La qPCR est actuellement la technique de référence en matière de quantification d'ADN. Elle peut être définie comme une amplification exponentielle, cyclique et ciblée de la séquence d'ADN cible. Le caractère exponentiel de la qPCR est à la fois à l'origine de la sensibilité de la méthode mais aussi d'une potentielle variabilité inter-échantillons. Cette variabilité est compensée par le caractère cyclique de la méthode qui entraine une synchronisation de la réaction pour tous les échantillons à chaque cycle. L'amplification ciblée de la séquence choisie traduit quand à elle la spécificité de la méthode. Néanmoins, cette dernière propriété de la PCR reste la moins vérifiée. La spécificité de la qPCR est indiscutable lorsque la cible à détecter se trouve en quantité suffisante (>100 copies environ). En revanche, pour des quantités plus faibles ou en présence d'inhibiteurs, la spécificité diminue ou disparaît (limites de détection et de quantification). Cette perte de spécificité retentit de façon significative sur la précision et la reproductibilité du dosage à réaliser. Cependant, si l'hybridation non spécifique est inéluctable dans ces conditions, l'amplification non spécifique consécutive peut être limitée, voire supprimée au moyen d'amorces de PCR soit plus spécifiques, soit moins susceptibles de générer des différences inter-échantillons. La RT-qPCR, grâce à une étape initiale de transcription inverse (conversion d'un ARN en un ADN complémentaire) permet la quantification des ARN. Cependant, la transcription inverse reste moins reproductible que la PCR, générant des différences inter-échantillons délétères en diagnostic comme en recherche. Au cours de ces travaux, je propose des méthodes originales améliorant de façon significative différentes étapes de ces techniques. Premièrement, je propose une amélioration de la standardisation de l'étape de transcription inverse capable de diminuer de façon significative la variabilité inter-échantillons ; l'utilisation d'un volume constant d'extrait d'ARN pour chaque échantillon améliore considérablement la précision de la quantification d'ARN messagers. Deuxièmement, je propose une modification des amorces par incorporation de résidus d'acides nucléiques bloqués (LNA) ; cette modification permet d'augmenter la spécificité des amorces aux limites de la détection. Enfin, je propose une méthode simple et économique permettant la mesure directe de la température de fusion (Tm) dans les conditions réelles de la PCR. Ce paramètre, considéré comme capital pour la réalisation des dosages par qPCR, est généralement obtenu par des méthodes prédictives peu précises. De plus, cette méthode doit permettre de déterminer précisément les paramètres thermodynamiques des amorces (∆G, ∆H et ∆S) et ainsi avoir accès d'une part au pourcentage réel d'amorces hybridées en fonction de la température et d'autre part d'identifier la susceptibilité des amorces aux inhibiteurs.

UPF1 (Up-Frameshift 1) est une hélicase multifonctionnelle conservée chez tous les eucaryotes. Elle est essentielle à la voie de surveillance du NMD (Nonsense Mediated mRNA Decay), qui dégrade des ARNm portant un codon stop prématuré. UPF1 est l’archétype d’une famille d’hélicases qui partagent des corps similaires mais sont impliquées dans des voies cellulaires variées. Cependant, les relations structure-fonction et les caractéristiques biophysiques intrinsèques de ces moteurs moléculaires restent à ce jour peu connues. In vitro, le coeur hélicase d’UPF1 est hautement processif, il traverse des milliers de bases sur l’ARN ou l’ADN et déroule des doubles brins. Dans ce travail, nous avons cherché les facteurs clés régissant cette remarquable processivité en combinant des techniques de biochimie et de biophysique. En particulier, nous avons utilisé des pinces magnétiques pour étudier en temps réel des hélicases à l’échelle de la molécule unique. Contrairement à UPF1, l’hélicase IGHMBP2 de la famille UPF1-like n’est pas processive ; la processivité n’est donc pas un trait conservé au sein de la famille. Grâce à une étude fine de la structure 3D des deux hélicases, nous avons conçu divers mutants que nous avons utilisés pour identifier les éléments structuraux qui modulent la processivité. Notre approche révèle qu’UPF1 a une prise très ferme sur les acides nucléiques, garantissant de longs temps de résidence et d’action qui dictent sa haute processivité. Grâce à la variété de comportements des mutants, nous avons construit un modèle mécanistique expliquant le lien entre énergie d’interaction et processivité. Nous démontrons aussi que la processivité d’UPF1 est requise pour un processus de NMD efficace in vivo. Nous avons utilisé les mêmes outils biochimiques et biophysiques pour étudier une isoforme naturelle d’UPF1 humaine se déplaçant plus vite que l’isoforme majeure, et pour comparer la régulation d’UPF1 humaine et de levure par leurs domaines flanquants. Nous avons également caractérisé l'interaction d’UPF1 de levure avec de nouveaux partenaires. Nos