Les cancers des voies aéro-digestives supérieures (VADS) sont des cancers de mauvais pronostic avec 50% de rechute des patients dans les deux ans qui suivent leur traitement. La surexpression des protéines anti-apoptotiques de la famille Bcl-2 est un des marqueurs corrélés avec la résistance aux divers traitements. L’objectif de ce travail a été d’évaluer l’efficacité d’une approche thérapeutique associant l’irradiation à un inhibiteur des protéines anti-apoptotiques Bcl-2 et Bcl-XL, l’ABT-737 (Laboratoires Abbott), ceci à la fois sur des lignées issues de cancers de VADS, mais également sur une sous-population de cellules souches cancéreuses (CSC).La première partie de ce travail a démontré que cette association thérapeutique provoque une radio-sensibilisation des lignées cellulaires étudiées in vitro, avec augmentation de la mort cellulaire par apoptose. Cet effet synergique fait intervenir la mitochondrie, module le métabolisme des céramides et modifie l’expression de certaines protéines de la famille Bcl-2 dont l’équilibre est déterminant dans la destinée de la cellule cancéreuse. De plus, le traitement par l’ABT-737 permet de ralentir très sensiblement la croissance tumorale après irradiation sur un modèle in vivo.La deuxième partie de ce travail a permis de révéler une efficacité cytotoxique encore plus importante de l’ABT-737 sur une sous-population de CSC, résistante à l’apoptose, proliférante et tumorigène, dont le rôle dans la résistance aux divers traitements fait l’objet de nombreux travaux. A cette efficacité cytotoxique s’ajoute une diminution de la migration et de l’invasion des CSC, effet très prometteur dans la lutte contre la récidive locale et la dissémination métastatique, caractéristiques des cancers de VADS de haut grade / Head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC) are frequently characterized by chemotherapy and radiation resistance and 5-year survival rates have lingered around 50% for several decades. The frequent resistance of HNSCC is due, in large part, to aberrant inhibition of apoptosis and overexpression of antiapoptotic members of the Bcl-2 protein family. The aim of this study was to examine, in association with radiation, the impact of ABT-737, a potent small-molecule inhibitor of Bcl-XL and Bcl-2, on HNSCC cells and cancer stem cells (CSC).The first part of our work demonstrated that ABT-737 strongly synergized with radiotherapy to promote HNSCC cell death and loss of clonogenic survival. This effect involves mitochondrial damage, modulates ceramide metabolism and modify the expression of some proteins of the Bcl-2 family whose interactions with other family members determine cell fate. Moreover, we found that this combination is able to significantly slow tumor growth.The second part of our work revealed that ABT-737, even without radiation, had a preferential cytotoxic activity in vitro towards CSC. Thus, as CSC have a greater capacity for tumor relapse, increased motility and invasiveness, our data suggest that ABT-737 could effectively complement a first line of therapy with chemotherapy or radiotherapy in order to target residual quiescent HNSCC CSC

Background: Leukocytes in peripheral blood (PB) are prognostic biomarkers in head and neck squamous cell carcinoma cancer patients (HNSCC-CPs), but differences between HNSCC-CPs and healthy adults (HAs) are insufficiently described. Methods: 10-color flow cytometry (FCM) was used for in-depth immunophenotyping of PB samples of 963 HAs and 101 therapy-naïve HNSCC-CPs. Absolute (AbsCC) and relative cell counts (RelCC) of leukocyte subsets were determined. A training cohort (TC) of 43 HNSCC-CPs and 43 HAs, propensity score (PS)-matched according to age, sex, alcohol, and smoking, was used to develop a score consecutively approved in a validation cohort (VC). Results: Differences in AbsCC were detected in leukocyte subsets (p < 0.001), but had low power in discriminating HNSCC-CPs and HAs. Consequently, RelCC of nine leukocyte subsets in the TC were used to calculate 36 ratios; receiver operating characteristic (ROC) curves defined optimum cut-off values. Binary classified data were combined in a score based on four ratios: monocytes-to-granulocytes (MGR), classical monocytes-to-monocytes (clMMR), monocytes-to-lymphocytes (MLR), and monocytes-to-T-lymphocytes (MTLR); ≥3 points accurately discriminate HNSCC-CPs and HAs in the PS-matched TC (p = 2.97 × 10−17), the VC (p = 4.404 × 10−178), and both combined (p = 7.74 × 10−199). Conclusions: RelCC of leukocyte subsets in PB of HNSCC-CPs differ significantly from those of HAs. A score based on MGR, clMMR, MLR, and MTLR allows for accurate discrimination.

