Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado académico de Magíster en Bioquímica, área de especialización en bioquímica clínica y Memoria para optar al título profesional de Bioquímico / La neurotransmisión noradrenérgica está relacionada con procesos como el aprendizaje y la memoria. Se ha observado en el cuadro depresivo una disminución en la neurotransmisión de noradrenalina (NA), alteraciones de la arquitectura dendrítica y la disminución de los niveles de factores tróficos como el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF). El hecho de que una variación de los niveles de NA pueda activar diferentes receptores adrenérgicos en el espacio sináptico, podría explicar en parte los mecanismos de plasticidad sináptica involucrados en cambios morfofuncionales, desde acciones sobre la complejidad dendrítica hasta la modulación sobre procesos complejos como aprendizaje y memoria. Esta noción es apoyada por el hecho de que los fármacos que incrementan los niveles de NA en el espacio sináptico revierten la atrofia dendrítica observada en modelos animales de depresión, y recuperan el deterioro cognitivo. En base a estos antecedentes hemos propuesto en esta Tesis que: “La activación de receptores β‐adrenérgicos promueve un aumento en la complejidad dendrítica en cultivos primarios de neuronas hipocampales”. Se obtuvieron cultivos hipocampales de ratas en estado fetal de 18 días (E18), y se cultivaron durante 7 días in vitro (7 DIV). En estos cultivos se evaluó a través de Western Blot la respuesta frente a la estimulación de receptores β‐adrenérgicos, midiendo la fosforilación de la Proteína de Unión al Elemento de Respuesta al AMP cíclico (CREB) frente a estímulos cortos (5‐ 15 minutos) con noradrenalina (100 nM) en ausencia y presencia del β‐antagonista propranolol (10 μM). Junto con ello, se observó la distribución de CREB fosforilado a través de inmunocitoquímica luego de estímulos de 2 horas con los mismos fármacos. No fue posible a través de estas técnicas observar modificaciones en la intensidad de la señal o la distribución de p‐CREB. Sin embargo, la adición de NA fue capaz de promover un incremento en el calcio citosólico, como se demostró a través del uso de sondas fluorescentes, y una reducción en la actividad neuronal evaluada por registros whole-cell. Los cultivos a los 7 DIV presentan receptores β2‐adrenérgicos, visualizados a través de Western Blot. Más aún, estudios de inmunocitoquímica muestran que el receptor β2 presenta una distribución principalmente somatodendrítica. A través de la estimulación farmacológica de los cultivos durante 24 horas con NA 100 nM o clenbuterol 25 nM, en ausencia y presencia de propranolol 10 μM, se estudió si la activación de receptores adrenérgicos modula la morfología dendrítica. Ésta fue evaluada a través de la medición de puntos de intersección (Análisis de Sholl), puntos de ramificación, largo y número de dendritas. La estimulación con clenbuterol 25 nM no produjo efecto sobre ninguno de estos parámetros, descartando la participación de los receptores β2‐ adrenérgicos en la arquitectura dendrítica. Tampoco produjo efectos en la morfología de las dendritas la administración por separado de noradrenalina o propranolol. Sin embargo, los cultivos estimulados con NA posterior a la incubación con propranolol mostraron una reducción en el número de intersecciones del análisis de Sholl en el rango de los 30‐80 μm en comparación con el control. Estos cambios están acompañados por un descenso en el largo total de las dendritas primarias, y en particular de las dendritas primarias mayores a 40 μm, sin que el número de dendritas primarias por neurona se viera modificado. Un efecto similar se observó en las dendritas secundarias. Estos resultados sugieren que los cambios en el largo dendrítico observados probablemente no se asocian a la activación de receptores β2‐adrenérgicos. Proponemos que la activación de receptores α‐ y β1‐adrenérgicos regularían la morfología neuronal, probablemente con efectos opuestos, controlando el largo dendrítico de las dendritas primarias y secundarias de mayor tamaño. El estudio realizado en esta Tesis por primera vez describe efectos de la activación de receptores adrenérgicos sobre la morfología neuronal, pudiendo explicar en parte los cambios morfológicos y mejoría cognitiva tras el tratamiento de fármacos que incrementan los niveles de NA en el espacio sináptico / Noradrenergic neurotransmission is related with processes as learning and memory. In depressive behavior, it has been observed a decrease in noradrenaline (NA) neurotransmission, alterations on dendritic arborization and a decrease in levels of trophic factors, such as brain derived neurotrophic factor (BDNF). The fact that different levels of NA can activate different adrenergic receptors at synaptic cleft, could explain part of synaptic neuroplasticity mechanisms involved in morphofunctional alterations, from actions on dendritic complexity to modulation of complex processes as learning and memory. This notion is supported by the fact that drugs that increase levels of NA at synaptic cleft reverse dendritic atrophy observed in animal models of depression, and recover cognitive impairment. Considering these antecedents, this Thesis proposed that: “Activation of β‐adrenergic receptors promotes an increase in dendritic complexity in primary cultures of hippocampal neurons”. Hippocampal primary cultures were obtained from embryonic day 18 (E18) Sprague‐Dawley rat fetuses, and cultured for 7 days in vitro (7DIV). In these cultures, changes in phosphorylation of cAMP‐response element binding protein (CREB) were evaluated by Western Blot, in response to short stimulus (5‐15 min) with 100 nM NA in absence and presence of 10 μM propanolol, a β‐adrenergic receptor antagonist. In addition, levels of phosphorylated CREB (p‐CREB) were measured by immunocytochemistry, after stimulation of 2 hours with the same drugs. It was not possible to observe modifications on signal intensity of p‐CREB through these techniques. However, the addition of NA promoted an increase in cytosolic calcium, measured by fluorescent probes for calcium, and a reduction of neuronal activity evaluated by whole‐cell recording. The 7 DIV cultures showed β2‐adrenergic receptors, which were visualized by Western Blot. Moreover, immunocytochemistry studies showed that β2‐adrenergic receptor was distributed in neurons mainly in the somato‐dendritic compartment. Through pharmacological stimulation of cultures for 24 hours with 100 nM NA or 25 nM clenbuterol, with 10 μM propranolol absent