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CRISPR-Cas : un nouvel outil pour l'étude des génomes de bactériophages

Martel, Bruno 20 April 2018 (has links)
Les bactériophages sont maintenant reconnus pour jouer un rôle majeur dans divers écosystèmes. De nouveaux gènes sont fréquemment identifiés dans les génomes de ces bactériophages issus de différentes études environnementales. La majorité de ces gènes ne peuvent être associés à une fonction connue, d’où la nécessité de développer des outils génétiques performants afin mieux comprendre leur rôle dans la biologie des bactériophages virulents. Dans ce projet de maîtrise, le système CRISPR-Cas de la souche Streptococcus thermophilus DGCC7710 a été utilisé afin de pouvoir étudier des gènes sans fonction connue du bactériophage virulent 2972. Des mutations ponctuelles ainsi que de petites et de grandes délétions ont été réalisées dans le génome de phages virulents en utilisant le système CRISPR-Cas comme pression sélective. Finalement, la méthylation de l’ADN phagique a été démontrée suite à l’insertion d’un gène codant pour une méthyltransférase bactérienne dans le génome du phage 2972. / Bacteriophages are now widely recognized as major players in a wide variety of ecosystems. Novel genes are often identified in newly isolated phages as well as in environmental metavirome studies. Most of these novel viral genes have unknown functions but appear to be coding for small, non-structural proteins. To understand their biological role, very efficient genetic tools are required to modify them, especially in the genome of virulent phages. For this MSc project, specific point mutations and large deletions can be engineered in the genome of the virulent phage 2972 using the Streptococcus thermophilus CRISPR-Cas Type II-A. Furthermore, the CRISPR-Cas engineering system can be used to efficiently introduce a functional methyltransferase gene into a virulent phage genome. Finally, synthetic CRISPR bacteriophage insensitive mutants were constructed by cloning a spacer-repeat unit in a low copy vector illustrating the possibility to target multiple regions of the phage genome.
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Caractérisation du mode d'action du système CRISPR1/Cas de Streptococcus thermophilus

Dupuis, Marie-Ève 18 April 2018 (has links)
Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2011-2012 / Streptococcus thermophilus est une bactérie utilisée pour la fabrication industrielle de yogourts et de fromages et elle est sujette aux infections phagiques. Plusieurs mécanismes de défense contre les phages sont connus, dont le système CRISPR/Cas. Les loci CRISPR sont constitués de courtes séquences d'ADN répétées entrecoupées de séquences variables, les espaceurs. Des gènes cas et une région promotrice sont associés aux loci et la séquence homologue chez le phage est appelée le protoespaceur. Pour ce mémoire, l'effet du système CRISPRl/Cas de la souche S. thermophilus DGCC7710 sur l'ADN phagique a été étudié. Ainsi, il a été prouvé que l'ADN phagique est clivé dans les protoespaceurs par le système CRISPRl/Cas. Puis, l'analyse des différents espaceurs démontre que les motifs associés aux protoespaceurs sont plus permissifs qu'anticipé. Finalement, la méthylation de l'ADN phagique ne semble pas affecter l'immunité CRISPR/Cas ou l'acquisition d'espaceurs.