travaux montrent comment la combinaison d'outils biochimiques, biophysiques, structuraux etin vivo offre des aperçus inattendus quant au mode de fonctionnement des moteurs moléculaires. / UPF1 (Up-Frameshift 1) is a multifunctional helicase that unwinds nucleic acids and is conserved throughout the eukaryote kingdom. UPF1 is required for the Nonsense Mediated mRNA Decay (NMD) surveillance pathway, which degrades mRNAs carrying premature termination codons, among other substrates. UPF1 is the archetype of a family of 11 helicases sharing similar cores but involved in various cellular pathways. However, the structure-function relationship and intrinsic biophysical properties of these molecular engines remain poorly described. In vitro, the UPF1 helicase core is highly processive, it travels along thousands of RNA or DNA bases and unwinds double-strands. In this work, we looked for key factors governing this remarkable processivity. We combined biochemical and biophysical techniques. In particular, we used magnetic tweezers to study helicases in real time at a single molecule scale. In contrast to UPF1, the related IGHMBP2 is not processive, thus processivity is not a shared family trait. Based on the 3D structures of both proteins, we designed various mutants and used them to identify structural elements that modulate processivity. Our approach reveals that UPF1 has a very firm grip on nucleic acids, guaranteeing long binding lifetimes and action times that dictate its high processivity. Thanks to the variety in mutant behaviors, we built a novel mechanistic model linking binding energy to processivity. Furthermore, we show that UPF1 processivity is required for an efficient NMD in vivo. In addition, we used the same biochemical and biophysical tools to investigate a natural human UPF1 isoform moving faster than the major isoform, and to compare the regulation of human andyeast UPF1 by their flanking domains. We also characterized the interaction of yeast UPF1 with new NMD partners. Our work shows how a combination of biochemical, biophysical, structural and in vivo tools can offer unexpected insights into the operating mode of molecular motors.

Mimer les processus biologiques par des méthodes s'affranchissant de la nécessité d'activation enzymatique est un défi pour la communauté des chimistes. Parmi ces processus nous nous sommes intéressés à la ligation et la polymérisation d'acides nucléiques. Les procédés chimiques existants nécessitent généralement l'emploi d'un activateur et conduisent en majorité à des jonctions internucléosidiques irréversibles, incompatibles avec les systèmes vivants. Pour réaliser la ligation et la polymérisation réversibles d'ADN en l'absence d'activation chimique ou enzymatique, nous avons utilisé des oligonucléotides modifiés par une fonction acide boronique qui a la propriété de se lier de manière covalente et réversible avec des fonctions cis 1,2 diol.Un analogue de la thymidine fonctionnalisé par un acide boronique a ainsi été synthétisé et incorporé à l'extrémité 5' d'un oligonucléotide. En présence d'une matrice et d'un partenaire 3' diol, une jonction boronate peut alors être obtenue. L'influence de la nature des fonctions à l'extrémité 3' du partenaire a été étudiée afin de déterminer les paramètres gouvernant la ligation et a notamment conduit à la formation d'une jonction oxazaborolidine en présence d'un partenaire aminoalcool. Par ailleurs, cette méthodologie a été appliquée à des processus visant à mimer la polymérisation par la formation de multiples jonctions boronates entre des oligonucléotides bifonctionnalisés par un acide boronique et un diol. Enfin l'auto polymérisation d'un duplexe en l'absence de matrice a été évaluée. / Mimicry of biological processes by non enzymatic ways is a challenge for chemists. Among those processes, we have been focusing on the ligation and polymerization of nucleic acids. Reported chemical methods usually require an activator and lead mostly to irreversible internucleosidic linkage which are incompatible with living systems. To perform DNA ligation and polymerization under enzyme free and activator free conditions, we used modified oligonucleotides bearing a boronic acid function able to bind covalently and reversibly cis 1,2 diols.Thus, a thymidine analog functionalized by a boronic acid was synthesized and introduced at the 5' end of an oligonucleotide. In the presence of a template and a 3 end diol partner, a boronate junction can be obtained. Influence of the nature of functions at the 3' end of the partner have been studied to indentify the parameters governing the ligation and allowed the formation of an internucleosidic oxazaborolidine linkage with an aminoalcohol partner. In addition, this methodology has been applied to polymerization mimicking processes by the formation of multiple boronate junctions between bifunctionnal oligonucleotides bearing a boronic acid and a diol. Finally we evaluated the auto polymerization of a duplex in the absence of template.

