement de traitements anti-cancéreux, de nombreux défis restent à relever pour les scientifiques. Certains des cancers les plus fréquents (sein, prostate, poumon) produisent souvent des métastases osseuses lorsqu'ils atteignent un stade avancé. En plus d'être associées à un pronostic pauvre, ces métastases provoquent chez les patients des douleurs qui figurent parmi les plus difficiles à traiter. Notre étude visait à développer un modèle animal qui serait le plus représentatif possible de la réalité clinique et ce, afin d'évaluer le potentiel de nouveaux traitements anti-douleurs. Nous avons donc mis au point un modèle d'injection de cellules mammaires syngéniques dans le fémur du rat. La tumeur s’est développée sur une période de 3 semaines et sa progression a été suivie à l'aide d’une évaluation comportementale et de différentes techniques d’imagerie (pCT, IRM et TEP). Nous avons pu détecter l'apparition de douleur à l'aide de plusieurs tests comportementaux à partir du jour 14 après l'implantation des cellules tumorales. L'imagerie par résonance magnétique nous a cependant permis de détecter l'apparition d'une tumeur dans la moelle osseuse à partir du jour 8 et la tomodensitométrie a permis de suivre la progression de la dégradation osseuse à partir de ce stade précoce. L’utilisation de divers traceurs de l'activité métabolique tumorale et osseuse en TEP a également permis d'analyser les effets du développement de la tumeur sur l’environnement osseux. Le volume de la tumeur et l'état de dégradation de l'os extraits de la prise d'image ont été corrélés aux niveaux de douleur mesurés chez les animaux. La mise en place de ces outils ouvre la voie à une évaluation améliorée du potentiel de traitements analgésiques ou anticancéreux dans ce modèle. Nous avons donc amorcé une étude portant sur la neurotensine et ses récepteurs NTS1 et NTS2. Nous avons pu observer que l’injection intrathécale de plusieurs analogues de la neurotensine a un bon potentiel analgésique dans notre modèle. Ces analogues et d'autres qui seront testés dans l'avenir pourraient représenter une avenue intéressante pouvant servir de complément aux thérapies actuelles. [symboles non conformes]

La dopamine (DA) est un neurotransmetteur impliqué dans la modulation de fonctions essentielles du cerveau telles que le contrôle des mouvements volontaires, le système de récompense et certains aspects de la cognition. Depuis sa découverte, la DA a attiré énormément d'attention scientifique en partie à cause des pathologies majeures associées aux dysfonctions du système DAergique, comme la maladie de Parkinson, la schizophrénie et la toxicomanie. On retrouve la majorité des neurones qui synthétisent la DA au niveau du mésencéphale ventral, dans les noyaux de la substance noire compacte (SNc) et de l'aire tegmentaire ventrale (ATV). Ces neurones projettent leurs axones dans un très dense réseau de fibres qui s'organisent en trois voies DAergiques classiques: la voie nigrostriée, la voie mésolimbique et la voie mésocorticale. La transmission DAergique s'effectue par l'activation de récepteurs de la DA qui font partie de la grande famille des récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs). Les récepteurs de la DA sont abondamment exprimés aussi bien par les neurones DAergiques que par les neurones des régions cibles, ce qui implique que la compréhension de la signalisation et des fonctions particulières des récepteurs de la DA pré- et postsynaptiques représente un enjeu crucial dans l'étude du système DAergique. Cette thèse de doctorat se sépare donc en deux volets distincts: le premier s'intéresse à la régulation du récepteur D2 présynaptique par la neurotensine (NT), un neuropeptide intimement lié à la modulation du système DAergique; le deuxième s'intéresse au côté postsynaptique du système DAergique, plus particulièrement à la ségrégation de l'expression des récepteurs de la DA dans le striatum et aux fonctions de ces récepteurs dans l'établissement des circuits neuronaux excitateurs prenant place dans cette région. Dans la première partie de cette thèse, nous démontrons que l'activation du récepteur à haute affinité de la NT, le NTR1, provoque une internalisation hétérologue du récepteur D2, avec une amplitude et une cinétique différente selon l'isoforme D2 observé. Cette internalisation hétérologue dépend de la protéine kinase C (PKC), et nous montrons que la surexpression d'un récepteur D2 muté sur des sites de phosphorylation par la PKC ii ainsi que l'inhibition de l'expression de β-arrestine1 par ARNs interférents dans des neurones DAergiques bloquent complètement l'interaction fonctionnelle entre le NTR1 et le D2. Dans la deuxième partie de cette thèse, nous démontrons d'abord que la ségrégation de l'expression des récepteurs D1 et D2 dans le striatum est déjà bien établie dès le 18e jour embryonnaire, bien qu'elle progresse encore significativement aux jours 0 et 14 postnataux. Nos résultats témoignent aussi d'un maintien complet de cette