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Développement et caractérisation de la gésifection comme méthode de livraison d'acides nucléiques dans les cellules de mammifères

Mangion, Mathias 02 February 2024 (has links)
La livraison d’acides nucléiques a révolutionné la recherche biomédicale depuis des décennies. Il existe de nombreuses manières de livrer des acides nucléiques dans des cellules de mammifères. Chaque méthode possède ses avantages et ses inconvénients. Parmi elles, celles dites hybrides, représentent une alternative très intéressante puisqu’elles résultent de la combinaison de méthodes de livraison traditionnelles pour en obtenir une nouvelle aux propriétés améliorées. Cette thèse se consacre à l’étude d’une de ces méthodes de livraison hybride appelée gésifection. Cette dernière consiste à combiner des nanovésicules biologiques appelées « gésicules » avec un agent chimique nommé bromure d’hexadiméthrine pour livrer des acides nucléiques dans des cellules de mammifères. Bien que cette méthode ait fait l’objet de peu de recherches, les résultats publiés jusqu’à présent apparaissent suffisamment intéressants pour poursuivre son développement et sa caractérisation. Cette thèse est divisée en quatre chapitres. Le chapitre 1, est dédié à la revue de la littérature. Il présente un tour d’horizon des méthodes de livraison d’acides nucléiques, puis une présentation des mécanismes impliqués dans la pénétration cellulaire, et enfin, un état des lieux concernant les travaux sur les gésicules. Les chapitres 2, 3 et 4, présentent les travaux expérimentaux réalisés dans le cadre de cette thèse. Le chapitre 2 est consacré au développement d’une méthode optimisée pour produire et utiliser les gésicules pour la livraison d’acides nucléiques. Les gésicules se sont révélées être des particules très résistantes puisque leur capacité de livraison a été maintenue après plusieurs semaines de conservation à différentes températures, ainsi qu’après plusieurs cycles de congélation décongélation. Par ailleurs, les expériences de gésifection ont démontré la capacité de cette méthode à livrer de l’ADN dans des cellules primaires (connues pour être réfractaires) mais également des acides ribonucléiques (ARN) et des plasmides de grandes tailles. Le chapitre 3 est consacré à des expériences de caractérisation des gésicules au niveau morphologique et de leur contenu protéique. Les gésicules ont été visualisées par microscopie électronique avec la confirmation de la présence de la protéine VSV-G à leur membrane. Enfin, une analyse par spectrométrie de masse a permis de fournir la première description du contenu protéique des gésicules. Cela a permis de faire apparaître toute la complexité de ces nanovésicules. Le dernier chapitre de cette thèse (chapitre 4) est dédié à l’identification des mécanismes de pénétration et de transport cellulaire impliqués dans la gésifection. Tout d’abord, une série d’expériences préliminaires a permis d’établir des conditions expérimentales garantissant la fiabilité des résultats (efficacité des lavages, efficacité et innocuité des inhibiteurs métaboliques). Les résultats ont démontré que les complexes de gésifection pénètrent dans les cellules HeLa par macropinocytose et endocytose dépendante des clathrines. Leur parcours intracellulaire jusqu’au noyau de la cellule implique quant à lui, les dynéines et les microtubules. En conclusion, cette thèse contribue significativement au développement de la méthode de gésifection en décrivant un procédé de production et d’utilisation efficaces, et en apportant une meilleure compréhension de la composition et du fonctionnement des gésicules pour livrer des acides nucléiques. / The delivery of nucleic acids has revolutionized the biomedical field for decades, for research as well as for therapeutic applications. There are many nucleic acids delivery methods for mammalian cells. Each has its advantages and disadvantages. Hybrid methods represent a very interesting alternative for the delivery of nucleic acids since it consists in combining elements of existing vectors to develop more efficient new ones. This thesis is devoted to the study of one of these hybrid delivery methods called gesifection. Gesifection involves virus-like particles, pseudotyped with the VSV glycoprotein, able to deliver nucleic acids when combined with a chemical agent named polybrene. Even though the gesifection’s efficiency has been stated in only a few publications, the results were interesting enough for us to investigate the depth of its potential. This thesis is divided into 4 main parts. The chapter 1 is dedicated to a review of the literature and presents the main methods of nucleic acid delivery, followed by a presentation of the mechanisms involved in cell penetration and finally, an inventory of the gesicles and their uses. The chapter 2 of this thesis presents the work that allowed us to optimize the production of gesicles, to determine the best way to use them, to demonstrate their great robustness as well as their capacity to transfect primary cells, large plasmids and also interfering RNAs. The chapter 3 is dedicated to the characterization of gesicles. We have highlighted the formation of gesifection complexes, successfully carried out the purification of gesicles efficient for nucleic acid delivery, visualized the gesicles with their membrane composed of VSV-G proteins and finally, provides the first description of their protein content, showing all the complexity of these particles. Finally, the chapter 4 studies the mechanisms of penetration and cell transport involved during the gesifection. Our results revealed for the first time, that the gesifection complexes enter in HeLa cells by macropinocytosis and clathrin-dependent endocytosis. Furthermore, their intracellular course involves dyneins and microtubules. All of the results presented in this thesis provide a better understanding of gesifection for future developments.