La qPCR est actuellement la technique de référence en matière de quantification d'ADN. Elle peut être définie comme une amplification exponentielle, cyclique et ciblée de la séquence d'ADN cible. Le caractère exponentiel de la qPCR est à la fois à l'origine de la sensibilité de la méthode mais aussi d'une potentielle variabilité inter-échantillons. Cette variabilité est compensée par le caractère cyclique de la méthode qui entraine une synchronisation de la réaction pour tous les échantillons à chaque cycle. L'amplification ciblée de la séquence choisie traduit quand à elle la spécificité de la méthode. Néanmoins, cette dernière propriété de la PCR reste la moins vérifiée. La spécificité de la qPCR est indiscutable lorsque la cible à détecter se trouve en quantité suffisante (>100 copies environ). En revanche, pour des quantités plus faibles ou en présence d'inhibiteurs, la spécificité diminue ou disparaît (limites de détection et de quantification). Cette perte de spécificité retentit de façon significative sur la précision et la reproductibilité du dosage à réaliser. Cependant, si l'hybridation non spécifique est inéluctable dans ces conditions, l'amplification non spécifique consécutive peut être limitée, voire supprimée au moyen d'amorces de PCR soit plus spécifiques, soit moins susceptibles de générer des différences inter-échantillons. La RT-qPCR, grâce à une étape initiale de transcription inverse (conversion d'un ARN en un ADN complémentaire) permet la quantification des ARN. Cependant, la transcription inverse reste moins reproductible que la PCR, générant des différences inter-échantillons délétères en diagnostic comme en recherche. Au cours de ces travaux, je propose des méthodes originales améliorant de façon significative différentes étapes de ces techniques. Premièrement, je propose une amélioration de la standardisation de l'étape de transcription inverse capable de diminuer de façon significative la variabilité inter-échantillons ; l'utilisation d'un volume constant d'extrait d'ARN pour chaque échantillon améliore considérablement la précision de la quantification d'ARN messagers. Deuxièmement, je propose une modification des amorces par incorporation de résidus d'acides nucléiques bloqués (LNA) ; cette modification permet d'augmenter la spécificité des amorces aux limites de la détection. Enfin, je propose une méthode simple et économique permettant la mesure directe de la température de fusion (Tm) dans les conditions réelles de la PCR. Ce paramètre, considéré comme capital pour la réalisation des dosages par qPCR, est généralement obtenu par des méthodes prédictives peu précises. De plus, cette méthode doit permettre de déterminer précisément les paramètres thermodynamiques des amorces (∆G, ∆H et ∆S) et ainsi avoir accès d'une part au pourcentage réel d'amorces hybridées en fonction de la température et d'autre part d'identifier la susceptibilité des amorces aux inhibiteurs. / QPCR is currently the gold standard for DNA quantification of DNA. It can be defined as an exponential, cyclic and targeted amplification of a known DNA sequence. The exponential character of qPCR is both the cause of the sensitivity of the method but also a potential variability between samples. This variability is offset by the cyclical nature of the method that causes a synchronization of the reaction for all samples in each cycle. The targeted amplification of the selected sequence translates the specificity of the method. Nevertheless, this last property of PCR remains the least tested. The specificity of qPCR is unquestionable when the target to detect is sufficient (> 100 copies). However, for smaller quantities or in the presence of inhibitors, the specificity decreases or disappears (limits of detection and quantification). This loss of specificity will have a significant effect upon the accuracy and reproducibility of the assay to be performed. However, if non-specific hybridizations are unavoidable in these conditions, consecutive nonspecific amplification may be limited or eliminated using more specific PCR primers or less likely to produce inter-sample differences. RT-qPCR allows RNA quantification because of an initial step of reverse transcription (conversion of an RNA into a complementary DNA). However, reverse transcription is less reproducible than PCR, generating harmful inter-sample