ségrégation lorsque les neurones striataux sont mis en culture aussi bien en présence ou en absence de neurones corticaux et/ou mésencéphaliques. Ensuite, nous montrons que la présence de neurones mésencéphaliques stimule la formation d’épines et de synapses excitatrices sur les neurones striataux épineux exprimant le récepteur D2 (MSN-D2). Le co-phénotype glutamatergique des neurones dopaminergiques semble nécessaire à une grande partie de cet effet. Par ailleurs, le nombre total de terminaisons excitatrices formées sur les MSN-D2 par les neurones corticaux et mésencéphaliques apparaît être régit par un équilibre dynamique. Finalement, nous démontrons que le blocage de la signalisation des récepteurs D1 et D2 de la DA n'est pas nécessaire pour la formation des synapses excitatrices des MSN-D2, alors que l'antagonisme des récepteurs glutamatergiques ionotropes diminue la densité d'épines dendritiques et contrôle de façon opposée le nombre de terminaisons excitatrices corticales et mésencéphaliques. Globalement, ce travail représente une contribution significative pour une meilleure compréhension du fonctionnement normal du système DAergique. Ces découvertes sont susceptibles d’être utiles pour mieux comprendre les dysfonctions de ce système dans le cadre de pathologies du cerveau comme la maladie de Parkinson. / Dopamine (DA) is a neurotransmitter involved in the modulation of essential brain functions such as control of voluntary movements, the reward system and certain aspects of cognition. Since its discovery, DA has attracted a lot of attention, in part because of the severe pathologies associated with dysfunctions in the DAergic system such as Parkinson's disease, schizophrenia and substance abuse. In the brain, the majority of DAergic neurons are found in the substantia nigra pars compacta (SNc) and the ventral tegmental area (VTA), two nuclei of the ventral mesencephalon. These neurons project theirs axons in a dense network of DAergic fibers that form three major pathways: the nigrostriatal, mesolimbic and mesocortical pathways. DAergic transmission is accomplished by the activation of DAergic receptors that are part of the G protein-coupled receptor family. These receptors are abundantly expressed by DAergic target neurons and DAergic neurons themselves, which implicates that the comprehension of DAergic signaling and specific receptor function pre- and postsynaptically is a crucial aspect in the study of DA. This thesis is thus divided into two distinct parts: the first part addresses the regulation of presynaptic D2 receptor function by neurotensin, a neuropeptide intimately associated with the modulation of the DAergic system; the second part addresses the postsynaptic influences of DA, looking specifically at the segregation of DAergic receptor expression in the developing striatum and the function of these receptors in the establishment of neuronal excitatory connections in this region. In the first part of this thesis, we demonstrate that the activation of the high affinity neurotensin receptor, NTR1, induces heterologous D2 receptor internalization, with some particular differences in the amplitude and kinetics between the two D2 isoforms. This internalization is dependent on protein kinase C activity (PKC), and we demonstrate that overexpression of a D2 receptor with mutations on PKC phosphorylation sites and the knockdown of β-arrestin1 by interfering RNAs in cultured DAergic neurons completely abrogates the functional interaction between the NTR1 and the D2. iv In the second part of this thesis, we first demonstrate that D1 and D2 DAergic receptor segregation is already well established in the striatum by embryonic day 18, even if it still progresses significantly through postnatal days 0 and 14. Our results also show complete maintenance of this segregation in cultured MSNs either with or without cortical and/or mesencephalic neurons. Next, we demonstrate that the presence of mesencephalic neurons stimulates excitatory synapse formation on D2-expressing striatal medium spiny neurons (D2-MSNs). The conditional genetic deletion of the glutamatergic co-phenotype of DA neurons prevents much of this effect, and thus glutamate corelease by DA neurons seems to play an important role in excitatory synapse formation in the striatum. We also find that the establishment of excitatory terminals by cortical and mesencephalic neurons is regulated by a dynamic equilibrium. Finally, we show that chronic DA receptor blockade is not required for D2-MSN synaptogenesis, but chronic glutamatergic receptor blockade decreases dendritic spine formation and regulates cortical and mesencephalic glutamatergic synapses in an opposite manner. Globally, this work represents a significant contribution to a better understanding of the normal functioning of the DAergic system. These discoveries could prove useful to better understand the dysfunctions of this system in the context of brain pathologies such as Parkinson’s disease.