or present, the activation of adrenergic receptors and their role in dendritic morphology has been measured. Morphology was evaluated through the measurement of intersection points (Sholl Analysis), branching points, and dendritic length and number. Stimulation with 25 nM clenbuterol did not have effect on any of these parameters, thus any role of β2‐adrenergic receptors in dendritic architecture was discarded. Neither administration of NA nor propranolol alone produced effects on dendrite morphology. However, NA‐stimulated cultures after incubation with propranolol showed a reduction in the number of intersections in Sholl analysis compared with controls, in the 30‐80 μm range. Those changes were accompanied by a reduction in primary dendrites greater than 40 μm, without any modifications in primary dendrite number per neuron. A similar effect was shown in secondary dendrites. These results suggest that changes observed in dendritic length were probably not associated with the activation of β2‐adrenergic receptors. We propose that the activation of α‐ and β1‐adrenergic receptors may regulate neuron morphology, probably with opposite effects, controlling dendritic length of longer primary and secondary dendrites. The study carried out in this Thesis describes for first time the effects of adrenergic receptors activation in dendrite morphology, and may explain in part the morphological changes and cognitive improvement after treatment of drugs that increase levels of NA in the synaptic cleft

Made available in DSpace on 2018-08-01T23:27:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_9425_Dissertação de mestrado Dayane.pdf: 1472432 bytes, checksum: f34676ce3cbf77c6dfbb5049f04fb95b (MD5) Previous issue date: 2016-11-04 / O papel da substância cinzenta periaquedutal dorsal (SCPD) no medo e na ansiedade tem sido estudado ao longo das últimas décadas. As evidências sobre o envolvimento do sistema noradrenérgico na ansiedade são conflitantes, dependendo da estrutura cerebral estudada. Assim, no presente estudo, testou-se a hipótese de que a noradrenalina administrada diretamente na SCPD de ratos apresenta efeito do tipo ansiolítico no teste de transição claro-escuro. O teste de transição claro-escuro é um modelo etológico de ansiedade, de rápida e fácil execução, que não requer treinamento animal. Para isso, ratos Wistar receberam a administração intra-SCPD de noradrenalina (30, 60 ou 90 nmols) ou salina e foram expostos no teste de transição claro-escuro. Além disso, foi investigado o efeito do pré-tratamento intra-SCPD com antagonistas não seletivos de receptores adrenérgicos alfa e beta, fentolamina (10 nmols) e propranolol (10 nmols) respectivamente, sobre o efeito da injeção de noradrenalina na mesma estrutura. Após os testes, os animais eram colocados durante cinco minutos no campo aberto, para medida da atividade locomotora. Nossos resultados mostram que a noradrenalina (30 e 60 nmols) administrada diretamente na SCPD aumentou o tempo de permanência no compartimento claro e o número de transições dos animais submetidos ao teste de transição claro-escuro, sugerindo um efeito do tipo ansiolítico. Além disso, injeção intra-SCPD de noradrenalina não alterou a atividade locomotora dos animais no teste do campo aberto. Os resultados mostram ainda que o pré-tratamento intra-SCPD de propranolol ou fentolamina atenuou o efeito do tipo ansiolítico da noradrenalina quando analisado o tempo de permanência no compartimento claro do modelo. Assim, o presente trabalho sugere um envolvimento da neurotransmissão noradrenérgica na SCPD, via receptores alfa e betaadrenérgicos, em reações defensivas associadas com o transtorno de ansiedade generalizada em animais submetidos ao modelo de transição claro-escuro. Palavras-chave: Noradrenalina, substância cinzenta periaquedutal dorsal, ansiedade, teste de transição claro-escuro.

Els 2-amino-1,2,3,4-tetrahidro-1-naftols poden considerar-se com anàlegs cíclics semirígids de les ariletanolamines adrenèrgiques, de les que deriven per incorporació de dos àtoms de carboni entre l'anell aromàtic i la posició alfa respecte a l'àtom de nitrogen.En el cas de la noradrenalina, o dels seus derivats N-alquilats, la modificació pot donar lloc a dos tipus d'estructures isòmeres no equivalents, segons quina sigui la posició "orto" de l'anell aromàtic que intervé en la formació del nou anell.Existeixen alguns precedents bibliogràfics de l'aplicació d'aquesta modificació a ariletanolarnines. Aixi, quan es va aplicar a la noradrenalina, o als seus derivats, s'obtingué, en un cas, un producte amb els hidroxils fenòlics situats en les posicions 6 i 7 que va resultar inactiu com a agonista beta-adrenèrgic. En canvi, els productes hidroxilats sobre les posicions 5 i 6 resultaren potents conlagonistes beta-adrenèrgics. Aquests productes estan mancats d'activitat alfa-adrenèrgica. En tots els casos es va veure que els productes d'estereoquímica "trans" eren molt més actius que els "eis".Per tal de determinar la importància de la posició dels grups hidroxil fenòlics per la interacció amb els receptors adrenèrgics, hem aplicat l'anterior modificació a fàrmacs agonistes monofenòlics, com són l'octopanlina i el metaraminol. Amb la síntesi i posterior assaig farrnacològic dels productes "1" a "6" pretenem trobar alguna relació que ens permeti deduir quina serà la disposició adoptada per l'anell aromàtic de la noradrenalina o de la isoprenalina en la interacció amb els receptors alfa i beta, respectivament.En tots els casos s'ha partit de la tetralona amb la substitució adient, obtinguda segons els mètodes ja descrits a la bibliografia. En una primera fase es va procedir a introduir l'àtom de nitrógeno; per fer-ho es disposava de dos mètodes diferents. El primer d'ells consisteix en la transposició denominada de Neber de l'O-tosilat d'oxima de la cetona de partida en medi alcalí d'etòxld potàssic. Després de la hidròlisi de l'azirina que resulta amb àcid clorhídric s'obté una alfa-aminocetona protegida en forma d'hidroclorur. L'altre mètode per a la introducció del nitrogen consisteix en la reacció de la cetona de partida amb un nitrit orgànic en rnedi alcalí de "t"-butòxid potàssic. Així s'obté una oximinocetona.Posteriorment es realitzen les modificacions funcionals convenients fins arribar als aminoalcohols desitjats. Els compostos isopropilats sobre el grup amino s'otingueren per tractament de l'amina primària amb acetona i posterior reducció amb borohidrur sòdic. Els productes finals de tipus fenòlic s'obtingueren per desprotecció dels èters benzílics per hidrogenòlisi en medi