differences both in diagnosis and in the research field. In this work, I propose innovative methods improving significantly different steps of these techniques. First, I propose an improved standardization of the reverse transcription step that can significantly reduce the variability between samples; using a constant volume of RNA extract for each sample substantially improves mRNA quantification accuracy. Second, I propose a primers modification by incorporating Locked Nucleic Acid residues (LNA); this modification increases the specificity of the primers to the limits of detection. Finally, I propose a simple and economical method for direct measurement of the melting temperature (Tm) in real PCR conditions. This essential parameter in the achievement of qPCR assays is generally obtained by predictive methods with low accuracy. Furthermore, this method should determine the thermodynamic parameters of the oligonucleotide sequence (∆G, ∆H and ∆S), on the one hand allowing access to the actual percentage of annealed primers according to the temperature and on the other hand, to identify the primers susceptibility in the presence of inhibitors.

Les Acides Peptido-nucléiques (PNA) sont des analogues synthétiques d’oligonucleotides naturels, ils sont constitués d’une répétition d’unités N-(2-aminoethyl)-glycine reliées par une liaison peptidique. Leur stabilité chimique et biologique en font une alternative intéressante pour les assemblages supramoléculaires ayant une application biologique tels que l’encodage de chimiothèques combinatoires de petites molécules et des réactions engendrées par hybridation. Ce travail de thèse avait pour objectif la synthèse d’acides peptido-nucléiques modifiés dans le but d’améliorer leur hybridation, leurs propriétés physico-chimiques ainsi que la synthèse des chimiothèques combinatoires. / Peptide nucleic acids (PNA) are structural analogs of natural nucleic acids composed of repeating units of N-(2-aminoethyl)-glycine residues linked by peptide bonds. Their chemical and biological stability makes them very suitable for supramolecular assemblies with biological applications such as encoding combinatorial libraries of small molecules and for performing templated reactions. This phD project aimed at the synthesis of modified peptide nucleic acids to enhance their physicochemical and hybridization properties as well as for construction of combinatorial libraries.

All cellular RNAs contain numerous chemically modified nucleosides, but the largest number and the greatest variety are found in transfer RNA (tRNA). These modifications are posttranscriptionally introduced by modification enzymes during the complex process of tRNA maturation. The function of these modified nucleosides is not well known, but it seems that when present in the anticodon region, they play a direct role in increasing translational efficiency and fidelity, while modifications outside the anticodon region would be involved in the maintenance of the structural integrity of tRNA. Among the naturally occurring nucleoside modifications, base and ribose methylations are by far the most frequently encountered. They are catalyzed by tRNA methyltransferases (MTases), using generally the S-adenosyl-L-methionine (AdoMet) as methyl donor. Most of the knowledge about tRNA MTases comes from studies on bacterial and eukaryal model organisms, and very few informations are available about tRNA methylation in Archaea, particularly for thermophilic and hyperthermophilic Archaea whose GC-rich tRNAs are difficult to sequence. Nevertheless, some works on tRNA hydrolyzates from thermophiles or hyperthermophiles highlighted the presence of numerous methylated nucleosides. Furthermore, it has been shown that the only sequenced tRNA from an hyperthermophilic Archaea, the initiator methionine tRNA (tRNAiMet) from the Sulfolobus acidocaldarius, contains ten modified nucleosides, nine of them bearing a methylation on the base, on the ribose or on both base and ribose.