La dopamine (DA) est un neurotransmetteur impliqué dans la modulation de fonctions essentielles du cerveau telles que le contrôle des mouvements volontaires, le système de récompense et certains aspects de la cognition. Depuis sa découverte, la DA a attiré énormément d'attention scientifique en partie à cause des pathologies majeures associées aux dysfonctions du système DAergique, comme la maladie de Parkinson, la schizophrénie et la toxicomanie. On retrouve la majorité des neurones qui synthétisent la DA au niveau du mésencéphale ventral, dans les noyaux de la substance noire compacte (SNc) et de l'aire tegmentaire ventrale (ATV). Ces neurones projettent leurs axones dans un très dense réseau de fibres qui s'organisent en trois voies DAergiques classiques: la voie nigrostriée, la voie mésolimbique et la voie mésocorticale. La transmission DAergique s'effectue par l'activation de récepteurs de la DA qui font partie de la grande famille des récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs). Les récepteurs de la DA sont abondamment exprimés aussi bien par les neurones DAergiques que par les neurones des régions cibles, ce qui implique que la compréhension de la signalisation et des fonctions particulières des récepteurs de la DA pré- et postsynaptiques représente un enjeu crucial dans l'étude du système DAergique. Cette thèse de doctorat se sépare donc en deux volets distincts: le premier s'intéresse à la régulation du récepteur D2 présynaptique par la neurotensine (NT), un neuropeptide intimement lié à la modulation du système DAergique; le deuxième s'intéresse au côté postsynaptique du système DAergique, plus particulièrement à la ségrégation de l'expression des récepteurs de la DA dans le striatum et aux fonctions de ces récepteurs dans l'établissement des circuits neuronaux excitateurs prenant place dans cette région. Dans la première partie de cette thèse, nous démontrons que l'activation du récepteur à haute affinité de la NT, le NTR1, provoque une internalisation hétérologue du récepteur D2, avec une amplitude et une cinétique différente selon l'isoforme D2 observé. Cette internalisation hétérologue dépend de la protéine kinase C (PKC), et nous montrons que la surexpression d'un récepteur D2 muté sur des sites de phosphorylation par la PKC ii ainsi que l'inhibition de l'expression de β-arrestine1 par ARNs interférents dans des neurones DAergiques bloquent complètement l'interaction fonctionnelle entre le NTR1 et le D2. Dans la deuxième partie de cette thèse, nous démontrons d'abord que la ségrégation de l'expression des récepteurs D1 et D2 dans le striatum est déjà bien établie dès le 18e jour embryonnaire, bien qu'elle progresse encore significativement aux jours 0 et 14 postnataux. Nos résultats témoignent aussi d'un maintien complet de cette ségrégation lorsque les neurones striataux sont mis en culture aussi bien en présence ou en absence de neurones corticaux et/ou mésencéphaliques. Ensuite, nous montrons que la présence de neurones mésencéphaliques stimule la formation d’épines et de synapses excitatrices sur les neurones striataux épineux exprimant le récepteur D2 (MSN-D2). Le co-phénotype glutamatergique des neurones dopaminergiques semble nécessaire à une grande partie de cet effet. Par ailleurs, le nombre total de terminaisons excitatrices formées sur les MSN-D2 par les neurones corticaux et mésencéphaliques apparaît être régit par un équilibre dynamique. Finalement, nous démontrons que le blocage de la signalisation des récepteurs D1 et D2 de la DA n'est pas nécessaire pour la formation des synapses excitatrices des MSN-D2, alors que l'antagonisme des récepteurs glutamatergiques ionotropes diminue la densité d'épines dendritiques et contrôle de façon opposée le nombre de terminaisons excitatrices corticales et mésencéphaliques. Globalement, ce travail représente une contribution significative pour une meilleure compréhension du fonctionnement normal du système DAergique. Ces découvertes sont susceptibles d’être utiles pour mieux comprendre les dysfonctions de ce système dans le cadre de pathologies du cerveau comme la maladie de Parkinson. / Dopamine (DA) is a neurotransmitter involved in the modulation of essential brain functions such as control of voluntary movements, the reward system and certain aspects of cognition. Since its discovery, DA has attracted a lot of attention, in part because of the severe pathologies associated with dysfunctions in the DAergic system such as Parkinson's disease, schizophrenia and substance abuse. In the brain, the majority of DAergic neurons are found in the substantia nigra pars compacta (SNc) and the ventral tegmental area (VTA), two nuclei of the ventral mesencephalon. These neurons project theirs axons in a dense network of DAergic fibers that form three major pathways: the nigrostriatal, mesolimbic and mesocortical