neutre a 200 psi de pressió d'hidrogen.La determinació de la configuració dels compostos es va realitzar en base a les dades de RMN. Quant a la conformació dels de l'estudi dels valors de constants d'acoblament protons de la zona alifàtica de la molècula es dedueix que el grup hidroxil es disposa pseudoequatorial i el grup amina equatorial. Aquesta disposició per als grups OH/NH permet l'establiment d'un pont d'hidrogen que estabilitza la conformació. La conformació coincideix amb l'obtinguda a partir d'estudis de difracció de raigs X per la isoprenalina.Com que no s'ha establert inequivocament si ariletanolamines i ariloxipropanolamines interaccionen de la mateixa manera amb el receptor beta, com a segon objectiu de la Tesi es dissenyen les estructures "41" i "42", combinación molecular del prenalterol (ariloxipropanolamina) amb el rimiterol (ariletanolamina) per tal d'estudiar si ambdós tipus de molècules estan sotmesos a les mateixes relacions estructura-activitat. RESULTATS D'ACTIVITAT FARMACOLÒGI('iAEls compostos "32" i "33" s'assajaren com a alfa i beta adrenèrgics en aorta, aurícula esquerra i tràquea de cobai, respectivament. Amb anterioritat als assaigs es reserpinitzaren els animals per evitar el possible efecte indrecte tant de partons com productes problema. Els valors d"activitat obtinguts semblen indicar que el neurotransmissor, la noradrenalina, adoptaria una conformació que disposés un dels hidroxils fenòlics oposat respecte al benzílic en interactuar el receptor beta. Per la interacción amb el receptor alfa, l'anell aromàtic del neurotransmissor hauria de girar 180°. Quant als productes assajats, assenyalen el guany en selectivitat que suposa la pèrdua de l'hidroxil en posició 6 respecte a productes dienòlics ja descrits en la bibliografia. El producte que pot presentar un interès més gran és el "33ª2, que podria constItuir-se en nou cap de sèrie per a l'obtenció de broncodilatadors exempts d'acció sobre el cor.Pel que fa als productes "41" i "42" s'assajaren només com a beta-adrenèrgics. Dels resultats sembla deduir-se que la modificació molecular és vàlida per.a les ariletanolamines, com el rimiterol, i que els comunica selectivitat beta-2, no és aplicable a les ariloxipropanolamines.D'altra banda, amb la síntesi de productes en què el grup hidroxil ocupa diferents posicions en l'anell aromàtic, es pretenia veure si la posició d'aquest és tan important com per als compostos de tipus aminotetrahidronaftol. Si Comparem les activitats dels compostos "eritro-41" i "eritro-42" s'observa la pèrdua d'activitat per canvi de posición del grup, però a més de ser poc significativa té caracter contrari al dels altres compostos en què l'important és l'hidroxil en "meta" respecte a la cadena. Per tant podem afirmar que l'anell aromàtic en ariletanolamines i ariloxipropanolamines agonistes no juga el mateix paper a l'hora d'interactuar amb el receptor beta.

Orientador: Jayme Antunes Maciel Junior / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-07-23T02:52:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Araujo_IzildaEsmeniaMuglia_D.pdf: 6993278 bytes, checksum: e1d97a187e8a65fb26db778e895b72c4 (MD5) Previous issue date: 1997 / Resumo: O trauma raquimedular, atualmente, é de incidência relativamente elevada, e a parada cardiorrespiratória (PCR) é sempre uma possibilidade, especialmente na fase aguda, devido fundamentalmente aos graves distúrbios autonômicos e à hipoxemia decorrente de complicações respiratórias, que freqüentem ente acompanham a lesão medular alta. O aumento do tônus arterial periférico com drogas alfa-adrenérgicas tem sido demonstrado como de vital importância para a elevação da pressão de perfusão coronariana (pPCor) e a restauração da circulação espontânea (RCE), durante as manobras de ressuscitação cardiorrespiratória (RCR). O presente estudo avaliou os efeitos cardiocirculatórios da noradrenalina (NOR - vasopressor adrenérgico) e da angiotensina 11 (AlI - vasopressor nãoadrenérgico) em cães anestesiados intactos, e após a desconexão aguda do sistema nervoso simpático; também investigou os efeitos das mesmas drogas, em doses altas, sobre a PPCor e a RCE, durante a RCR da fibrilação ventricular induzi da eletricamente. Vinte cães mestiços, de ambos os sexos, anestesiados, foram intubados via orotraqueal e ventilados artificia}mente. A pressão aórtica (P Ao), a pressão de átrio direito (pAD)e o eletrocardiograma (ECG) foram registrados continuamente. Os animais foram divididos. em dois grupos iguais (grupo A-NOR e B-AlI), cujos dados foram analisados em três fase/s. A fase I registrou as alterações hemodinâmicas das drogas no animal sem lesão; a fase TI~, nos animais com lesão e a fase rn, nos animais em PCR. Os resultados evidenciaram que o padrão básico de resposta hemodinâmica observado no grupo A foi de elevação pressórica arterial sistêmica nas fases I e TI, com efeitos pressóricos arteriais iniciais, nos animais lesados, mais intensos que nos animais intactos, especialmente na PAo diastólica e PPCor, sendo que a duração foi mais efêmera, desaparecendo a partir do segundo minuto após sua administração. Não foram observados, nos animais lesados, os efeitos bradicardizantes da NOR, presentes nos animais intactos. No grupo B, o padrão básico de resposta hemodinâmica observado foi de elevação pressórica arterial sistêmica nas fases I e TI, com efeitos pressóricos arteriais iniciais proporciónalmente mais intensos nos animais lesados que nos animais intactos, especialmente na P Ao diastólica e PPCor. Esses efeitos foram mais acentuados e mais duradouros, quando comparados ao grupo A, em ambas as situações. Nos animais lesados (fase 11), a FC não apresentou alterações significativas. Na fase lU (RCR), a NOR e a AlI em altas doses foram significativamente efetivas em aumentar a PPCor e a RCE nos animais com lesão medular alta. Concluiu-se que os efeitos pressóricos arteriais da NOR e AlI foram mais intensos nos animais lesados, em relação aos animais intactos, sendo que o efeito bradicardizante da NOR não foi observado após a lesão medular alta. Os efeitos pressóricos da AlI foram aparentemente mais intensos e duradouros que os da NOR, especialmente nos animais lesados. A desconexão completa do sistema nervoso autônomo simpático, após a lesão, não deprimiu a resposta vascular inicial à administração de altas doses de NOR e Ali, sendo que foi observado aumento significativo da PPCor e altas taxas de RCE, durante a RCR da fibrilação ventricular / Abstract: There is nowadays a relatively high incidence of spinal cord trauma. During the acute phase , cardiac arrest (CA) is often a possibility due to serious autonomic disorders and hypoxemia, which is the result of respiratory problems. Alpha adrenergic drugs, by increasing the peripheral arterial tone, are responsible for elevating the coronary perfusion pressure (CorPP) and for restoration of spontaneous circulation (ROSC) during cardiopulmonary resuscitation (CPR) maneuvers. This study evaluated the cardiocirculatory effects of noradrenaline (NOR - adrenergic vasopressor) and angiotensin 11 (AlI - non adrenergic vasopressor) on intact anesthetized dogs, and after the acute disconnection of the sympathetic nervous system . Investigations were also conducted to observe the effects of high doses of these drugs on CorPP and ROSC during CPR of electrical1y induced ventricular fibril1ation. Twenty, male and female anesthetized mongrel dogs had orotracheal intubation and mechanical ventilation. The aortic pressure (Ao P), the right atrial pressure (RAP) and the electrocardiogram (EKG) were registered continuously. The animais were divided equal1y into two groups (group A - NOR and B - AlI) . The data were analyzed in three phases. The hemodynamic alterations resulting from the drugs were reported in animaIs having no Jesions, in phase I; in animais having lesions, in phase 11 and in animaIs having CPR, in phase In. The standard hemodynamic response observed in group A was an increase in the systemic arterial pressure during phase I and 11 with intense initial effects, especial1y seen on the diastolic Ao P and Cor PP of injured animais rather than those of intact ones . These effect were ephemeral and disappeared two minutes after administering the drugs . NOR- bradycardiac effects were not seen in the injured animaIs, contrary to the observed in the intact ones. The standard hemodynamic response observed in group B was an increase in the arterial systemic pressure during phase I and 11, having intense initial pressor effects on the diastolic AoP and Cor PP in injured animaIs than in intact ones. The effects in this group were more intense and lasted longer thépl in group A, in both phases. The heart rate did not change significant1y in injured anirnals during phase 11. In phase 111 (CPR), NOR and AlI in high doses were both significt1y effective for increasing CorPP and restoring spontaneous circulation in injured animais. It can be conc1uded that NOR and AlI arterial pressor effects were more intense in injured rather than in intact animaIs. The bradycardiac effects of NOR were totally annuled after serious medullary lesion. In injured animaIs especially, the pressor effects of AlI were apparently more intense and longer lasting than that of NOR. After injury, the complete disconnection of the sympathetic nervous system did not preclude the initial vascular response when high doses of NOR and AlI were administered during CPR. A significant increase in Cor PP and high rates of ROSC were observed during the CPR of ventricular fibrillation / Doutorado / Doutor em Neurociencias

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado de Doctor en Farmacología / La hipertrofia cardíaca es una respuesta adaptativa desencadenada por una mayor demanda de trabajo contráctil por parte del cardiomiocito, su desarrollo es el resultado de múltiples factores, existiendo una hipertrofia cardíaca de tipo fisiológica, reversible, sin signos histológicos de fibrosis, generada por factores de crecimiento como el factor de crecimiento análogo a insulina tipo 1 (IGF-1) y otra de tipo patológico, irreversible, cuya progresión genera insuficiencia cardíaca y cardiomiopatía dilatada, asociada a la acción de agonistas de receptores acoplados a proteína G como norepinefrina (NE), entre otros. Un aspecto importante a considerar es el metabolismo energético del corazón y su participación en el proceso hipertrófico, puesto que es uno de los órganos con mayor tasa de consumo de ATP y una disminución en la disponibilidad energética se traduce en alteraciones de la actividad contráctil y en el desarrollo de distintas patologías cardíacas. La mitocondria es el organelo responsable de la generación de energía en la célula, en el cardiomiocito se encuentran ubicadas entre las miofibrillas y ocupan sobre el 50% del volumen citoplasmático en el músculo cardíaco. Actualmente se reconoce la existencia de un retículo mitocondrial, donde estos organelos forman verdaderos “cables energéticos” cuya morfología y función dependen del equilibrio entre los procesos de fisión y fusión mitocondrial. Diversas proteínas, entre ellas OPA-1 y Mfn1/2 se relacionan con fusión mitocondrial mientras que Drp-1 y Fis-1 se asocian al proceso inverso. Tomando en cuenta la relación entre metabolismo e hipertrofia cardíaca, resulta evidente la importancia que adquieren los procesos de dinámica mitocondrial al regular la función de este organelo. Hasta la fecha se desconoce qué tipo de proceso de dinámica mitocondrial predomina en hipertrofia cardíaca, ni en qué forma la fusión/fisión de la mitocondria afecta el desarrollo del proceso hipertrófico en el cardiomiocito. Por esta razón, el objetivo principal del presente trabajo consistió en determinar si los estímulos prohipertróficos IGF-1 o NE, alteran la morfología y actividad mitocondrial. Para este fin, cultivos primarios de cardiomiocitos de ratas neonatas se trataron con IGF-1 (10 nM) o NE (10 M) entre 0 - 48 h. La red mitocondrial se visualizó mediante microscopía confocal y tinción con mitotracker Green. Los resultados muestran que desde las 24 h, NE produjo fisión de la red mitocondrial, identificada por un incremento en el porcentaje de células con fragmentación mitocondrial (+26 %, p<0,05 y +39 %, p<0,001), en el número relativo de mitocondrias por célula (+42 %, p<0,005 y +65 %, p<0,001) y disminución en el volumen mitocondrial promedio (-24 %, p<0,005 y -47 %, p<0,001, para las 24 y 48 h, respectivamente. Además, luego de los cambios morfológicos se observó una disminución del potencial de membrana mitocondrial (-23 %, p<0,05), del contenido intracelular de ATP (-27 %, p<0,05) y de la velocidad de consumo de oxígeno (-24 %, p<0,05), después de 48 h de exposición a NE. No se observaron cambios morfológicos ni metabólicos en la red mitocondrial de cardiomiocitos tratados con IGF-1. Igualmente se observó que la fisión mitocondrial inducida por NE se asoció con un incremento en la migración de Drp-1 a mitocondria, evaluado a través de un incremento en los niveles de Drp-1 en fracción mitocondrial y aumento en la colocalización entre Drp-1 y Fis-1. Calcineurina es una de las proteínas transduccionales de mayor