<p>Of special interest is the modified nucleoside found at position 9 of this tRNA. It is an adenosine derivative, but the exact nature of the modification is unknown. In the yeast S. cerevisiae, some tRNAs with a guanosine at this position are methylated by the MTase Trm10p to form m1G9 (126). Since Trm10p-related proteins are found in hyperthermophilic archaea, such a homolog could be responsible for modification at position 9 of S. acidocaldarius tRNAiMet. In this work, we showed indeed that the Trm10p-related protein Saci_1677p from S. acidocaldarius methylates position 9 of tRNAs, but is specific for position N1 of adenosine, forming m1A rather than m1G. Interestingly, we demonstrated that Tk0422p from T. kodakaraensis, the euryarchaeal homolog to Saci_1677p, is the first tRNA MTase presenting a broadened nucleoside recognition capability, methylating both position N1 of A and of G to form m1A and m1G at position 9 of tRNAs. <p>This unique tRNA (m1A-m1G) MTase activity was further studied on one hand by site-directed mutagenesis of residues potentially important for the catalytic activity of Tk0422p enzyme, and on the other hand by determining the importance of the pH on the efficacy of the methylation reaction. Indeed, protonation state of atom N1 of A and G differs at physiological pH (N1 of G being protonated contrary to N1 of A), and we showed that m1G formation was increased with increasing pH. This could reflect the need of the enzyme to deprotonate G to be able to catalyze de methyltransfer. We showed also that the activity of the two archaeal enzymes (Saci_1677p and Tk0422p) present different dependence toward the structure of tRNA, the euryarchaeal Tk0422p requiring the intact tRNA structure while its crenarchaeal counterpart Saci_1677p being able to modify some truncated tRNAs.<p>Finally, some attempts to unveil the in vivo function of these enzymes, as well as their enzymatic mechanisms were undertaken, but these experiments are very preliminary and underline the needs for the development of genetic tools applicable to Archaea./ Tous les ARN cellulaires contiennent des nucléosides modifiés chimiquement, mais ce sont les ARNt qui en contiennent la plus grande variété et la plus grande proportion. Ces modifications sont introduites post-transcriptionnellement par des enzymes de modification durant le processus complexe de maturation des ARNt. Parmi les nucléosides modifiés, les méthylations de bases ou de riboses sont les plus fréquemment rencontrées. Elles sont catalysées par des ARNt méthyltransférases (MTases) utilisant pour la plupart de la S-adenosyl-L-methionine (AdoMet) comme donneur de méthyle. <p>La plupart des connaissances relatives aux ARNt MTases provient d’études sur des organismes modèles eucaryotes et bactériens, et peu de choses sont connues en ce qui concerne les archées, plus particulièrement les archées thermophiles et hyperthermophiles dont les ARNt GC riches sont difficiles à séquencer. Néanmoins, des travaux sur des hydrolysats d’ARNt de thermophiles et hyperthermophiles ont mis en évidence la présence d’un grand nombre de nucléosides modifiés. De plus, le seul ARNt d’archée hyperthermophile séquencé à ce jour, l’ARNtiMet de S. acidocaldarius contient 10 nucléosides modifiés, essentiellement par méthylation de la base, du ribose, ou des deux à la fois. Le nucléoside présent en position 9 de cet ARNt porte une modification chimique de nature encore inconnue. Or, chez la levure S. cerevisiae, certains ARNt possédant une guanosine à cette position sont méthylés par la MTase Trm10p pour former la 1-méthylguanosine. Etant donné qu’il existe une protéine apparentée à Trm10p chez les archées hyperthermophiles, celle-ci pourrait être responsable de la modification trouvée en position 9 de l’ARNtiMet de S. acidocaldarius. Dans ce travail, nous avons montré qu’effectivement la protéine Saci_1677p de la crénarchée S. acidocaldarius, orthologue à Trm10p, modifie la position 9 des ARNt, mais catalyse la formation de 1-methyladénosine (m1A) plutôt que de m1G dans les ARNt. De façon intéressante, nous avons montré que chez l’euryarchée T. kodakaraensis, l’enzyme Tk0422p homologue à Saci_1677p est capable de méthyler à la fois une adénosine et une guanosine en position 9 des ARNt. A notre connaissance, cette enzyme est la première ARNt MTase présentant une capacité élargie de reconnaissance de substrat.<p>Le présent travail a contribué à la caractérisation fonctionnelle et structurale de ces deux enzymes archéennes, et a permis d’améliorer la connaissance générale de la machinerie de modification des ARNt d’archées.