Zur Behandlung von Tumorerkrankungen sind radioaktiv markierte Antikörper als hochaffine und selektive Radioimmuntherapeutika von zunehmender Bedeutung. Allerdings ist der Einsatz solcher radioaktiv markierter Antikörper bei der Behandlung strahlenresistenter solider Tumore limitiert, weil infolge ihrer hohen Blutverweildauer und nur langsamen Anreicherung im Zielgewebe, bedingt durch ihre Molekülgröße, der gesamte Organismus einer hohen Strahlenbelastung ausgesetzt wird. Eine Alternative dazu stellt die Strategie des Pretargeting von Tumoren dar. Die Intention dieses Prinzips besteht darin, mittels einer mehrstufigen Applikationsfolge die Injektion eines targetspezifischen Antikörper-Konjugates und einer kleinen radioaktiv markierten Verbindung zu trennen, welche zueinander ein komplementäres System bilden. Eine Substanzklasse die erstmals von Wissenschaftlern des Helmholtz-Zentrums Dresden-Rossendorf (HZDR) als potentielles komplementäres System für Tumor-Pretargeting-Anwendungen untersucht wurden ist, sind spiegelbildliche bzw. L konfigurierte Oligonukleotide. Aufgrund ihrer hohen metabolischen Stabilität, geringen Immunogenität und sehr geringen Spezifität zu natürlich vorkommenden potentiellen Bindungspartnern sind L-Oligonukleotide, im speziellen L-DNA-Derivate, das ideale System bzgl. der In-vivo-Hybridisierung zwischen einem tumorspezifischen Antikörper und der radioaktiv markierten Chelateinheit. Das verwendete Pretargeting-System besteht aus den Radionuklid markierbaren Komponenten NOTA-L-DNA-(0-20kDa)-PEG 6a-e sowie DOTA-GA-L-DNA-10kDa-PEG 8d und aus der targetspezifischen Antikörper-Einheit, deren Entwicklung eines der Aufgabengebiete der vorliegenden Arbeit darstellte. Als Antikörper wurde dabei der klinisch zugelassene chimäre monoklonale Antikörper Cetuximab (Handelsname Erbitux®, C225) verwendet, welcher mit sehr hoher Affinität an das Oberflächenprotein „Epidermaler Wachstumsfaktor Rezeptor“ (Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR) bindet. Die Zielstellung dieser Arbeit beinhaltete vor allem die In-vitro- und In-vivo-Charakterisierung des L-DNA basierenden Pretargeting-Systems im Hinblick darauf, ob das Internalisierungsverhalten von Cetuximab einen limitierenden Faktor für seine Anwendung in Pretargeting-Experimenten darstellt. Es konnten zwei mit der komplementären L-DNA (c-L-DNA) modifizierte Cetuximab-Derivate mit einem niedrigen (n = 1,5) und einem hohen (n = 5) Konjugationsgrad an c-L-DNA hergestellt werden. Zur radiopharmakologischen Charakterisierung wurden beide Konjugate zusätzlich mit NOTA funktionalisiert und entsprechende Verfahren zur Markierung mit dem Radiometallnuklid 64Cu erarbeitet. Die Reaktionsparameter sowohl bei der Synthese als auch bei der Radiomarkierung wurden hinsichtlich des pH-Wertes, der Temperatur und der mechanischen Beanspruchung so gewählt, dass einerseits der Affinitätsverlust in Bezug zum nativen Cetuximab möglichst gering gehalten wird und andererseits die erarbeiteten Protokolle sich perspektivisch auch auf andere Antikörper übertragen lassen. Die zentrale Fragestellung dieser Arbeit bestand darin, die Internalisierungsgeschwindigkeit der beiden Cetuximab-Konjugate NOTA3-C225-(c L DNA)1,5 und NOTA3-C225-(c-L-DNA)5 im Hinblick auf deren Eignung für In vivo-Pretargeting-Experimente zu bewerten. Dabei wurde festgestellt, dass bereits nach 24 h an A431- und FaDu-Zellen 50 - 70% des auf der Zelloberfläche gebundenen Antikörpers nicht mehr für die Bindung der radioaktiv markierten Komponente zur Verfügung stand. 72 h nach der Antikörperapplikation waren sogar 80 - 90% des extrazellulär gebundenen Antikörpers internalisiert. Besonders diese hohe Internalisierungsrate könnte im Hinblick auf In-vivo-Anwendungen problematisch sein und eine geringe Tumorakkumulation der radioaktiv markierten Komponente bewirken. Infolge der Konjugation von Cetuximab mit p-SCN-Bn-NOTA 3, GMBS 9 und 17mer-c-L-DNA 2 war eine Änderung der pharmakologischen Eigenschaften von Cetuximab nachweisbar. Insbesondere dadurch, dass die Antikörpermodifikation vorrangig an den Aminogruppen der Lysin-Einheiten erfolgte und durch das 17fach negativ geladene Phosphatrückgrat des Oligonukleotids, wurde eine starke Anionisierung der Oberflächenladung und damit eine Verringerung des isoelektrischen