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Caractérisation du système CRISPR-cas chez Streptococcus thermophilus / Caractérisation du système Clustered regularly interspaced short palindromic repeats-cas chez Streptococcus thermophilus

Garneau, Josiane 16 April 2018 (has links)
Streptococcus thermophilus is a low GC gram-positive bacterium massively used for the production of fermented products such as yogurt and cheeses. Every day, the dairy industry must face virulent bacteriophages and their consequences. Recently, a genetic structure called CRISPR (for Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) was found to be present in many bacterial and archeabacterial genomes. This system, in association with Cas (CRISPR-associated) proteins, allows the bacteria to become resistant to foreign DNA, such as phage or plasmid DNA, by the acquisition of new sequence-specific spacers. During this M. Sc. project, the transcription profile of the CRISPRl-cas system of S. thermophilus was investigated. First, the phage-sensitive wild-type strain DGCC7710 and two phage-resistant CRISPR-mutants (DGCC7710<i>2972+S4 and DGCC7710*2972+S7) were infected with the virulent phage 2972. Northern blot experiments of infected cells samples taken at time intervals were performed using a series of single-stranded 5'-labeled-probes targeting the four cas genes, the CRISPR1 locus, as well as phage genes. Phage DNA replication assays of the same samples were also done. Finally, in vitro enzymatic assays were performed using Casl and Cas2 purified proteins. In the three S. thermophilus strains tested, the four cas genes and the CRISPR1 locus were constitutively transcribed. In the phage-resistant CRISPR-mutant DGCC7710<D2972+S4 , phage mRNA specific to the acquired new spacer was rapidly degraded, whereas phage mRNAs were increasingly and strongly detected in infected phage-sensitive cells (DGCC7710). Conversely, no DNA degradation was observed. The enzymatic assays revealed that Casl and Cas2 have ssRNase activity which, in the case of Casl, is specific to a A(U)C sequence. Taken altogether, the CRISPR-cos system in S. thermophilus leads to mRNA degradation of specific phage transcripts, thereby limiting phage replication. / Streptococcus thermophilus est une bactérie utilisée pour la fabrication de produits laitiers fermentes, mais elle doit constamment lutter contre les infections par de nouveaux bacteriophages virulents. Récemment, un tout nouveau mécanisme naturel de défense contre les phages a été découvert chez S. thermophilus. Les CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) sont des séquences d'ADN contenant plusieurs répétitions entrecoupées de régions appelées spacers qui proviennent d'ADN extrachromosomique. Les loci CRISPR sont habituellement situés à proximité de gènes cas (CRISPR-associated). L'acquisition d'un spacer est directement reliée à une immunité contre le phage duquel provient l'ADN de ce spacer. Au cours de ce projet de maîtrise, le mode de fonctionnement du système CRISPR-cas a été étudié par analyse transcriptionnelle des gènes cas, de régions impliquées dans le locus CRISPRl-cas ainsi que des gènes viraux chez trois souches isogéniques de S. thermophilus (DGCC7710, DGCC7710[phi]2972+S4 et DGCC7710[phi]2972+S7) en cours d'infection par le phage 2972. Des travaux ont également été faits sur la replication virale chez les trois souches. Finalement, des essais enzymatiques in vitro ont été réalisés avec deux des quatre protéines Cas dont les gènes précèdent un des loci CRISPR de la souche DGCC7710. Les résultats du projet indiquent, entre autres, que les quatre gènes cas présents chez la souche S. thermophilus DGCC7710 sont transcrits constitutivement et que l'ARNm viral est dégradé par les souches résistantes ayant acquis de nouveaux spacers, ce qui ne semble pas être observé au niveau de l'ADN. Les résultats des essais enzymatiques démontrent également que les protéines Casl et Cas2 possèdent une activité sbRNase, qui dans le cas de la protéine Casl, est spécifique à la séquence A(U)C. Les résultats démontrent que le système CRISPR-cas agit de façon à dégrader l'ARN étranger comprenant une séquence identique à un spacer acquis par une souche résistante, ce qui a pour effet direct de limiter la replication du phage.