pathways. DAergic transmission is accomplished by the activation of DAergic receptors that are part of the G protein-coupled receptor family. These receptors are abundantly expressed by DAergic target neurons and DAergic neurons themselves, which implicates that the comprehension of DAergic signaling and specific receptor function pre- and postsynaptically is a crucial aspect in the study of DA. This thesis is thus divided into two distinct parts: the first part addresses the regulation of presynaptic D2 receptor function by neurotensin, a neuropeptide intimately associated with the modulation of the DAergic system; the second part addresses the postsynaptic influences of DA, looking specifically at the segregation of DAergic receptor expression in the developing striatum and the function of these receptors in the establishment of neuronal excitatory connections in this region. In the first part of this thesis, we demonstrate that the activation of the high affinity neurotensin receptor, NTR1, induces heterologous D2 receptor internalization, with some particular differences in the amplitude and kinetics between the two D2 isoforms. This internalization is dependent on protein kinase C activity (PKC), and we demonstrate that overexpression of a D2 receptor with mutations on PKC phosphorylation sites and the knockdown of β-arrestin1 by interfering RNAs in cultured DAergic neurons completely abrogates the functional interaction between the NTR1 and the D2. iv In the second part of this thesis, we first demonstrate that D1 and D2 DAergic receptor segregation is already well established in the striatum by embryonic day 18, even if it still progresses significantly through postnatal days 0 and 14. Our results also show complete maintenance of this segregation in cultured MSNs either with or without cortical and/or mesencephalic neurons. Next, we demonstrate that the presence of mesencephalic neurons stimulates excitatory synapse formation on D2-expressing striatal medium spiny neurons (D2-MSNs). The conditional genetic deletion of the glutamatergic co-phenotype of DA neurons prevents much of this effect, and thus glutamate corelease by DA neurons seems to play an important role in excitatory synapse formation in the striatum. We also find that the establishment of excitatory terminals by cortical and mesencephalic neurons is regulated by a dynamic equilibrium. Finally, we show that chronic DA receptor blockade is not required for D2-MSN synaptogenesis, but chronic glutamatergic receptor blockade decreases dendritic spine formation and regulates cortical and mesencephalic glutamatergic synapses in an opposite manner. Globally, this work represents a significant contribution to a better understanding of the normal functioning of the DAergic system. These discoveries could prove useful to better understand the dysfunctions of this system in the context of brain pathologies such as Parkinson’s disease.

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Le système dopaminergique (DA) méso-corticolimbique du cerveau, qui prend son origine dans l'aire tegmentaire ventrale (ATV), est fortement impliqué dans les comportements motivés et la toxicomanie. Les drogues d'abus activent ce système et y induisent une plasticité synaptique de longue durée. Les neurones DA de l'ATV reçoivent sur leur arborisation dendritique une grande densité de terminaisons glutamatergiques. Les drogues d'abus induisent une potentialisation à long terme (PLT) de ces contacts glutamatergiques. La PLT est une augmentation prolongée de la transmission synaptique, qui semble sous-tendre la mémoire et l'apprentissage. Les endocannabinoïdes (ECs) sont des neurotransmetteurs qui agissent de façon rétrograde sur des récepteurs présynaptiques (CB1) pour diminuer la libération des neurotransmetteurs comme le glutamate. Les neurones libèrent les ECs à partir de leur compartiment somatodendritique suite à une stimulation des afférences et la dépolarisation membranaire qui s’ensuit. La neurotensine (NT) est un neuropeptide retrouvé de façon abondante dans le système DA du cerveau. Il a été découvert que la NT peut induire la libération des ECs dans le striatum. En faisant appel à une combinaison d’approches immunohistochimique, électrophysiologique et pharmacologique chez la souris, nous avons confirmé dans la première étude de cette thèse la présence des récepteurs CB1 sur les terminaisons glutamatergiques des neurones DA de l'ATV, et avons montré que leur activation induit une diminution de la libération de glutamate. Par ailleurs, nous avons montré que des trains de stimulation peuvent induire la libération des ECs. Nous avons découvert qu'en présence d'un antagoniste des récepteurs CB1, il y a facilitation de l’induction de la PLT. Cette observation suggère que les ECs ont un effet inhibiteur sur l’induction de la PLT, plutôt que sur son