Punktes festgestellt. Dennoch bestätigten Kompetitionsbindungsstudien an A431- und FaDu-Gesamtzellhomogenat für alle untersuchten Antikörper-Derivate unabhängig vom Konjugationsgrad deren sehr hohe Affinität zum EGFR. Auch die an intakten Zellen berechneten KD-Werte unterstreichen dies. Einzig die Bindungskapazität weist dabei eine Abhängigkeit zum Konjugationsgrad auf, sodass trotz sehr guter Ki- und KD-Werte auf eine Verringerung der Affinität infolge der Antikörpermodifikation zu schließen ist. Interessant ist auch, dass nach einem Zeitraum > 4 h eine zweite Bindungsphase auftritt, welche möglicherweise durch eine Reexpression des EGFR aus intrazellulären Kompartimenten, infolge der Internalisierung des Rezeptor-Antikörperkomplexes, hervorgerufen wird. Außerdem wurde untersucht, inwieweit die unterschiedlichen und sterisch sehr anspruchsvollen PEG-Substituenten der 17mer-L-DNA die Hybridisierung am Antikörper sowie am Rezeptor-Antikörper-Komplex an A431- und FaDu-Zellen beeinflussen. Dabei stellte sich heraus, dass die Hybridisierung am Immunkomplex in Abhängigkeit des PEGylierungsgrades vom nicht PEGylierten Konjugat [64Cu]Cu6a zum 20kDa-PEG-Derivat [64Cu]Cu6e sukzessive abnimmt. Hingegen scheint der PEGylierungsgrad bei der Hybridisierung am im Phosphatpuffer und im humanen Vollblut inkubierten Antikörper keinen Einfluss zu haben. Weiterhin wurde im Zellversuch gezeigt, dass am hoch modifizierten Cetuximab-Konjugat NOTA3-C225-(c L-DNA)5 in Abhängigkeit des Konjugationsgradunterschiedes zum niedrig modifizierten Derivat NOTA3-C225-(c L-DNA)1,5 ca. dreimal mehr Ligand hybridisiert. Erste In-vivo-Pretargeting-Untersuchungen bestätigten, dass NOTA-L-DNA-10kDa-PEG 6d der ideale „Kandidat“ für das Pretargeting-Konzept basierend auf L-konfigurierten Oligonukleotiden ist. Besonders die wesentlich höhere Tumorakkumulation von [68Ga]Ga6d (10kDa-PEG) im Vergleich zu den anderen untersuchten L-DNA-Konjugaten [68Ga]Ga 6a-c (0, 2, 5kDa PEG) und [68Ga]Ga6e (20kDa-PEG) ist dabei von besonderer Bedeutung. Zukünftige Pretargeting-Studien sollten demnach ausschließlich mit der 10kDa-PEG modifizierten 17mer-L-DNA durchgeführt werden. Die Substitution des bifunktionalen Chelators p-SCN-Bn-NOTA 3 durch DOTA-GA-Mal 7 ermöglicht den Einsatz eines breiten Spektrums therapeutisch relevanter Radionuklide wie beispielsweise 90Y, 177Lu oder auch 67Cu. Dies konnte anhand eines ersten Pretargeting-Experimentes mit NOTA3-C225-(c L DNA)1,5 und [177Lu]Lu-DOTA-GA-L-DNA-10kDa-PEG [177Lu]Lu8d bestätigt werden. Zusammenfassend muss aber festgestellt werden, dass Cetuximab als Antikörper für das Pretargeting aufgrund seiner Internalisierungscharakteristik nicht geeignet ist. Es zeigte sich zwar, dass nach 24 h mittels Pretargeting eine verringerte Leberakkumulation im Vergleich zum direkt markierten Cetuximab-Derivat [64Cu]Cu-NOTA-C225-(c-L-DNA)1,5 erzielt werden kann, allerdings fällt die Tumorakkumulation ebenfalls um ca. 40 – 70% niedriger aus und demnach wird eine deutlich geringere Dosis im Tumor angereichert. Dies lässt den Rückschluss zu, dass in vivo eine ähnlich hohe Internalisierung auftritt wie im In-vitro-Zellversuch ermittelt. Das Pretargeting-Intervall musste demnach auf 24 h festgesetzt werden, auch wenn zum Zeitpunkt der Applikation der radioaktiv markierten Komponente der Antikörper immer noch im vaskulären System zirkulierte. Kleintier-PET-Aufnahmen lassen allerdings vermuten, dass eine Applikation der radioaktiv markierten Komponente 48 h nach der Antikörper-Gabe bessere Verteilungsverhältnisse ergeben hätte. Der eigentliche Vorteil des Pretargetings, innerhalb weniger Stunden eine ähnlich hohe Tumorakkumulation zu erzielen, wie sie direkt markierte Antikörper erst nach mehreren Tagen aufweisen, konnte mit Cetuximab nicht verwirklicht werden.:Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 1 2 Zielstellung 7 3 Theoretischer Teil 9 3.1 Monoklonale Antikörper 9 3.2 Endoradionuklidtherapie mit Hilfe radiomarkierter Antikörper 11 3.3 Pretargeting-Konzepte zur Anwendung in der Radioimmuntherapie 12 3.3.1 Kennzeichen des Tumor-Pretargeting 12 3.3.2 Pretargeting unter Nutzung bispezifischer monoklonaler Antikörper 13 3.3.3 Das (Strept)avidin/Biotin-System 16 3.3.4 Komplementäre Oligonukleotide 20 3.3.4.1 D-Konfigurierte Oligonukleotid-Derivate als komplementäres System für Pretargeting-Anwendungen 20 3.3.4.2 L-Konfigurierte Oligonukleotid-Derivate als potentielle und stabile Komponenten für das Pretargeting von Tumoren 23 3.3.4.3 Pretargeting-Konzept mit L-konfigurierten Oligonukleotiden – Bisherige Arbeiten im HZDR 24 3.4 Der epidermale Wachstumsfaktor Rezeptor (EGFR) als potentielles Target für Pretargeting-Anwendungen 28 3.4.1 Die Biologie des EGFR und dessen Funktion in der Onkogenese 28 3.4.2 Der anti-EGFR-Antikörper Cetuximab 30 3.4.3 Antikörper vermittelte Rezeptorinternalisierung - ein Ausschlusskriterium für das Pretargeting? 