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Structural study of DNA sequences related to the nucleosome preferential positioning / Etudes structurales et dynamiques de séquences d'ADN impliquées dans le positionnement préférentiel du nucléosome

Xu, Xiaoqian 26 November 2012 (has links)
Ces dernières années ont vu se multiplier les études portant sur le positionnment du nucléosome. Ce phénomène est en effet essentiel pour comprendre correctement les processus liés à l'expression génique. Ces travaux soulignent notamment la multiplicité des facteurs qui interviennent dans le positionnement en vivo, toutefois le rôle de la séquence d'ADN elle même est bien reconnu que ce soit sous formes de séquences préférées ou "excluantes". Afin d'identifier les propriétés structurales et dynamiques des séquences qui possèdent une forte capacité à positionner le nucléosome, nous avons procédé à une série d'études structurales sur les oligomères d'ADN libres correspondant à la séquence de l'une des plus connues d'entre elles, la séquence 601. Nous nous sommes plus particulièrement intéressés à une séquence de 39 paires de bases correspondant à la moitié d'un tour complet autour du cœur d'histone. L'utilisation des méthodes de RMN permet de déterminer les propriétés d'oligomères en solution. Néanmoins la difficulté d'attribuer les résonances phosphore sur des séquences oligonucléotides longues nous a conduit à diviser la séquence d'intérêt en quatre parties égales (12bp) sur lesquelles les attribution penvent être réalisées. L'analyse des 72 déplacements chimiques du phosphore (&#948-P) et des 249 distances séquentielles inter-protons recueillies sur les oligomères montre que les mouvements de l'ADN à l'échelle de temps de la nanosecondes, des groupements phosphates, des sucres et des bases sont fortement couplés et directement reliés à la séquence dinucléotidique. Les données expérimentales recueillies dans ce travail sont en accord avec les prédictions de l'échelle TRX (Twist,Roll,X-disp) qui quantifie les mouvement à l'échelle de la nanoseconde de l'ADN-B. L'annotation de l'échelle TRX de la séquence 601 montre une alternance périodique de régions rigides et flexibles le long de la séquence, cette périodicité est de 10 pairs de bases. De façon frappante, cette alternance se superpose aux variations sinusoïdales des largeurs des petits sillons observées sur les structures cristallographiques des nucléosomes. L'élément TTAAA, a fait l'objet d'une attention particulière dans ce travail. Il est soupçonné d'être crucial dans le contexte de la formation des nucléosomes, cette séquence présente en effet quelques particularités remarquables, tels que la présence de plusieurs enchaînements dinucléotidiques riche en BI (dP décalé vers les hauts champs et distances inter-nucléotidiques courtes)- ceux-ci se trouvent associés à un petit sillon très étroit. Les résultats relatifs aux couplages dipolaires résiduels (RDC), qui reflètent l'angle de déviation entre le vecteur carbone-proton et l'axe l'ADN ont montré que les différences entre les couplages dipolaires résiduels de deux résidus successifs &#916-(RDC), sont également corrélées aux &#948-P. Ce résultat confirme définitivement que la structure et la dynamique des groupes phosphates, les positions relatives des bases et les conformations sucres de l'ADN-B sont fortement couplés. En outre, nos résultats permettent de commencer à déchiffrer le processus influençant la formation des nucléosomes, ils montrent que l'échelle TRX est un outil puissant de prédiction des conformations et la dynamique des ADN. / Nowadays, nucleosome positioning is being studied intensively due to the critical role in the regulation and transcription by modulating the accessibility of specific targeted sites for proteins in eukaryotic cell. As demonstrated by recent studies that positioning in vivo could be modulated by various factors, among which the role of DNA sequence is repeatedly underlined due to the form of preferred or excluding sequences. In an attempt to identify the structural and dynamic properties of sequences exhibiting strong ability to precisely position the nucleosome, we carried out a series of structural studies on free DNA oligomers corresponding to the core of this sequence. The synthetic 601 sequence was selected as a proper