relevancia en la respuesta hipertrófica inducida por NE, describiéndose que participa en la modulación de la dinámica mitocondrial mediante desfosforilación de Drp-1, incrementando su actividad. Para evaluar su participación, cultivos primarios de cardiomiocitos de ratas neonatas se transducieron con un adenovirus que expresa la subunidad catalítica de calcineurina constitutivamente activa (AdCN) o con uno que codifica un péptido inhibitorio para calcineurina (CAIN), observándose que su inhibición redujo significativamente los cambios morfológicos en la red mitocondrial inducidos por NE y que su sobreexpresión es suficiente para producir fisión mitocondrial. Además, el uso de herramientas adenovirales, también permitió determinar que una disminución en los niveles de Mfn2 produce fisión mitocondrial e induce la respuesta hipertrófica en el cardiomiocito, determinada como un incremento en el área celular, la sarcomerización y la reexpresión de biomarcadores asociados al proceso, mientras que la disminución en la actividad de Drp-1 fusiona la red mitocondrial y previene la hipertrofia cardíaca en los cardiomiocitos tratados con ambos estímulos. En base a estos resultados, se puede concluir que durante el desarrollo del proceso hipertrófico patológico del cardiomiocito se produce fragmentación de la red mitocondrial, a través de un mecanismo que involucra el incremento en la migración de Drp-1 amembrana mitocondrial y la participación de la fosfatasa calcineurina, todo esto asociado a una disminución en diversos parámetros metabólicos. Por otro lado, la modulación en los niveles o actividad de proteínas asociadas a los procesos de fusión y fisión mitocondrial, modificó significativamente el desarrollo del proceso hipertrófico, por lo que colectivamente, estos resultados revelan la importancia de los procesos de dinámica mitocondrial en el desarrollo de hipertrofia cardíaca. / Cardiac hypertrophy is an adaptive response induced by an increased contractile work. Physiological cardiac hypertrophy is reversible, without histological signs of fibrosis, generated by growth factors such as insulin like growth factor 1 (IGF-1). In contrast, pathological cardiac hypertrophy is irreversible, progress to heart failure and dilated cardiomyopathy and it has been associated with the action of G protein-coupled receptors agonists such as norepinephrine. An important aspect to consider is the heart’s energy metabolism and its role in the hypertrophic process, since myocardial tissue is one of the organs with the highest rate of ATP consumption. A decrease in energy availability results in detrimental changes in contractile activity and the development of distinct cardiac diseases. Mitochondria have a key role in energy generation in the cardiomyocyte are located between the myofibrils and occupy over 50% of cytoplasmic volume. The existence of a mitochondrial reticulum is recognized now and these organelles are true "power-transmitting cables" whose morphology and function depend on the balance between mitochondrial fission and fusion. Several proteins like OPA-1 and Mfn1/2 have been linked to mitochondrial fusion while Drp-1 and Fis-1 are associated with mitochondrial fission. Taking into account the relationship between metabolism and cardiac hypertrophy, the role of mitochondrial dynamics in the developrment of hypertrophyc growth must be relevant. However, the mitochondrial morphology in the hypertrophic cardiomyocyte, or how the mitochondrial fusion/fission events affect the development of the cardiomyocyte hypertrophic process is unknown. For this reason, our main objective was to investigate whether IGF-1 or NE stimulation produces changes in morphology and mitochondrial activity. For this goal, primary cultures of neonatal rat cardiomyocytes were treated with IGF-1 (10 nM) or NE (10 M) for 0 - 48 h. The mitochondrial network was visualized by confocal microscopy and Mitotracker Green staining. The results show that NE triggered mitochondrial fission after 24 hours of exposure, identified by an increase in the percentage of cells with mitochondrial fragmentation (+26 %, p <0.05 and +39 %, p <0.001), increase in the relative number of mitochondria per cell (+42 %, p <0.005 and +65 %, p <0.001) and decrease in the average mitochondrial volume (-24 %, p <0.005 and -47 %, p < 0.001, for the 24 and 48 h respectively). In addition to these, morphological changes, decreases in mitochondrial membrane potential (-23 %, p <0.05), intracellular ATP content (-27 %, p <0.05) and oxygen consumption rate (-24 %, p <0.05) were also observed after 48 h of exposure to NE. No morphological or metabolic changes in the mitochondrial network were detected in cardiomyocytes treated with IGF-1. NEinduced mitochondrial fission was associated with an increase in the migration of Drp-1 to mitochondria, evaluated by increase in levels of Drp-1 in mitochondrial fraction and by Drp-1 and Fis-1 colocalization. Calcineurin is one of the most important signaling molecules in the hypertrophic response induced by NE. This phosphatase is also involved in the modulation of mitochondrial dynamics by dephosphorylation of Drp-1, increasing its activity. To evaluate its role, culture neonatal rat cardiomyocytes were transduced with an adenovirus expressesing the calcineurin catalytic subunit constitutively active (AdCN) an inhibitory peptide (CAIN). Inhibition of calcineurin significantly decreased morphological changes in the mitochondrial network triggered by NE and AdCN overexpression being sufficient to cause mitochondrial fission. Using other adenoviral tools, we show that a decrease in Mfn2 levels causes mitochondrial fission, and induces the cardiomyocyte hypertrophic response, determined by increases in cell area, sarcomerización and biomarkers associated with hypertrophic response. The decrease in Drp-1 activity, stimulated mitochondrial fusion and prevented cardiac hypertrophy induced by NE and IGF-1. Collectively our results suggest, that mitochondrial network is fragmented during the development of pathological cardiomyocyte hypertrophy, through a mechanism involving the migration of Drp1 to the mitochondria and the phosphatase calcineurin activation, associated with decreases in several metabolic parameters. In addition, the modulation in the activity of proteins associated with mitochondrial fusion/fission, produced significant changes in the development of hypertrophy. Collectively these results demonstrate the importance of mitochondrial dynamics in the development of cardiac hypertrophy. / CONICYT; FONDAP; FONDECYT; MECESUP