32 4 Ergebnisse und Diskussion 35 4.1 Verwendete komplementäre L-DNA-Leitstruktur, Chelatoren und Radionuklide 35 4.2 Darstellung der Radionuklid markierbaren Komponente des Pretargeting Systems 39 4.2.1 Synthese von NOTA-Bn-thioharnstoff-ethylmaleinimid 5 39 4.2.2 Konjugation von 17mer-L-DNA-(0-20)kDa-PEG 1a-e mit NOTA-Bn-thioharnstoff-ethyl-maleinimid 5 und DOTA-GA-Mal 7 41 4.3 Darstellung der targetspezifischen Komponente – Funktionalisierung von Cetuximab mit komplementärer L-DNA 44 4.3.1 Synthesestrategie 44 4.3.2 NOTA-Funktionalisierung von Cetuximab 46 4.3.2.1 Syntheseplanung und Durchführung 46 4.3.2.2 Analytische Charakterisierung des Derivates 47 4.3.3 Maleinimid-Funktionalisierung von NOTA3-C225 51 4.3.3.1 Syntheseplanung und Durchführung 51 4.3.3.2 Analytische Charakterisierung der Derivate 53 4.3.4 Konjugation von NOTA3-C225-Malk mit komplementärer 17mer-L-DNA 2 55 4.3.4.1 Syntheseplanung und Durchführung 55 4.3.4.2 Analytische Charakterisierung der Derivate 56 4.4 Radiochemische Synthesen 61 4.4.1 68Ga-Markierung von NOTA-L-DNA-(0-20)kDa-PEG 6a-e 61 4.4.2 64Cu-Markierung von NOTA-L-DNA-(0-20)kDa-PEG 6a-e 63 4.4.3 64Cu-Markierung NOTA funktionalisierter Cetuximab-Derivate 65 4.4.3.1 Entwicklung einer Methode zur schonenden Radiomarkierung von Antikörpern mit 64Cu 65 4.4.3.2 Analytische Charakterisierung der 64Cu-markierten Cetuximab-Derivate mittels SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese 67 4.4.4 177Lu-Markierung von DOTA-GA-L-DNA-10kDa-PEG 8d 70 4.5 In-vitro-Charakterisierung und Bewertung des Pretargeting-Systems auf dessen Eignung für In-vivo-Anwendungen 72 4.5.1 Vorüberlegungen 72 4.5.2 Untersuchungen zur Oberflächenladung modifizierter Cetuximab- Derivate 74 4.5.3 Schmelzpunktbestimmung zur Bewertung der Hybridstabilität 77 4.5.3.1 Die Schmelztemperatur der L-DNA-(0-20)kDa-PEG/c-L-DNA- Hybride 77 4.5.3.2 Die Schmelztemperatur der L-DNA-(0-20)kDa-PEG/NOTA3-C225-(c L DNA)n-Hybride 77 4.5.3.3 Die Schmelztemperatur der NOTA-L-DNA-(0-20)kDa-PEG/NOTA3-C225-(c L DNA)n-Hybride 78 4.5.4 Untersuchungen zur Bestimmung der Abhängigkeit von PEG-Substituenten unterschiedlicher Größe auf das Hybridisierungs- verhalten 79 4.5.4.1 Vorbetrachtung 79 4.5.4.2 Hybridisierungsuntersuchungen in Phosphatpuffer 79 4.5.4.3 Hybridisierungsuntersuchungen in humanem Vollblut 81 4.5.5 Kompetitionsbindungsstudien zur Bestimmung der Affinität von konjugierten Cetuximab-Derivaten 82 4.5.5.1 Vorbetrachtung 82 4.5.5.2 Kompetitionsbindungsstudien an A431-Zellhomogenaten 83 4.5.5.3 Kompetitionsbindungsstudien an FaDu-Zellhomogenaten 84 4.5.5.4 Schlussfolgerungen 85 4.5.6 Sättigungsbindungsstudien konjugierter Cetuximab-Derivate 87 4.5.6.1 Vorbetrachtung 87 4.5.6.2 Sättigungsbindungsstudien an A431-Zellen 88 4.5.6.3 Sättigungsbindungsstudien an FaDu-Zellen 91 4.5.6.4 Schlussfolgerungen 95 4.5.7 Pretargeting-Bindungsstudien von NOTA3-C225-(c-L-DNA)1,5 und NOTA3-C225-(c-L-DNA)5 mit [64Cu]Cu6a-e an A431- und FaDu-Zellen 98 4.5.7.1 Vorbetrachtung 98 4.5.7.2 Pretargeting-Bindungsstudien an A431-Zellen 99 4.5.7.3 Pretargeting-Bindungsstudien an FaDu-Zellen 101 4.5.7.4 Schlussfolgerungen 103 4.5.8 Internalisierungs-Bindungsstudien konjugierter Cetuximab-Derivate 103 4.5.8.1 Entwicklung eines geeigneten Internalisierungsassays basierend auf dem Pretargeting-Konzept 103 4.5.8.2 Pretargeting-Bindungsstudien an A431-Zellen 106 4.5.8.3 Pretargeting-Bindungsstudien an FaDu-Zellen 113 4.5.8.4 Schlussfolgerungen 119 4.6 In-vivo-Pretargeting-Studien 121 4.6.1 Untersuchung der In-vivo-Stabilität und Bluteliminierung von [64Cu]Cu-NOTA-L-DNA-10kDa-PEG ([64Cu]Cu6d) 121 4.6.2 Kleintier-PET-Untersuchung von [64Cu]Cu-NOTA-C225-(c-L-DNA)1,5 