candidate for the experiment and the oligomers cover 39bp of the 5’ half of the sequence. The utilization of NMR technology allows the observation of the oligomer properties in solution. However, it’s difficult to assign phosphorus resonances signals to long DNA oligonucleotides, which could be realized to divide the sequence of interested part into four equivalents (12 bp). Analysis of a large set of NMR data on the four oligomers (72 dP (phosphorus chemical shift) and 249 sequential inter-proton distances) indicate the strong coupling between nanoseconde timescale motions of phosphate group and those involving sugar and bases. In the four dodecamers, the nanosecond timescale dynamics is dominated by the dinucleotide sequence, modulated at the tetranucleotide level. Importantly, the experimental data collected here validate our previously published NMR-based TRX scale that quantifies the nanosecond timescale intrinsic malleability of the ten complementary dinucleotides in B-DNA. The TRX annotation of the whole 601 sequence shows a 10 base-pair periodic alternation of stiff and flexible regions that can be exactly superimposed to the sinusoidal variations of minor groove width observed on the crystallographic structures of nucleosome. The TTAAA element was the subject of particular attention in this work. It is suspected to be crucial in the nucleosome formation context, exhibiting remarkable features, such as the constitution of a succession of BI-profiles (high-shifted dP and short internucleotide distances) associated to a narrow minor groove. Furthermore, the results related to the residual dipolar couplings (RDC), which reflect the deflection angle between carbon-proton vectors and the long axis of DNA have shown that the differences between the residual dipolar couplings of two successive residues, &#916-(RDC), are also correlated with &#61540-P. This result definitively confirms that the structure and the dynamic of phosphate group, bases and sugars in B-DNA are highly coupled. In addition, our results start to decipher the indirect readout process underlying the nucleosome formation. Further, they establish that the TRX scale is a powerful, predictive tool for better understanding DNA-protein interactions, based on flexibility criteria. It represents a new step towards a simplified determination of properties of DNA by NMR.
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Etude de la biocompatibilité d acides nucléiques modifiés par des acides boroniques : développement de nouveaux outils de diagnostic / Study of the biocompatibility of nucleic acid modified by boronic acid : development to new diagnostic tools

Reverte, Maëva 09 December 2016 (has links)
La modification d’oligonucléotides est un domaine attrayant de la chimie organique. De nombreuses études se sont intéressées à la génération de liens internucléosidiques artificiels à visée thérapeutique, diagnostic ou encore pour des applications en chimie prébiotique. Ce manuscript de thèse rapporte la synthèse et l’étude de biocompatibilité d’acides nucléiques modifiés à leurs extrémités 5’ par un acide boronique. Les comportement des oligomères boroniques a été évalué en présence de différentes classes d’enzymes telles que les ligases, les polymérases ou encore les phosphodiestérases. Les résultats de biocompatibilité obtenus en présence de ces enzymes nous ont permis d’utiliser ces acides nucléiques modifiés comme de réels outils de diagnostic pour réaliser de la détection de point de mutation ou encore de la détection de péroxynitrite in-cellulo. / The modification of oligonucleotides is an attractive field of organic chemistry. Many studies have focused on the generation of artificial internucleoside linkages for therapeutic, diagnostic or for applications in prebiotic chemistry. This thesis manuscript reports the synthesis and study of nucleic acids biocompatibility modified at their 5 'ends by a boronic acid function. The behavior of boronic oligomers was assessed in the presence of different classes of enzymes, such as ligases, polymerases or phosphodiesterases. The biocompatibility results obtained in the presence of these enzymes allowed us to use these modified nucleic acids as real diagnostic tools to achieve mutation point detection or detection of peroxynitrite in-cellulo.