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado académico de Doctor en Ciencias Farmacéuticas / El Síndrome de Ovario Poliquístico (SOP) es una condición familiar, fuertemente apoyada en factores genéticos y ambientales. Bioquímicamente se caracteriza por una secreción alterada de gonadotrofinas, altos niveles de andrógenos libres, insulino resistencia (IR) y un bajo grado crónico de inflamación. Entre las estrategias farmacológicas empleadas en el SOP destaca la metformina, un sensibilizante de la acción de la insulina, que es administrada comúnmente a estas pacientes obteniendo resultados metabólicos favorables. En el año 2005 fue aprobado el uso de metformina en pacientes con SOP embarazadas, ya que en la práctica clínica este fármaco permite mejorar las complicaciones gestacionales propias del SOP. Aunque la fisiopatología del SOP es compleja y pobremente comprendida, se ha sugerido que las mujeres con SOP presentan una actividad simpática aumentada. Modelos de condición quística en ratas dan lugar a una hiperactivación de neuronas simpáticas periféricas que inervan el ovario y a un aumento en la incorporación de Norepinefrina (NE) dentro del mismo, lo que finalmente resulta en el desarrollo y mantención de una condición quística que parece ser reversible si se atenúa la actividad simpática. Un estudio realizado en mujeres con SOP, a las cuales se les midió la actividad simpática del músculo del lecho vascular, mostraron una elevada actividad relacionada positivamente a altos niveles de testosterona. La NE, efector simpático, es un potente mediador de eventos fisiológicos y patofisiológicos en todo el organismo, por lo que su concentración extracelular se encuentra altamente regulada, principalmente por transportadores a nivel de membrana plasmática y a nivel intracelular en la membrana de vesículas de almacenamiento. Estudios en animales y humanos sugieren que el SOP se desarrolla en la vida fetal, por tanto, perturbaciones en el compartimiento materno programan al feto, vía adaptación placentaria y fetal, para desarrollar enfermedades en la vida adulta. Evidencias experimentales indican que la expresión del transportador de NE (NET) a nivel placentario, se encuentra disminuida en enfermedades gestacionales como preeclampsia, de ahí que se ha sugerido una función protectora para NET en placenta. Aunque las mujeres con SOP presentan un alto riesgo de padecer preeclampsia, no existe evidencia de las posibles alteraciones en la expresión de este transportador en placenta de mujeres con SOP. Para resolver nuestra hipótesis de trabajo empleamos muestras de plasma y placenta de término de mujeres con SOP con y sin tratamiento con metformina y mujeres control. Al evaluar los niveles plasmáticos de NE observamos que a las 24 semanas de gestación hubo un significativo incremento en la concentración plasmática de NE en mujeres con SOP que disminuyó significativamente a la semana 35, lo que podría estar dando cuenta de una desregulación en la actividad del sistema nervioso autónomo en estas pacientes durante el embarazo y de posibles mecanismos compensatorios frente a una hiperactividad adrenérgica. El tratamiento con metformina permitió disminuir significativamente los niveles plasmáticos de NE tanto en la semana 24 como 35 de gestación. En placenta de término de gestantes con SOP observamos una marcada disminución de la proteína NET en ambas caras placentarias, que está inversamente relacionada con los niveles de GLUT4. Sin embargo, el tratamiento con metformina restauró los niveles de proteína NET alcanzando niveles aún mayores que las mujeres control sólo en la cara materna placentaria, lo que sugiere que la actividad nerviosa autonómica no solo modifica la exposición fetal a catecolaminas, sino que el hecho de que responda al tratamiento con metformina también sugiere que está relacionada con alteraciones metabólicas asociadas con el síndrome. Por otro lado, componentes río abajo de la señalización del receptor de insulina, IRS1 y GLUT4, se encontraron alterados en placenta de término de pacientes con SOP. Sin embargo, el tratamiento con metformina durante el embarazo permitió corregir estas alteraciones principalmente en la cara materna de la placenta, lo que sugiere que el mejoramiento del estado hiperinsulinémico en la madre permite restablecer parcialmente la homeostasis metabólica placentaria. El conjunto de estos resultados muestra que las mujeres con SOP presentan un componente simpático alterado durante el embarazo, responsable de producir respuestas adaptativas placentarias a nivel de la proteína NET. Dicha respuesta adaptativa en conjunto con las alteraciones en la señalización insulínica placentaria, podrían ser responsables de la perpetuación del fenotipo SOP en la descendencia de estas pacientes. Por otro lado, la metformina ha demostrado ser una herramienta farmacológica útil que permite corregir las alteraciones simpáticas y metabólicas a distintos niveles, presentes en pacientes con SOP embarazadas, apareciendo como un agente integrador de patologías que involucran componentes metabólicos, circulatorios y neuroendocrinos / Polycystic Ovary Syndrome (PCOS) is a familial status, strongly supported by genetic and environmental factors. Biochemically characterized by an altered secretion of gonadotropins, high levels of free androgens, insulin resistance (IR) and chronic low -grade inflammation. Among the pharmacological strategies employed in PCOS stands metformin, sensitizer of insulin action, which is commonly administered to these patients obtaining favorable metabolic results. In 2005 was approved the use of metformin in pregnant patients with PCOS because in clinical practice this drug improves pregnancy complications of PCOS. Although the pathophysiology of PCOS is complex and poorly understood, it has been suggested that women with PCOS have increased sympathetic activity. Models of cystic condition in rats leading hyper activation to peripheral sympathetic neurons innervating the ovary and an increase in the uptake of norepinephrine (NE) therein, which ultimately results in the development and maintenance of a cystic condition that seems reversible if sympathetic activity is attenuated. A study in women with PCOS, to which muscle sympathetic activity of the vascular bed were measured, showed high sympathetic activity positively related to high levels of testosterone. The NE, sympathetic effector, is a potent mediator of physiological and pathophysiological events throughout the organism, so its extracellular concentration is highly regulated, primarily at