zur Ermittlung der Pretargeting-Wartezeit 123 4.6.3 Pretargeting-Kleintier-PET-Untersuchungen von NOTA3-C225-(c L DNA)1,5 mit [68Ga]Ga-NOTA-L-DNA-(0-20)kDa-PEG ([68Ga]Ga6a-e) in Mäusen 125 4.6.4 Pretargeting-Studien von NOTA3-C225-(c L DNA)1,5 mit [64Cu]Cu-NOTA-L DNA-10kDa-PEG ([64Cu]Cu6d) in Mäusen 129 4.6.4.1 Kleintier-PET-Untersuchungen an FaDu tumortragenden NMRI nu/nu Mäusen 129 4.6.4.2 Bioverteilung nach Pretargeting-Experimenten an A431 tumortragenden NMRI nu/nu Mäusen 132 4.6.5 Pretargeting-SPECT-Untersuchungen von NOTA3-C225-(c L DNA)1,5 mit [177Lu]Lu-DOTA-GA-L-DNA-10kDa-PEG ([177Lu]Lu8d) 134 4.7 Abschließende Bewertung von Cetuximab auf dessen Eignung als Antikörper für das Tumor-Pretargeting 135 5 Zusammenfassung und Ausblick 137 6 Experimenteller Teil 141 6.1 Material 141 6.1.1 Chemikalien 141 6.1.2 Puffergemische und Lösungen 143 6.1.3 Synthetische L-Oligonukleotide 146 6.1.4 Radionuklide 146 6.1.5 Zellkulturen 146 6.1.5.1 A431-Zelllinie 146 6.1.5.2 FaDu-Zelllinie 147 6.1.6 Tiermodelle 147 6.1.7 Geräte 148 6.2 Analytische Methoden 149 6.2.1 NMR-Spektroskopie 149 6.2.2 Massenspektrometrie 149 6.2.2.1 ESI-MS 149 6.2.2.2 Maldi-TOF 150 6.2.3 UV/Vis-Spektroskopie 150 6.2.4 Chromatographie 151 6.2.4.1 Dünnschichtchromatographie (DC) 151 6.2.4.2 Hochleistungsflüssigchromatographie 151 6.3 Synthesevorschriften und analytische Daten 153 6.3.1 Synthese von NOTA-Bn-thioharnstoff-ethylmaleinimid 5 153 6.3.2 Synthese der NOTA und DOTA funktionalisierten 17mer-L-DNA- Verbindungen 154 6.3.3 Synthese konjugierter Cetuximab-Derivate 157 6.3.4 Radiochemische Synthesen 161 6.3.4.1 68Ga-Radiomarkierungen 161 6.3.4.2 64Cu-Radiomarkierungen 163 6.3.4.3 177Lu-Radiomarkierungen 167 6.4 Biologisch-chemische Methoden 168 6.4.1 Schmelzpunkt-Bestimmung Fehler! Textmarke nicht definiert. 6.4.2 Gelelektrophorese 168 6.4.2.1 Polyacrylamid-Gelelektrophorese 168 6.4.2.2 Agarosegelelektrophorese 169 6.4.2.3 Isoelektrische Fokussierung (IEF) 170 6.4.3 Zellkultur 170 6.4.3.1 Auftauen und Anzüchten von kryokonservierten Zellen 170 6.4.3.2 Kryokonservierung von Zelllinien 170 6.4.3.3 Subkultivierung 171 6.4.3.4 Zellzahlbestimmung 171 6.4.3.5 Herstellung von Zellhomogenat 172 6.4.4 Hybridisierungs- und Bindungsassays 172 6.4.4.1 In-vitro-Hybridisierungsuntersuchungen 172 6.4.4.2 Kompetitionsassay an Zellhomogenat 173 6.4.4.3 Sättigungsbindungsstudien an intakten Zellen 174 6.4.4.4 Pretargeting-Bindungsstudien 175 6.4.4.5 Internalisierungs-Bindungsstudien 176 6.4.4.6 Bicinchoninsäure-Assay (BCA) zur Proteinbestimmung 177 6.4.4.7 Gammacounter 177 6.4.5 Metabolitenanalytik 178 6.4.6 Bioverteilungsuntersuchungen 178 6.4.7 Positronen-Emissions-Tomographie (PET) 179 6.4.8 Single-Photonen-Emissions-Tomographie (SPECT) 179 7 Anhang 180 7.1 Originaldaten 180 7.1.1 Schmelzkurven 180 7.1.2 Gelelektrophorese und Autoradiographie 181 7.1.3 Bioverteilungsdaten 186 7.2 Übersicht der Substanzen 188 7.3 Abkürzungsverzeichnis 191 7.4 Literaturverzeichnis 194 7.5 Pubblikationen, Poster und Vorträge 209 7.6 Danksagung 212

Die Dissertation befasste sich mit der Entwicklung einer neuen diagnostischen Methode für in-situ-Gewebeuntersuchungen. Der Ansatzpunkt war die Untersuchung von pathologischen Veränderungen im Gewebe, die sich biochemisch in den Zellen widerspiegeln und deshalb mit schwingungsspektroskopischen Methoden, wie der IR-Spektroskopie, erfassbar sind. Das Ziel der Arbeit war die IR-spektroskopische Charakterisierung und Klassifizierung von benignen, präkanzerösen und malignen Geweben mittels chemometrischer Algorithmen auf der Basis multivariater Informationen der IR-Spektren. Um komplexe spektrale Veränderungen zu charakterisieren und die Ergebnisse statistisch abzusichern, ist für jeden Gewebetyp eine Vielzahl an Spektren erforderlich. Daher wurde zur Spektrenakkumulation das IR-mikrospektroskopische Imaging mittels Focal Plane Array Detektor (FPA) genutzt. Die Herausforderung liegt in der Datenanalyse. Der große Datenumfang macht die Anwendung multivariater Algorithmen notwendig. Angewendet wurden Clusteralgorithmen zur Spektrendifferenzierung und die SIMCA (Soft Independent Modelling of Class Analogies) zur Spektrenklassifizierung. Die Validierung der Ergebnisse erfolgt über die histologische Untersuchung der nach der spektroskopischen Messung gefärbten Gewebedünnschnitte. Die genaue Vorgehensweise bei der Auswertung wird in dieser Arbeit anhand humaner Gewebeproben dargestellt. Die untersuchten Plattenepithelkarzinome und Adenokarzinome gehören zu den epithelialen Tumoren, die oralen bzw. zervikalen Ursprungs sind. Die Übertragbarkeit der spektralen Modelle wurde mit Gewebeproben mehrerer Patienten innerhalb einer und zwischen verschiedenen Tumorarten untersucht. Das ist ein erster Schritt zum Einsatz spektroskopischer Methoden in der medizinischen Forschung und Diagnostik.