<p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Ce travail s’inscrit dans le cadre de la recherche relative au développement de biosenseurs à ADN électrochimiques. Des aspects fondamentaux, ainsi que des aspects d’application de la détection d’hybridation d’ADN sont envisagés.<p>Dans un premier temps, le comportement interfacial et le processus d’hybridation d’oligonucléotides d’ADN linéaires et ADN hairpin (structure en épingle à cheveux) nonmarqués sont étudiés en formant des monocouches auto-assemblées mixtes de monobrins d’ADN (ssADN) thiolés et d’un hydroxyalcanethiol (4-mercaptobutan-1-ol) par coadsorption spontanée sur des électrodes d’or polycristallin. L’immobilisation de monocouches mixtes ssADN/MCB est caractérisée par voie électrochimique et par spectroscopie des photoélectrons X. Des mesures de chronocoulométrie, en présence de [Ru(NH3)6]3+ (RuHex), permettent de déterminer la quantité d’ADN dans la monocouche mixte formée. Les résultats montrent que l’excès superficiel d’ADN linéaire est plus important que l’excès superficiel d’ADN hairpin sous des conditions de formation identiques.<p>La réaction de reconnaissance moléculaire d’hybridation est détectée par des mesures d’impédance en présence de [Fe(CN)6]3-/4-. L’hybridation se traduit dans le cas de l’ADN linéaire par une augmentation de la résistance au transfert d’électron Rct tandis que dans le cas de l’ADN hairpin, Rct diminue. Ces différences sont dues au plus faible recouvrement et au changement de conformation des molécules d’ADN hairpin lors de l’hybridation. Des mesures de réflectivité de neutrons nous ont permis de mettre en évidence l’augmentation de l’épaisseur du film d’ADN hairpin et de confirmer le changement conformationel ces sondes lors de la reconnaissance moléculaire.<p>Dans la seconde partie, nous présentons une nouvelle méthode électrochimique de détection d’hybridation, basée sur les interactions électrostatiques entre le complexe cationique RuHex et les groupements phosphates de l’ADN. Afin d’améliorer la détection des molécules de PNA (peptide nucleic acid) ont été immobilisées comme sondes de reconnaissance moléculaire. Après hybridation des sondes PNA avec le brin complémentaire, RuHex s’adsorbe sur l’ADN hybridé et un signal de réduction de ces complexes redox, enregistré par voltampérométrie alternative, constitue une signature claire de l’hybridation d’ADN à l’interface modifiée. Les interactions RuHex/PNA-ADN ont été étudiées. La constante d’adsorption de RuHex sur l’électrode modifiée PNA/MCB après hybridation est évaluée à 2,9 (±0,3) 105 M-1 en milieu Tris-HCl 0,01M, selon une isotherme de Langmuir.<p>Les performances analytiques de la méthode de détection (sensibilité, sélectivité et reproductibilité) ont été évaluées et optimisées pour la détection des séquences d’ADN du gène de l’ARNr 23S d’Helicobacter pylori. La méthode de détection électrochimique présentée est assez sélective pour permettre de discriminer les mutations ponctuelles A2143G et A2144C de la séquence de type sauvage. La diminution significative des signaux d’admittance enregistrés en présence des séquences mutées est attribuée à la capacité accrue de discrimination de mutations ponctuelles des molécules PNA.<p>La réponse de détection est linéaire en fonction du logarithme de la concentration de la cible d’ADN sur plus de quatre ordres de grandeur (10-6 M à 10-10 M). La limite de détection de l’oligonucléotide d’ADN complémentaire de 80 pM est très bonne. La méthode a été appliquée avec succès à la détection de fragments PCR complémentaires de 100 et 400 paires de bases, amplifiés à partir de souches SS1 d’H.pylori. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La criminalistique peut être définie comme l’application de procédés techniques aux investigations judiciaires permettant l’étude scientifique des traces et des indices retrouvés sur les scènes de crime.Depuis la découverte de l’empreinte génétique par Sir Alec Jeffreys en 1984, le monde judiciaire s’est profondément ancré dans l’ère de l’ADN en raison d’évolutions technologiques successives dans le domaine de la biologie moléculaire et ses applications en criminalistique. Le besoin de réponse instantanée est omniprésent dans les esprits. La mise en œuvre de techniques d’analyses simples, sensibles, fiables et permettant d’obtenir des résultats dans les plus brefs délais sont les clés du succès.Au cours des processus techniques, la collecte du matériel