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Développement d'un procédé de fabrication de vésicules extracellulaires pseudotypées par la glycoprotéine du virus de la stomatite vésiculaire pour la livraison cellulaire d'acides nucléiques

Champeil, Juliette 25 March 2024 (has links)
Thèse ou mémoire avec insertion d'articles / Le marché des agents de livraison d'acides nucléiques est en pleine expansion et atteindra plus de cinq milliards de dollars en 2030. Ces agents, utilisés pour livrer de l'information génétique dans des cellules de mammifères, ont de nombreuses applications tant dans le domaine de la recherche fondamentale que thérapeutique. Parmi les différentes catégories d'agents de livraison, celle utilisant des vésicules extracellulaires (VE) pseudotypées par la glycoprotéine du virus de la stomatite vésiculaire (VSVG) s'est révélée prometteuse dans les dernières années. En effet, en combinaison avec un polymère cationique, ces particules (VE-VSVG) se sont montrées capables de livrer des acides nucléiques de type ADN et ARN dans différents types cellulaires. Malheureusement, les procédés de production actuels des VE-VSVG, impliquant l'utilisation de cellules HEK 293, sont difficiles à adapter à l'échelle industrielle notamment à cause de l'utilisation de cellules productrices adhérentes, de la présence de sérum dans le milieu de culture et de procédés de purification incomplets. Par conséquent, l'objectif de ces travaux de recherche a été de développer un procédé de fabrication des VE-VSVG, pouvant être plus facilement transposé à l'échelle industrielle. Cette thèse se divise en quatre chapitres. Le chapitre 1 constitue une revue de la littérature et fait un état des lieux des différentes méthodes de livraison d'acides nucléiques, ainsi que des procédés de production et de purification de particules biologiques pseudotypées par la protéine VSVG, incluant les VE-VSVG. Les trois chapitres suivants présentent les résultats obtenus au cours de ce doctorat. Le chapitre 2 regroupe les résultats d'une première publication dédiée à la mise en place d'un procédé de production de VE-VSVG par transfection transitoire de cellules HEK 293, cultivées en suspension sans sérum, ainsi que d'une méthode de purification, composée d'une phase de concentration par ultracentrifugation et d'une étape de séparation par chromatographie d'affinité. Le chapitre 3 présente les résultats d'une future publication, consacrée à l'analyse de l'effet de la production de VE-VSVG sur l'expression génique des cellules HEK 293, ainsi qu'à l'amélioration des rendements de production de ces particules, grâce à l'identification de différents gènes prometteurs au cours de cette étude transcriptomique. Finalement, le chapitre 4 regroupe des résultats consacrés à l'évaluation d'autres plateformes de fabrication (production et purification) des VE-VSVG. En conclusion, les nouvelles données et les procédés développés dans le cadre de cette thèse permettent d'améliorer significativement la production et la purification de cet agent de livraison d'acides nucléiques prometteur, dans un contexte industriel. / The market of nucleic acid delivery agents is growing rapidly and will reach more than $5 billion by 2030. These agents, used to deliver genetic information into mammalian cells, have numerous applications in both basic and therapeutic research. Among the different classes of delivery agents, the one using extracellular vesicles (EV) pseudotyped with the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSVG) has shown promises in recent years. In combination with a cationic polymer, these particles (EV-VSVG) have been shown to be able to deliver DNA and RNA in different cell types. Unfortunately, current EV-VSVG production processes, involving the use of HEK 293 cells, are difficult to adapt to industrial scale, notably due to the use of adherent producer cells, the presence of serum in the culture medium and incomplete purification procedures. Therefore, the goal of this thesis was to develop a manufacturing process for EV-VSVG that could facilitate the transposition to industrial scale. This thesis is divided into four chapters. Chapter 1 is a review of the literature and presents an overview of the nucleic acid delivery methods, as well as processes for the production and purification of VSVG-pseudotyped