Les cancers des Voies Aérodigestives Supérieures sont classés parmi les dix cancers les plus agressifs du fait de leur radioresistance intrinsèque et leur forte probabilité de récurrence. L’objectif de ce travail a été d’étudier le potentiel radiosensibilisant de nanoparticules à base de gadolinium, AGuIX®, sur un modèle cellulaire de cancer des VADS. Après avoir déterminé et validé les conditions optimales de radiosensibilisation de notre modèle par les AGuIX®, leur localisation après internalisation ainsi que les conséquences biologiques générées à l’échelle subcellulaire ont été successivement étudiées. Enfin, une approche préliminaire protéomique a été initiée afin d’identifier des cibles moléculaires potentielles impliquées dans cette radiosensibilisation. Le traitement des cellules SQ20B avec 0.8mM Gd pendant 24h se sont révélées être optimales avec un DEF (dose enhancement factor) de 1.3. Les AGuIX® sont localisées presque exclusivement dans les lysosomes après internalisation. La radiosensibilisation est liée à une surproduction de radicaux libres oxygénés, minimisée toutefois par des défenses antioxydantes endogènes élevées. Le traitement combiné (AGuIX®+ irradiation) déclenche spécifiquement la mort cellulaire autophagique et s’accompagne d’une augmentation significative du nombre de cassures double brins résiduelles complexes. L’étude protéomique préliminaire a permis d’identifier une cible moléculaire potentiellement impliquée dans cette radiosensibilisation (la ribonucléotide réductase), cible qui fera l’objet d’une suite à ce travail. De plus, la prochaine étape sera de comprendre les mécanismes qui relient les AGuIX® internalisées dans les lysosomes avec l’augmentation de la mort cellulaire autophagique après irradiation / Head and Neck Squamous Cell Carcinoma is ranked among the top ten deadliest cancers due to its high radioresistance and recurrence. One radiosensitizing strategy is the use of high-Z metal nanoparticles. In this study, ultrasmall gadolinium-based nanoparticles, AGuIX®, were used for their potential as a radiosensitizing agent. The objectives of this work were to determine the radiosensitizing conditions of AGuIX® in an HNSCC cell model, their localization after uptake, and the biological consequences generated at the subcellular level after the combined treatment. A preliminary proteomic approach was initiated in order to identify potential molecular targets involved in radiosensitization. The treatment of SQ20B cells with 0.8mM Gd for 24h resulted in a dose enhancement factor (DEF) of 1.3. AGuIX® were predominantly localized in lysosomes. The overproduction of radical oxygen species following AGuIX® + radiation was intimately involved in the radiosensitization, although largely subdued by the high level of endogenous antioxidant defenses. Autophagy was specifically triggered after the combined treatment, while other irradiation-induced cell deaths remained unchanged. The number of complex, residual double strand breaks (DSBs) was specifically increased with AGuIX® combined to radiation. Lastly, our preliminary proteomic analysis allowed the isolation of potential molecular targets with great promise. Collectively, it seems that the radiosensitizing effect observed in this work may result from a combination of events.Future work is required to understand the mechanisms linking lysosomes-entrapped AGuIX® with the upregulation of autophagic cell death after radiation