biologique, et donc de l’ADN au sein de la trace, constitue une étape incontournable et cruciale qui va conditionner la réussite des analyses. Ce travail de recherche a donc consisté à développer des solutions performantes de prélèvements de matériels biologiques soit en détournant de leur fonction initiale des solutions existantes soit en développant des solutions simples mais innovantes combinant les avantages des solutions existantes. Ces travaux ont permis de donner naissance au micro-écouvillon GendSAG. Les potentialités de GendSAG permettent de proposer une solution alternative aux solutions commerciales de systèmes intégrés d’analyses rapide d’ADN. Cette solution alternative d’analyse rapide et haut débit de l’ADN mise en œuvre dans un laboratoire mobile au plus près de la scène de crime répond non seulement à la grande majorité des avantages des systèmes intégrés mais également à toutes leurs limitations. / Forensic sciences can be defined as the used of technical processes to judicial investigations allowing the scientific study of traces and evidences found on crime scenes.Since the discovery of DNA fingerprinting by Sir Alec Jeffreys in 1984, the legal world has become deeply rooted in the DNA by successive technological developments in molecular biology and its applications in forensic. The need for instant response is omnipresent in the minds. The key to success is the implementation of simple, sensitive, reliable analytical techniques that enable results to be achieved in the shortest possible time.During these technical processes, the collection of biological samples, is an unavoidable and a crucial step that will condition the analysis success rate. This study consisted in developing efficient biological collecting solutions either by diverting from their original function the existing solutions or by developing simple but innovative solutions combining the advantages of the existing solutions. This allowed developing the micro-swab GendSAG. The potentialities of GendSAG make it possible to propose an alternative solution to the commercial rapid DNA analysis integrated systems. This rapid, cost effective and high-throughput DNA analysis solution performed in a dedicated mobile laboratory directly into the crime scene enables the large majority of the rapid DNA analysis integrated systems benefits and also all of their limitations.

Les séquences riches en guanines, qu’elles soient ADN ou ARN, peuvent former des structures non canoniques à quatre brins appelées quadruplexes de guanines ou G-quadruplexes. Ces structures reposent sur la formation et l’empilement de quartets de guanines ; elles peuvent être trouvées dans de nombreuses régions du génome. Des motifs G-quadruplexes apparaissent fréquemment lors de la sélection d'aptamères par SELEX : on constate un biais dans la proportion de guanines par rapport aux autres nucléotides dans les bases de données regroupant les séquences d'aptamères connus. Nous avons entrepris une analyse systématique, in silico puis in vitro, de motifs aptamères décrits dans la littérature. Nous avons utilisé un algorithme de prédiction actuellement développé au sein du laboratoire dans le but de déterminer quelles sont les séquences susceptibles de former des G-quadruplexes in silico. Afin de vérifier ces prédictions, un test biophysique permettant de cribler rapidement de nombreuses séquences a été mis en place. Nos résultats démontrent que de nombreux aptamères publiés sont susceptibles de se replier en G-quadruplexe. Un autre volet de ce travail concernait la mise en pratique du SELEX avec deux objectifs distincts. Nous avons d'abord effectué une sélection in vitro contre un ligand de G-quadruplexes, afin de préciser quels motifs nucléiques peuvent interagir avec cette molécule. Nous avons réalisé ensuite des expérience de SELEX contre plusieurs G-quadruplexes ADN ou ARN biologiquement pertinents (motif télomérique humain, répétitions minisatellites et séquences présentes dans les UTR de différents ARNm), dans le but d'obtenir des sondes spécifiques de ces conformations. / Guanine-rich DNA or RNA sequences can adopt non-canonical structures composed of four strands called guanines quadruplexes or G-quadruplexes. These structures are made by the formation and stacking of guanine quartets; they can be found in various region of the genome. G-quadruplexes