biological particles, including EV-VSVG. The following three chapters present the results obtained during this Ph.D. Chapter 2 covers the results of a first publication dedicated to the development of a production process of EV-VSVG by transient transfection of HEK 293 suspension cells grown in serum-free media, as well as a purification method, composed of a concentration step by centrifugation and a separation step by affinity chromatography. Chapter 3 presents the results of a future publication, dedicated to the analysis of the effect of VSVG protein production on HEK 293 cell gene expressions, as well as to the improvement of those particles production yields, through the identification of various promising genes during this transcriptomic study. Finally, Chapter 4 brings together results devoted to the evaluation of alternative manufacturing platforms (production and purification) for EV-VSVG. In conclusion, the new data and processes developed in this thesis significantly improve the production and purification of this promising nucleic acid delivery agent, in an industrial context.
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Recombinase polymerase amplification technology : Assessment for nucleic acid-based acid-based point-of-care diagnostics

Daher, Rana 23 April 2018 (has links)
Cette thèse de doctorat porte dans l’ensemble une étude approfondie sur une technologie émergente pour l’amplification isotherme des acides nucléiques appelée recombinase polymerase amplification (RPA). L’introduction porte une description détaillée sur la RPA. Cette revue de littérature documente et discute les diverses applications de la RPA en soulignant les connaissances actuelles concernant les applications diagnostiques. Malgré la composition complexe de la RPA (6 à 7 protéines dans le même mélange réactionnel), cette dernière s’avère une technologie rapide (générant des résultats &lt; 20 min), spécifique et sensible (détection de l’ordre de quelques copies de génome), et largement appliquée dans différentes disciplines. Ces avantages nous permettent de croire que la RPA possède la flexibilité nécessaire pour être utilisée comme outil de diagnostic rapide des maladies infectieuses en réduisant le temps d’obtention des résultats à moins d’une heure au lieu de 2 à 3 jours avec les tests de cultures standards. En conséquence, il sera possible d’intégrer la RPA dans des plateformes microfluidiques ou laboratoire sur puce qui permettent la préparation d’échantillons, l’amplification et la détection des acides nucléiques des microbes causant des infections. En premier lieu, les travaux de cette thèse ont généré des lignes directrices additionnelles pour la conception des amorces/sondes RPA. En second lieu, nos travaux ont permis de développer un essai diagnostic RPA pour la détection des streptocoques du groupe B, responsables de la septicémie et la méningite chez les nouveau-nés. Cet essai fut le premier à évaluer la performance de la RPA avec des échantillons cliniques humains. Ce test diagnostic RPA a été comparé à une méthode de référence, la réaction en chaîne par polymérase (PCR). Cette démonstration sur des échantillons cliniques nous à inciter à pousser notre étude pour réaliser le dernier objectif de ce projet qui consistait à automatiser la RPA par intégration dans un système microfluidique miniaturisé centripète. Une collaboration avec des experts en génies et en matériaux a permis de générer un dispositif microfluidique appelé blade ainsi de l’instrument impliqué dans l’opération des différentes tâches mécanistiques. Ces résultats préliminaires suggèrent qu’il sera important d’offrir un système automatisé complet applicable au chevet du patient. Par conséquence, il sera possible d’exécuter une analyse complète des agents infectieux en moins d’une heure sans le besoin des procédures complexes de préparation et de transport des échantillons cliniques ni le recours à du personnel qualifié. / This dissertation consists of an exhaustive study on an emerging technology for isothermal amplification of nucleic acids called recombinase polymerase amplification (RPA). The introduction of this thesis is a detailed description of the RPA. This review documents and discusses the various applications of this technology by pointing to the current knowledge about RPA for diagnostic applications. Despite