L’inclusion récente de la profondeur d’invasion (PI) dans la classification des carcinomes épidermoïdes de la cavité orale de l’American Joint Committee on Cancer (AJCC) a des répercussions cliniques majeures. Plusieurs études ont récemment évalué la fiabilité de diverses modalités d’imagerie et techniques de biopsie pour mesurer la PI en préopératoire. L’objectif premier de ce mémoire est de réviser systématiquement la littérature et comparer les différentes méthodes décrites de mesure de PI en préopératoire pour les carcinomes épidermoïdes de la langue mobile. Le second objectif est d’étudier la précision et la fiabilité de la mesure de PI sur une biopsie au poinçon dans les carcinomes épidermoïdes de stade in situ (Tis)-T1-T2, N0 de la langue mobile. Une revue systématique a été effectuée en suivant le guide PRISMA[1]. Les études évaluant la fiabilité de la PI mesurée sur la biopsie ou l’imagerie médicale, en les comparant à la PI histopathologique finale, ont été inclues dans une méta-analyse afin d’obtenir des coefficients de corrélation combinés pour chaque modalité d’imagerie. L’imagerie par résonnance magnétique (IRM) s’est avérée être la modalité d’imagerie la mieux étudiée et présente une bonne fiabilité. Le computed tomography (CT) scan est peu étudié, mais semble moins fiable. L’échographie linguale ne peut être comparée à ces deux modalités d’imagerie car elle est plus fréquemment utilisée pour mesurer l’épaisseur tumorale que la PI. La seconde étude est une preuve de concept prospective. Un poinçon profond a été utilisé pour échantillonner la portion la plus profonde de carcinomes épidermoïdes de la langue mobile de stade Tis-T1-2, N0 chez 27 patients. Des coefficients de corrélation de Spearman ont été calculés entre la PI estimée à la palpation manuelle, mesurée à la biopsie, et à l’histopathologie. La sensibilité et la spécificité de la biopsie au poinçon pour distinguer le Tis du carcinome épidermoïde invasif ont été calculées. Bien que la PI mesurée à la biopsie ne corrèle pas fortement avec la PI histopathologique, cette preuve de concept est limitée par la taille d’échantillon. La biopsie au poinçon semble toutefois être un outil fiable pour distinguer le Tis de l’invasif. D’autres études sont nécessaires avant de pouvoir recommander l’utilisation systématique de la biopsie pour décider en préopératoire si un évidement cervical électif est nécessaire. / The inclusion of depth of invasion (DOI) in the American Joint Committee on Cancer’s staging system for oral cavity squamous cell carcinoma (SCC) has major clinical impacts. Recent studies have evaluated the reliability of imaging modalities and biopsy techniques to measure DOI preoperatively. The first objective of this master’s thesis is to systematically review and compare the preoperative DOI measurement methods that have been studied so far in oral tongue SCC (OTSCC). The second objective is to prospectively study the precision and reliability of punch biopsy to measure DOI preoperatively in early (in situ (Tis)-T1-T2, N0) OTSCC, and its ability to distinguish Tis from invasive carcinoma. A systematic review was conducted according to the PRISMA guidelines. Studies that evaluated the reliability of DOI measured on biopsy or imaging (rDOI) by comparing it to DOI on histopathology (pDOI) were included in a meta-analysis to obtain pooled correlation coefficients for each imaging modality. Overall, magnetic resonance imaging (MRI) is the better studied modality. It has a good reliability to measure preoperative rDOI in OTSCC. CT is less studied but appears to be less reliable. Ultrasound (US) cannot be compared to these imaging modality as it has been used more often to measure tumor thickness (TT) than DOI. The second study is a prospective proof-of-concept. A deep punch biopsy was used to sample tumors preoperatively in the deepest part of the tumor in 27 patients with early (Tis-T12, N0) oral tongue squamous cell carcinoma. Spearman’s correlations were calculated between DOI measured on digital palpation (cDOI), biopsy (bDOI) and final pDOI. The sensitivity and specificity of punch biopsy to distinguish Tis from invasive carcinoma was also calculated. Although bDOI does not seem to correlate strongly with pDOI, this proof-of-concept was limited by a small sample size. Punch biopsy appears to be a reliable tool to distinguish Tis from invasive carcinoma. Further studies on punch biopsy are needed to recommend its use to evaluate pDOI preoperatively and determine whether elective neck dissection is necessary in early OTSCC.