the level of conveyor plasma membrane and intracellular level in the membrane of storage vesicles. Studies in animals and humans suggest that PCOS is developed in fetal life, therefore, disruptions in the maternal compartment programming to the fetus, via the placenta and fetal adaptation, for developing diseases in adulthood. Evidence indicates that expression of the NE transporter (NET) to placental level is decreased in gestational diseases as preeclampsia, there has been suggested a protective function for NET in placenta. Although women with PCOS are at high risk for preeclampsia, there is no evidence of possible alterations in the expression of this transporter in placenta of women with PCOS. To solve our working hypothesis, we use plasma samples and term placenta of women with PCOS with or without treatment with metformin and control women. In assessing plasma levels of NE we note that at 24 weeks of gestation was a significant increase in the plasma concentration of NE in PCOS women and then decreased significantly at week 35, which could account for deregulation in activity of autonomic nervous system in these patients during pregnancy and compensatory mechanisms against adrenergic hyperactivity. Metformin allowed significantly decrease plasma levels of NE in both 24 and 35 week of gestation. In term placenta of pregnant PCOS women we observed a marked decrease in NET levels in both placental faces and is inversely related to levels of GLUT4. However, metformin restored levels of NET protein reaching even higher levels than control women only in placental maternal face, suggesting that the autonomic nervous activity not only modifies fetal exposure to catecholamines, but the fact to respond to treatment with metformin also suggests that it is related with metabolic disorders associated with this syndrome. On the other hand, we found altered levels of downstream components of the insulin receptor signaling, IRS1 and GLUT4. However, treatment with metformin during pregnancy was able to correct these alterations mainly in the maternal side of the placenta, suggesting that the improvement of hyperinsulinemic state in the mother can partially restore the placental metabolic homeostasis. All of these results shows that women with PCOS have a sympathetic component altered during pregnancy and it is responsible for producing adaptive responses in placental protein NET. Such adaptive response in conjunction with alterations in placental insulin signaling could be responsible for the perpetuation of PCOS phenotype in the offspring of these patients. Furthermore, metformin has proven be a useful pharmacological tool to correct the sympathetic and metabolic alterations at different levels, present in PCOS pregnant woman, appearing as an integrator agent for pathologies involving metabolic, circulatory and neuroendocrine components / FONDECYT 1090036; FONDECYT 1110864

As espécies reativas de oxigênio (EROs) são intermediários de vias de sinalização que regulam eventos celulares relevantes na função de células musculares lisas vasculares como migração, proliferação e contração. A NADPH oxidase é a principal fonte enzimática de EROs com finalidade sinalizadora no sistema cardiovascular. Estudos do nosso grupo demonstraram que a proteína dissulfeto isomerase (PDI), uma chaperona redox do retículo endoplasmåtico é capaz de modular a geração de EROs e a ativação de vias de sinalização redox dependentes pela Ang II. Apesar dos recentes avanços na compreensão dos mecanismos que regulam a interação entre a PDI e NADPH oxidase, o papel desta chaperona nos efeitos biológicos relacionados a EROs, como a contração vascular, não estão esclarecidos. A inibição da resposta contrátil pelo DTNB, um oxidante de tióis sugere o envolvimento de proteínas contendo tióis como a PDI e a NADPH oxidase na contração de aortas isoladas estimuladas com Ang II. Estes resultados foram confirmados por experimentos que demonstraram a expressão de PDI em todas as camadas vasculares da aorta de ratos Wistar e uma co-localização desta proteína com a isoforma NOX-1. A inibição da PDI diminuiu a geração de EROs e a reatividade vascular induzida por Ang II e NOR independente da presença do endotélio. A investigação dos mecanismos envolvidos sugere um papel da PDI na mobilização de cálcio dos estoques intracelulares via NADPH oxidase. A ativação de MAP quinases contribuiu para aumentar a mobilização de cálcio intracelular em aortas estimuladas com Ang II e NOR. No entanto, a inibição da PDI reduziu a fosforilação da ERK 1/2 em aortas estimuladas com Ang II, mas não com NOR. A análise conjunta dos nossos resultados sugere que mecanismos redox dependentes e independentes estariam envolvidos na regulação da resposta contrátil à Ang II e NOR pela PDI. / The reactive oxygen species (ROS) are intermediates of signaling pathways which regulates cellular events relevant for the vascular smooth cells function as migration, proliferation and contraction.The NADPH oxidase is the main enzimatic source of ROS with the signaling purpose on the cardiovascular system. We previously demonstrated that the protein disulfide isomerase (PDI), a redox chaperone of endoplasmic reticulum, is able to modulate the ROS generation and the activation of signaling redox ways dependent of Ang II. Although the recent advances in the understanding of mechanisms that regulate the interaction of PDI and NADPH oxidase, the role of this chaperone in the biological effects related to ROS, as vascular contraction, are not well clarified. The inhibition of the contractile response by DTNB, an oxidant thiol, suggest the involvement of proteins containing thiols as the PDI and NADPH oxidase in the contraction of isolated aortas stimulated with Ang II. These results were confirmed by experiments that demonstrated the PDI expression in Wistar rats vascular layers and a co-localization of this protein with the NOX-1 isoform. The PDI inhibition decreased ROS generation and the Ang II and NOR induced vascular reactivity endothelium independent. The investigation of involved mechanisms suggest that one PDI role is the calcium mobilization from the intracellular storage by NADPH oxidase way. The MAPkinases activation contributed to increase de intracellualar calcium in stimulated aortas with AngII and NOR. However, the PDI inhibition reduced the ERK ½ fosforilation in AngII- stimulated aorta, but not with NOR. The analyses of all of our results suggests that dependent and independent redox mechanims were involved in the regulation of contractile response to Ang II and NOR by PDI.

