Die Graft-versus-host-Disease (GvHD) zeichnet sich dadurch aus, dass bei einer Gewebetransplantation (Transplantation des Knochenmarks) die transplantierten Zellen des Donors vom Empfänger abgestoßen werden. In der vorliegenden Arbeit wurde ein möglicher gentherapeutischer Ansatz mittels Nutzung von Oligonukleotiden untersucht. Diese beruhen u.a. auf der Inaktivierung reifer T-Zellen des Spenders, welche Gewebe als fremd erkennen und schwere Entzündungen hervorrufen. Die Aktivierung der T-Zellen erfolgt über die Bindung des CD4-Moleküls und des kostimulatorischen Rezeptors CD28 an den MHCII Komplex von antigen-präsentierenden Zellen des Empfängers. Die Inaktivierung der CD4 und CD28 Gene, und somit die Hemmung der T-Zellaktivität des Spenders, erfolgte durch antisense Oligonukleotide (AONs) und durch small interfering RNAs (siRNA). Zur effizienten und sicheren Einschleusung (Transfektion) der Oligonukleotide in die Zielzellen wurden Nanopartikel verwendet. Die Wirkung wurde zunächst in vitro an murinen und humanen Zellen und anschließend in vivo an einem GvHD-Mausmodell (allogen, transgen) untersucht. In den Mausmodellen wurden weiterhin zwei Applikationsschemata gewählt, zum einen die Behandlung der Spenderzellen ex vivo und zum anderen die direkte i.p.Applikation der Oligonukleotide in die Maus. Die Ergebnisse lassen sich wie folgt zusammenfassen: Eine verminderte Expression der Oberflächenmoleküle CD4 und CD28 erfolgte nach Gabe zweier funktioneller AONs mit muriner Sequenz, in vitro. In murinen Milzzellen ließ sich durch diese beiden funktionellen AONs die Produktion der pro-inflammatorischen Zytokine Interferon γ (IFNγ) und Tumornekrosefaktor α (TNFα) hemmen. Zusätzlich bewirkte der Einsatz eines AON und einer siRNA mit einer funktionellen humanen Sequenz eine Hemmung der CD4 Expression in humanen PBMCs. Insbesondere die kombinierte Behandlung mit a-CD4 und a-CD28 AONs zeigte im murinem allogenen GvHD Modell einen signifikant positiven Effekt auf das Überleben sowie die Krankheitssymptome der Versuchstiere. Der positive Effekt konnte ebenso durch eine Reduktion von pro-inflammatorischen Zytokinen und einer verminderten Expression der Oberflächenmoleküle CD4 und CD28 bestätigt werden. Ähnlich wie das allogene Modell zeigte auch das CD4 transgene Modell positive Effekte hinsichtlich des Überlebens und der Herunterreglierung pro-inflammatorischer Zytokine. Anschließend erfolgten Studien zur Lokalisation (Biodistribution) der Nanopartikel-Nukleinsäure-Komplexe und die Untersuchung der Seren auf allgemeine Leber- und Nieren-toxische Schäden. Sie führten zu folgenden Ergebnissen: Unabhängig von der Applikationsart (i.p. und i.v.) befanden sich nach 24h die Komplexe hauptsächlich in der Lunge. Ebenfalls ließen sich relevante Mengen im Knochenmark und im Dünndarm der transplantierten Tiere nachweisen. Diese beiden Gewebe sind besonders interessant für therapeutische Ansätze zur Behandlung einer aufkommenden GvHD. Unabhängig von der Art der Komplexierung (AON ± PEI) wurde ein Anstieg Anstieg der Aspartat-Aminotransferase (lebertoxischer Parameter) und Glukose beobachtet. Generell scheint die Behandlung der GvHD mittels Oligonukleotide erfolgreich zu sein, neben der geigneten funktionellen Sequenz muss jedoch die chemische Modifikation der Oligonukleotide und die zielgerichtete Biodistribution in vivo evaluiert werden.:Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis ......................................................................................... iii 1 Einleitung ................................................................................................ 1 1.1 Prinzipien der Gentherapie ................................................................. 1 1.1.1 Mechanismen der Gentherapie ....................................................... 2 1.1.2 Methoden des Transfers therapeutischer Nukleinsäuren ................ 8 1.2 Graft-versus-Host-Disease .................................................................. 11 1.2.1 Pathologie ....................................................................................... 11 1.2.2 Klinik und Methoden zur Behandlung der GvHD ............................. 14 1.2.3 GvHD-Modelle ................................................................................. 17 1.3 Zielstellung........................................................................................... 19 2 Material & Methoden ................................................................................ 20 2.1 Design funktioneller Oligonukleotide .................................................... 20 2.2 In vitro Zellkultur .................................................................................. 21 2.2.1 Zelllinien und primäre Immunzellen ................................................. 21 2.2.2 Stimulation und Transfektion ........................................................... 23 2.3 In vivo GvHD Modell ............................................................................ 24 2.3.1 Zeitlicher Ablauf und Durchführung ................................................. 25 2.3.2 Begleitendes klinisches Monitoring & Probenentnahme ................. 29 2.4 Funktionellen Messungen .................................................................... 