motifs are frequently found during the selection of aptamers by the so-called SELEX method: a bias exists in the proportion of guanines in comparison with other nucleotides in a database gathering together known aptamers sequences. We did an in silico then in vitro systematic analysis of aptameric motifs described in the literature. We used a prediction algorithm currently developed in the laboratory to determine which sequences car form G-quadruplexes in silico. In order to check those predictions, a biophysical test allowing to quickly assay a lot of sequences was set up. Our results demonstrate that a lot of published aptamers are able to fold into G-quadruplexes. Another part of this work is related to the use of the SELEX with two different goals. First of all we did an in vitro selection against a G-quadruplexes ligand, in order to tell exactly which nucleic motifs can interact with this molecule. We then carried out SELEX experiments against several DNA or RNA biologically relevant G-quadruplexes (human telomeric motifs, minisatellite repetitions and sequences from UTR of mRNA), with the aim of getting specific probes for these conformations.

La thèse a pour objet l’analyse de mécanismes d’assemblage permettant la création de structures auto-assemblées à base d’ADN, fonctionnalisées par des protéines. Les PDNA sont des molécules synthétiques associant de manière covalente une séquence d’ADN et un module protéique. Basés sur le domaine hèmique du cytochrome b5, les PDNA présentent des propriétés d’absorption optique dépendant de l’état d’oxydoréduction. Pour comparer leurs propriétés d’assemblage à celles des ADN correspondants, différentes briques ont été assemblées en ensembles finis ou ouverts. Un premier chapitre développe des approches expérimentales et de modélisation pour caractériser les paramètres contrôlant ces assemblages dans le cas des ADN. Un second chapitre transpose ces approches aux assemblages de PDNA afin de mettre en évidence l’influence des domaines protéiques. Dans les deux cas, les travaux sont menés à la fois à un niveau macroscopique et de molécule unique par AFM classique ou à haute vitesse. Une troisième partie vise à comprendre comment ces assemblages peuvent être multiplexés sur des puces au sein de matrices poreuses de dextran. Nous avons modélisé l’influence de la matrice sur l’assemblage et utilisé ces modèles pour définir les relations entre observables et paramètres microscopiques. Une dernière partie vise à lever les limitations (pièges d’assemblages) mises en évidence dans les réactions sous contrôle cinétique. Nous avons développé des assemblages dans des conditions douces et contrôlées par le pH impliquant des structures ADN en motifs-i. Leur mécanisme de formation et de polymérisation en suprastructures a été étudié en combinant biochimie et analyse structurale par AFM. / The work aimed at the analysis of assembly mechanisms allowing the creation of DNA-based self-assembled structures functionalized with proteins. PDNA are synthetic molecules covalently associating a DNA strand to a protein domain. The ones based on the heme binding domain of cytochrome b5 feature optic properties that depend on oxydoreduction state. In order to compare self-assembly properties of PDNA and corresponding DNA, different building blocks were assembled into converging or open ensembles. A first part develops experimental and modeling approaches to characterize parameters controlling such assemblies of DNA blocks. A second part extends these approaches to PDNA assemblies, bringing in evidence the influence of the protein domain on nucleic parts. Studies were both performed at macroscopic and single molecule levels using conventional and high-speed AFM. A third part describes how chip multiplexing of those assemblies onto a porous dextran matrix influences behaviors. Modeling the matrix influence on assembly allowed defining relations between experimental and macroscopic parameters. A last part aims at bypassing bottlenecks related to the formation of trapped structures when reactions are kinetically driven. We developed i-motif based DNA structures that can be assembled into mild, pH controlled conditions. Their mechanism of formation and polymerization into supramolecular structures were studied combining physico-chemical and structural analyses using AFM.