O Reconhecimento do odor maternal é fundamental para a sobrevivência de filhotes altriciais como os ratos, pois eles dependem da mãe para proteção, manutenção da temperatura corporal e alimentação. Essa identificação da mãe nos primeiros dias de vida do filhote ocorre através do paradigma do aprendizado olfatório, que se dá pelo pareamento do cuidado maternal (estímulo tátil ou estímulo incondicionado) com o cheiro da mãe (estímulo condicionado). Esse estímulo tátil, aplicado pela mãe, atua sobre o locus coeruleos que emite uma projeção para o bulbo olfatório, promovendo a liberação de noradrenalina que resulta na fosforilação do fator de transcrição CREB (“Proteína ligante ao elemento responsivo ao AMPc”). A fostorilação dessa proteína é o passo fundamental para a formação do aprendizado olfatório. O envolvimento da 5-HT nesse tipo de memória ainda não está bem esclarecido, mas postula-se que sua participação seria sinérgica a NA induzindo a fosforilação do CREB. Dessa forma, a manipulação neonatal que se caracteriza como um estímulo tátil induz por si só um aumento do comportamento maternal. Esse estímulo aparentemente não nocivo em ratos é capaz de interferir em filhotes fêmeas na preferência do odor materno, devido a alteração na via NA/CREB. Assim, o presente trabalho procurou analisar os efeitos da manipulação repetida sobre os níveis de fosforilação de CREB, NA e 5-HT no bulbo olfatório de filhotes aos sete dias de idade. Os resultados mostraram no bulbo olfatório dos filhotes machos um aumento da atividade 5-HT. Enquanto em ambos os sexos foi verificada uma redução turnover de NA. Assim, a redução da atividade noradrenérgica causada pelo procedimento de manipulação repetida, talvez seja a causa de possíveis alterações comportamentais e neuroendócrinas verificadas na relação mãe-filhote e na vida adulta.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:25:35Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-08-02Bitstream added on 2014-06-13T19:12:30Z : No. of bitstreams: 1 000742177.pdf: 1654502 bytes, checksum: 866898964213e96038c110158bf8a746 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação para o Desenvolvimento da UNESP (FUNDUNESP) / As alterações nos componentes reprodutivos do eixo hipotálamo-hipófise-gônadas em muitas fêmeas de mamíferos determinam a transição gradual de ciclos reprodutivos regulares para ciclos irregulares, com perda de fertilidade. A interação dos neurônios do hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH) e esteróides gonadais representa função chave na neurobiologia do envelhecimento, pois a sobreposição temporal da senescência endócrina e neural está mecanicamente interligada pelas alças de retroalimentação. Estímulos do locus coeruleus (LC) para a área pré-óptica (APO) e eminência mediana são essenciais para a liberação das gonadotrofinas e seus neurônios apresentam receptores para estrógeno e progesterona, sugerindo controle dos esteróides ovarianos. Neste estudo foi avaliado a atividade de células neuronais localizadas em áreas e núcleos envolvidos com o controle de ação dos neurônios GnRH de ratas Wistar no período de transição para a aciclicidade. Para este trabalho foram utilizadas fêmeas Wistar cíclicas (4 meses) e acíclicas (18-20 meses) submetidas à decapitação ou perfusão às 10, 14 e 18 h na fase do diestro. Após serem retirados, os cérebros dos animais decapitados foram congelados e armazenados para posterior determinação do conteúdo de GnRH hipotalâmico e do conteúdo de noradrenalina e dopamina na APO. Os cérebros perfundidos foram cortados seriadamente em secções coronais de 30 μm para a APO e o LC e... / Changes in reproductive components of the hypothalamic-pituitary-gonadal axis in many female mammals determine the gradual transition from regular reproductive cycles to irregular cycles, with loss of fertility. The interaction of neurons of gonadotropin-releasing hormone (GnRH) and gonadal steroids represents key role in the neurobiology of aging, because the temporal overlap of endocrine and neural senescence is mechanically interconnected by feedback loops. Stimulation of the locus coeruleus (LC) for the preoptic area (POA) and median eminence are essential for the release of gonadotropins and their neurons have receptors for estrogen and progesterone, suggesting control of ovarian steroids. Therefore, in this study we evaluated the activity of neuronal cells located in areas and nuclei involved in the control of action of GnRH neurons of female rats during the transition to acyclicity. For this study, we used cyclic female (4 months) and acyclic (18-20 months) rats underwent perfusion or decapitation at 10, 14 and 18 h of diestrus day. The brains from decapitated animals, after removed, were frozen and stored for subsequent determination of the hypothalamic GnRH content and the noradrenaline and dopamine content in the POA. The perfused brains were serially cut into coronal sections of 30 μm to POA and LC and subsequently submitted to immunohistochemical labeling for Fos (FRA) and FRA / TH, respectively. For quantitative analysis of the POA were considered plates containing AVPe being the counting of neurons FRA-ir performed from the insertion of the box with... / FAPESP: 12/14464-6

O Reconhecimento do odor maternal é fundamental para a sobrevivência de filhotes altriciais como os ratos, pois eles dependem da mãe para proteção, manutenção da temperatura corporal e alimentação. Essa identificação da mãe nos primeiros dias de vida do filhote ocorre através do paradigma do aprendizado olfatório, que se dá pelo pareamento do cuidado maternal (estímulo tátil ou estímulo incondicionado) com o cheiro da mãe (estímulo condicionado). Esse estímulo tátil, aplicado pela mãe, atua sobre o locus coeruleos que emite uma projeção para o bulbo olfatório, promovendo a liberação de noradrenalina que resulta na fosforilação do fator de transcrição CREB (“Proteína ligante ao elemento responsivo ao AMPc”). A fostorilação dessa proteína é o passo fundamental para a formação do aprendizado olfatório. O envolvimento da 5-HT nesse tipo de memória ainda não está bem esclarecido, mas postula-se que sua participação seria sinérgica a NA induzindo a fosforilação do CREB. Dessa forma, a manipulação neonatal que se caracteriza como um estímulo tátil induz por si só um aumento do comportamento maternal. Esse estímulo aparentemente não nocivo em ratos é capaz de interferir em filhotes fêmeas na preferência do odor materno, devido a alteração na via NA/CREB. Assim, o presente trabalho procurou analisar os efeitos da manipulação repetida sobre os níveis de fosforilação de CREB, NA e 5-HT no bulbo olfatório de filhotes aos sete dias de idade. Os resultados mostraram no bulbo olfatório dos filhotes machos um aumento da atividade 5-HT. Enquanto em ambos os sexos foi verificada uma redução turnover de NA. Assim, a redução da atividade noradrenérgica causada pelo procedimento de manipulação repetida, talvez seja a causa de possíveis alterações comportamentais e neuroendócrinas verificadas na relação mãe-filhote e na vida adulta.