the complex composition of RPA (6 to 7 proteins in the same reaction mixture), the latter was shown to be rapid (generating results in &lt; 20 min), specific and sensitive (detecting few target genome copies), and applied widely in different fields. Based on these advantages, we assume that RPA has a flexibility allowing it to be used for the rapid diagnosis of infectious diseases thus reducing time-to-result to less than an hour. Consequently, it will be possible to integrate RPA in microfluidic platforms providing a lab-on chip system. The first part of this doctoral project generated additional guidelines for RPA primers/probes design to develop specific RPA diagnostic assays. Second, we developed an RPA diagnostic test for the detection of group B streptococci, responsible for sepsis and meningitis in newborns. This assay was the first to evaluate RPA with human clinical samples. This diagnostic test was compared to a reference method, the polymerase chain reaction (PCR). This demonstration with clinical samples served to carry out the final objective of this project that was to automate RPA in a miniaturized microfluidic centripetal system. Collaboration with engineers and experts in materials has generated the microfluidic device called "blade" and the instrument involved in the operation of various mechanistic tasks. These preliminary results suggested that it will be important to provide an automated system applicable at bedside. Consequently, it will be possible to perform a complete analysis of infectious agents in less than an hour without the need for complex procedures for the preparation and transport of clinical specimens or the assistance of qualified personnel.
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Propriétés structurales et associations en solution des dendrimères polyamidoamine (Pamam) / Structural properties of pamam dendrimers and their interactions in solution

Zerrad, Louiza 13 January 2010 (has links)
Nouveaux polymères avec une structure arborescente unique, les dendrimères suscitent un grand intérêt auprès des chercheurs de tous les domaines scientifiques confondus et spécialement auprès des biologistes. Théoriquement synthétisés de façon à ce qu’ils soient parfaitement mono disperses en taille et en masse et de forme sphérique, les dendrimères PAMAM ont des propriétés structurales qui pourraient donner de bons résultats lors de leur utilisation comme vecteurs de médicaments ou d’acides nucléiques.De récentes études biologiques ont montré que les dendrimères PAMAM pouvaient transfecter un grand nombre de cellules de différente nature. Les propriétés structurales et physicochimiques du dendrimère joueraient un rôle essentiel dans l’efficacité de cette transfection et pouvoir prédire ces propriétés permettraient de mieux contrôler le comportement de ces«vecteurs-médicaments» dans l’organisme / In the context of securing clinical gene transfer, new strategies are developed with the creationof synthetic gene vectors based on cationic polymers to replace commonly used viral vectors ingene therapy. PAMAM dendrimers are highly branched macromolecules with controlled nearmonodisperse three-dimensional architecture emanating from a central core. Polymer growthstarts from a central core molecule and growth occurs in an outward direction by a series ofpolymerisation reactions. Hence, precise control over size can be achieved by the extent ofpolymerisation, starting from a few nanometers. Cavities in the core structure and folding of thebranches create cages and channels. The surface groups of dendrimers are amenable tomodification and can be tailored for specific applications. Therapeutic and diagnostic agents areusually attached to surface groups on dendrimers by chemical modification.Recent biological studies have shown that PAMAM dendrimers could transfect a large numberof cells of different nature. The structural properties and physico-chemical properties ofdendrimer play a key role in the efficiency of transfection and to predict these properties wouldbetter control the behavior of these "drug delivery systems in the body.
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Synthesis of constrained nucleosides

Salinas Hernandez, Juan Carlos 04 1900 (has links)
No description available.

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