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Purpose: The Hedgehog-signalling pathway (Hh) is frequently active in head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC). Overexpressed Hh associates with poor prognosis. The Hh inhibitor vismodegib targets smoothened (SMO) and, based on molecular data, may prevent resistance to EGFR targeting. Methods: To elucidate potential roles of vismodegib in HNSCC therapy, its sole effects and those combined with cisplatin, docetaxel, and cetuximab on HNSCC cell lines were assessed by MTT metabolisation and BrdU incorporation. Colony formation (CF) of primary HNSCC cells was studied utilizing the FLAVINO-protocol. Combinatory effects were analysed regarding antagonism, additivity or synergism. Associations between the ex vivo detected mode of action of vismodegib with other treatments related to patient characteristics were assessed and progression-free survival (PFS) in patient groups compared using Kaplan-Meier curves. Results: Vismodegib suppressed BrdU incorporation significantly stronger than MTT turnover; CF was significantly inhibited at ≥20 µM vismodegib while concentrations <20 µM acted hormetic. Combining 20 µM vismodegib plus docetaxel (T), cisplatin (P), and cetuximab (E), additively enhanced antitumoral activity in HNSCC samples from patients with superior PFS highlighting a potential role for ex-vivo testing of this combination for use as a prognostic classifier. Conclusion: We provide ex-vivo evidence for vismodegib’s potential in HNSCC therapies especially if combined with cetuximab, cisplatin and docetaxel.:Abkürzungsverzeichnis 1 Einleitung 1.1 Kopf-Hals-Tumore 1.1.1 Therapie von Kopf-Hals-TumoreN 1.1.2 Limitationen der etablierten Therapien 1.2 Eingesetzte Chemotherapeutika 1.2.1 Cisplatin 1.2.2 Docetaxel 1.2.3 Cetuximab 1.3 Hedgehog-Signaltransduktionsweg 1.3.1 Hedgehog-Signalweg und Karzinogenese 1.3.2 Vermittlung von Tumortherapieresistenz durch den Hedgehog-Signalweg 1.3.3 Zielgerichtete Tumortherapie durch Blockade des Hedgehog-Signalweges 1.4 Vismodegib 1.5 Ex-Vivo-Chemoresponse-Testung mittels FLAVINO-Assay 1.6 Zusammenfassung der Rationale der Untersuchung 1.7 Aufgabenstellung der Promotionsarbeit 2 Publikation 2.1 Reduzierte Proliferation und Koloniebildung von Plattenepithelkarzinomen der Kopf Hals Region unter dualer Inhibition des EGFR- und Hedgehog-Signalweges 3 Zusammenfassung der Arbeit 4 Literaturverzeichnis 5 Anlagen 5.1 Darstellung des Eigenanteils 5.2 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 5.3 Lebenslauf 5.4 Publikationen 5.5 Danksagung

Background: Standardized staging procedures and presentation of oral squamous cell carcinoma (OSCC) patients in multidisciplinary tumor boards (MDTB) before treatment and utilization of elective neck dissection (ND) are expected to improve the outcome, especially in local advanced LAOSCC (UICC stages III–IVB). As standardized diagnostics but also increased heterogeneity in treatment applied so far have not been demonstrated to improve outcome in LAOSCC, a retrospective study was initiated. Methods: As MDTB was introduced into clinical routine in 2007, 316 LAOSCC patients treated during 1991-2017 in our hospital were stratified into cohort 1 treated before (n=104) and cohort 2 since 2007 (n=212). Clinical characteristics, diagnostic procedures and treatment modality of patients were compared using Chi-square tests and outcome analyzed applying Kaplan-Meier plots and log-rank tests as well as Cox proportional hazard regression. Propensity scores (PS) were used to elucidate predictors for impaired distant metastasis-free survival (DMFS) in PS-matched patients. Results: Most patient characteristics and treatment modalities applied showed insignificant alteration. Surgical treatment included significantly more often resection of the primary tumor plus neck dissection, tracheostomy and percutaneous endoscopic gastrostomy tube use. Cisplatin-based chemo-radiotherapy was the most frequent. Only insignificant improved disease- (DFS), progression- (PFS) and event-free (EFS) as well as tumor-specific (TSS) and overall survival (OS) were found after 2006 as local (LC) and locoregional control (LRC) were significantly improved but DMFS significantly impaired. Cox regression applied to PS-matched patients elucidated N3, belonging to cohort 2 and cisplatin-based chemo-radiotherapy as independent predictors for shortened DMFS. The along chemo-radiotherapy increased dexamethasone use in cohort 2 correlates with increased DM. Conclusions: Despite standardized diagnostic procedures, decision-making considering clear indications and improved therapy algorithms leading to improved LC and LRC, shortened DMFS hypothetically linked to increased dexamethasone use had a detrimental effect on TSS and OS.

Background: About five to 10% of cancers in the head and neck region are neck squamous cell carcinoma of unknown primary (NSCCUP). Their diagnosis and treatment are challenging given the risk of missing occult tumors and potential relapse. Recently, we described human papillomavirus (HPV)-related NSCCUP-patients (NSCCUP-P) as a subgroup with superior survival. However, standardized diagnostic workup, novel diagnostic procedures, decision-making in the multidisciplinary tumor board (MDTB) and multimodal therapy including surgery and post-operative radio-chemotherapy (PORCT) may also improve survival. Methods: For assessing the impact of standardized diagnostic processes simultaneously established with the MDTB on outcome, we split our sample of 115 NSCCUP-P into two cohorts treated with curative intent from 1988 to 2006 (cohort 1; n = 53) and 2007 to 2018 (cohort 2; n = 62). We compared diagnostic processes and utilized treatment modalities applying Chi-square tests, and outcome by Kaplan–Meier plots and Cox regression. Results: In cohort 2, the standardized processes (regular use of [18F]-FDG-PET-CT imaging followed by examination under anesthesia, EUA, bilateral tonsillectomy and neck dissection, ND, at least of the affected site) improved detection of primaries (P = 0.026) mostly located in the oropharynx (P = 0.001). From 66.0 to 87.1% increased ND frequency (P = 0.007) increased the detection of extracapsular extension of neck nodes (ECE+) forcing risk factor-adapted treatment by increased utilization of cisplatin-based PORCT that improved 5-years progression-free and overall survival from 60.4 and 45.3 to 67.7% (P = 0.411) and 66.1% (P = 0.025). Conclusions: Standardized diagnostic workup followed by ND and risk-factor adapted therapy improves survival of NSCCUP-P.