expression. Nous avons déterminé que le 2-arachidonoylglycerol (2-AG) est l’EC qui est principalement responsable de cette action inhibitrice. Finalement, la PLT induite en présence d’un antagoniste CB1 est aussi dépendante d'une activation des récepteurs NMDA du glutamate. Les travaux réalisés dans la deuxième étude de cette thèse ont montré que la NT est présente dans une sous-population de terminaisons axonales glutamatergiques dans l’ATV. Une application exogène de NT induit une diminution prolongée de l'amplitude des courants postsynaptiques excitateurs (CPSEs). Cette diminution est bloquée en présence d'un antagoniste non-sélectif des récepteurs à la NT, ainsi qu'en présence d'un antagoniste sélectif pour le récepteur de NT de type 1 (NTS1). Confirmant l’implication d’une production d’ECs, la baisse des CPSEs par la NT a été bloquée en présence d’un antagoniste des récepteurs CB1 ou d’un bloqueur de la synthèse de 2-AG. La chélation du calcium intracellulaire n'empêchait pas l’effet inhibiteur de la NT sur les CPSEs, cependant, l'inhibition des protéines G ou de la phospholipase C a complètement bloqué la dépression synaptique induite par la NT. Par ailleurs, nos travaux ont montré que la nature prolongée de la dépression synaptique induite par la NT exogène s’explique par une libération soutenue des ECs, et non pas à une activation prolongée des NTR. Finalement, notre observation qu’un antagoniste des récepteurs de la NT ne facilite pas l’induction de la PLT, comme le fait un antagoniste du récepteur CB1, suggère que la stimulation répétitive des afférences glutamatergiques nécessaire à l’induction de la PLT n’induit pas de libération des ECs via la libération de NT, nous permettant ainsi de conclure que la sécrétion de NT n'agit pas dans ces conditions comme un facteur de régulation négative de la PLT. / The meso-corticolimbic dopamine (DA) system of the brain, originating in the ventral tegmental area (VTA), is strongly implicated in reward, motivation and drug addiction. Drugs of abuse activate this system and cause significant long term plasticity. DA neurons in the VTA receive are densely innervated by glutamatergic inputs. All major classes of drugs of abuse have been found to cause a long term potentiation (LTP) of glutamate transmission onto DA neurons of the VTA. LTP is an enduring increase of synaptic transmission, hypothesized to underlie memory and learning. Endocannabinoids (ECs) are transmitters that act in a retrograde fashion on pre-synaptic receptors leading to a decrease in neurotransmitter release. DA neurons can release ECs from their somatodendritic compartment in response to afferent stimulation or depolarization. Neurotensin (NT) is a neuropeptide that presents an extensive interaction with the DA system. It was discovered that NT can induce production of ECs in the striatum. In the first study of this thesis, we used a combination of immunohistochemical, pharmacological and electrophysiological techniques in mouse brain slices to demonstrate that CB1 EC receptors are present on glutamatergic afferents to DA neurons. Their activation induces a depression of glutamate release. We further showed that trains of afferent stimulation induce EC release from DA neurons and that in the presence of the CB1 antagonist AM251, there is a marked facilitation of the induction of LTP, suggesting that ECs produced in response to activation of glutamate synapses normally negatively regulate the induction, but not the expression of LTP. Finally, we found that 2-arachidonoylglycerol (2-AG) is the main EC implicated in this negative regulation of LTP and that LTP induced in the presence of a CB1 receptor antagonist is otherwise also dependent on NMDA glutamate receptors. In the second study, we report that NT is present in a subset of glutamatergic axon terminals in the VTA and that activation of NT receptors by exogenous NT induces a long-lasting decrease of the amplitude of excitatory postsynaptic currents (EPSCs) in VTA DA neurons. This decrease was blocked by a broad-spectrum NTR antagonist, as well as by a specific antagonist of the type 1 NT receptor NTS1. The decrease was also blocked when CB1 receptors or 2-AG synthesis were blocked. Chelating intracellular calcium had no effect, but inhibiting G-proteins or phospholipase C blocked NT-mediated synaptic depression. The long-lasting nature of the synaptic depression induced by NT was due to protracted EC release and not to prolonged NT receptor activation. Finally, our observation that a NT receptor antagonist did not facilitate LTP induction, as did a CB1 receptor antagonist, suggests that repetitive stimulation of glutamatergic afferents required to induce LTP does not cause EC production through the release of NT, thus allowing us to conclude that secretion of NT does not act under such conditions as a negative regulator of LTP.