30 2.4.1 Quantitative mRNA Expression ....................................................... 30 2.4.2 Proliferationstest ............................................................................. 33 2.4.3 Differentialblutbild ............................................................................ 34 2.4.4 Histologie ........................................................................................ 35 2.4.5 Serummessung ............................................................................... 36 2.4.6 Durchflußzytometrie ........................................................................ 37 2.5 Statistik ................................................................................................ 39 3 Ergebnisse ............................................................................................... 40 3.1 Anwendung funktioneller Oligonukleotide in vitro ................................ 40 3.2 Anwendung funktioneller Oligonukleotide in vivo ................................. 49 3.2.1 Indirekte ex vivo Applikation ............................................................ 50 3.2.2 Direkte in vivo Applikation im murinem allogenen Modell ............... 69 3.3 Pharmakologie in vivo applizierter Nukleinsäure-Komplexe ............ 77 3.3.1 Biodistribution .................................................................................. 77 3.3.2 Toxikologie ...................................................................................... 81 4 Diskussion ............................................................................................... 85 4.1 Anwendung funktioneller Oligonukleotide in vitro ................................ 85 ii 4.2 Indirekte ex vivo Applikation zur Prävention der GvHD ....................... 89 4.2.1 allogenes Tiermodell ....................................................................... 89 4.2.2 transgenes Tiermodell ..................................................................... 93 4.3 Therapeutischer anti-GvHD Oligonukleotid-basierter Ansatz (in vivo Applikation) .......................................................................................... 94 4.4 Biodistribution applizierter Oligonukleotide .......................................... 96 4.5 Untersuchung unspezifischer Toxizität nach in vivo Applikation .......... 98 Zusammenfassung der Arbeit ............................................................................. 101 Anhang ................................................................................................................. vii 5 Literaturverzeichnis .................................................................................. xxi 6 Tabellenverzeichnis ................................................................................. xxxiv 7 Abbildungsverzeichnis ............................................................................. xxxiv

The thesis comprises the synthesis and spectroscopic characterization of novel lipid derivatives mainly of the cancerostatic 5-fluorouridine (5-FU). The chemical structure of the lipid residues resembles naturally occurring compounds, namely acyclic terpenes, waxes, and large ring ketones. They are positioned either at N(3) or at the O-2’,3’ cis-glycolic moiety of the nucleoside. The introduction of the lipophilic residues was performed either by ketalization of the glyconic hydroxyls or by direct alkylation as well as by Mitsunobu reaction at N(3) of the aglycone. The resulting nucleolipids were further converted to 2-(cyanoethyl) phosphoramidites as building blocks for automated solid phase nucleic acid synthesis. The latters were used for the preparation of a series of lipo-oligonucleotides which were studied with respect to their immobilization within artificial lipid bilayers and compared concerning immobilization rate and stability. Moreover, selected 5-FU nucleolipids were fluorophore-labelled and tested with respect to their cancerostatic activity towards human colon carcinoma cells (HT-29). Additionally, O-2’,3’-functionalized 5-FU ketals were covalently bound either to soluble chitosanes of various molecular weight or to chitosane foils. The latters were studied towards their enzymatic degradability. Last, the reaction of lipophilic phosphoramidites with the blood volume expander hydroxyethyl starch yielding enzymatically hydrolysable phosphodiester bonds was investigated.

Eingeschränkte Apoptose trägt zur Tumorentstehung und zur Entwicklung von Chemoresistenz bei, da die Apoptose normalerweise Zellen mit genetischen Schäden oder malignem Potential eliminiert. Dieser Prozess, der bereits für viele unterschiedlichen Tumorzellen nachgewiesen wurde, limitiert häufig die Behandelbarkeit maligner Erkrankungen und ist somit ein grosses Problem in der heutigen Krebsbehandlung. Es existieren unterschiedliche Ansätze die Auslöseschwelle für die Apoptose zu vermindern, um so Chemotherapie-resistente Tumorzellen zu eliminieren. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde das anti-tumorale Potential des bispezifischen 4625 Antisense-Oligonukleotid in Kombination mit chemotherapeutischen Wirkstoffen in vitro und in vivo untersucht. Der zweite Teil beschreibt die Ergebnisse mit dem rekombinanten Ep-CAM spezifischen scFv Immunotoxin 4D5MOC-B-ETA in vitro und im Modell der Nacktmaus. Bcl-2 und Bcl-xL sind Inhibitoren der Apoptose, die von vielen malignen Tumorzellen überexprimiert werden. Das Herunterregulieren von Bcl-2 oder Bcl-xL erniedrigt die apoptotische Auslöseschwelle und Tumorzellen sterben durch programmierten Zelltod. Das 4625 Antisense Oligonukleotid richtet sich gegen eine Region hoher Homologie in der bcl-2/bcl-xL mRNA und hemmt simultan die Expression von Bcl-2 und Bcl-xL. Die durch das bispezifische 4625 Antisense gehemmte Expression von Bcl-2 und Bcl-xL in Tumorzellen unterschiedlicher Histologie zeigen die Ergebnisse der Immuno-Blots. Weiterhin führt 4625 zur dosisabhängigen Wachstumshemmung von Krebszellen bei Konzentrationen von 75-600 nM im MTT Assay. Für die Kombinationsbehandlung wurden Paclitaxel und 5-FU jeweils als Standardtherapie zur Behandlung von Brust- und kolorektalem Karzinom gewählt. Die ip. Applikation von 20mg/kg KG 4625 mit oder ohne Paclitaxel/5-FU führte zu einem verlangsamten Wachstum humaner Tumor Xenotransplantaten in Nacktmäusen, im Vergleich mit denen die mit dem Kontrolloligonukleotid 4626 mit oder ohne Chemotherapie behandelt wurden. Bcl-2 und Bcl-xL spielen unterschiedliche Rollen in der Tumorentwicklung und sind häufig heterogen in soliden Tumorgeweben exprimiert. Diese Daten zeigen, daß die moderne Antisense Technologie eine wirksame Methode zur Herunterregulierung zweier Hauptinhibitoren der Apoptose mit einem einzigen Oligonukleotid darstellt, wovon möglicherweise mehr Patienten mit malignen Erkrankungen in Zukunft profitieren könnten. Die Expression bestimmter Zelloberflächenmoleküle ist ein häufiger Prozess in vielen soliden Tumoren, was sie für eine zielgerichtete Antikörpertherapie angreifbar macht. Das epitheliale Glykoprotein-2 (Ep-CAM) wird reichlich von epithelialen Tumoren und Tumorzellinien exprimiert. Die antineoplastische Aktivität des Ep-CAM spezifischen 4D5MOC-B-ETA Immunotoxin wird im zweiten Teil dieser Arbeit beschrieben. In vitro hemmt 4D5MOC-B-ETA spezifisch die Proteinsynthese in Ep-CAM positiven Krebszellen unterschiedlichen histologischen Ursprungs ermittelt durch [H3]leucin Aufnahme und reduzierte die Überlebensrate dieser Zellen in Konzentrationen von 0.01 bis 1 pM. Ep-CAM negative Zellen wurden als negative Kontrolle genutzt und blieben durch das Immunotoxin in Konzentration bis zu 10.000 pM unversehrt, was dessen hochgradige Ep-CAM Spezifität beweist. Die tägliche Applikation von 0.01 mg 4D5MOC-B-ETA im Nacktmausmodell führte zu einem Schrumpfen der Tumor Xenotransplantate während der Behandlungszeit. Diese hohe Wirksamkeit des scFv Immunotoxin bedarf weiterer Beachtung in der zukünftigen Krebstherapie. / Impaired apoptosis contributes to cancer development and resistance towards chemotherapy, since apoptosis normally eliminates cells with damaged DNA or increased malignant potential. The increased resistance towards cell death often limits therapeutic options in the clinic and is one major problemin current tumor therapy. Different approaches, which have been described so far intend to lower the apoptotic threshold in order to eliminate chemoresistant cancer cells. In the first part of this thesis the anti-tumor potential of the bispecific 4625 oligonucleotide was investigated in combination with chemotherapeutic drugs in vitro and in vivo. The second part describes the anti tumor activity of the recombinant Ep-CAM specific scFv immunotoxin 4D5MOC-B-ETA in vitro and in nude mice. Bcl-2 and Bcl-xL are inhibitors of apoptosis frequently overexpressed in malignant tumor cells. Downregulation of either Bcl-2 or Bcl-xL lowers the apoptotic threshold and tumor cells undergo apoptosis. The 4625 antisense oligonucleotide targets a region of high homology shared by the bcl-2/bcl-xL mRNAs and simultaneously downregulates Bcl-2 and Bcl-xL. The 4625 bispecific Antisense Oligonucleotide downregulates Bcl-2 and Bcl-xL expression in cancer cell lines of diverse histological origins assessed by immuno blotting. It further leads to proliferation inhibition of cancer cells at concentrations ranging from 75-600 nM in MTT assay in a dose-dependent manner. For combination experiments Paclitaxel and 5-FU were chosen as standard therapy for the treatment of breast and colorectal cancer, respectively. The ip. application of 20 mg/kg 4625 with or without Paclitaxel/5-FU led to a growth inhibition of established human carcinomas xenografts in nude mice, relative to those treated with the 4626 control oligonucleotide with or without chemotherapy. Bcl-2 and Bcl-xL play nonredundant roles in tumor growth and are often heterogeneously expressed in solid tumor tissues. This data suggests that state-of-the-art antisense technology offers a potent approach to inhibit the expression of the two major anti-apoptotic proteins Bcl-2 and Bcl-xL with one single oligonucleotide, which could make additional patients benefit from a treatment with this antisense compound. Expression of certain cell surface antigens is a common process in many solid tumors making them suitable for targeted antibody therapy. The epithelial glycoprotein-2 (Ep-CAM) is abundantly expressed on carcinomas and cancer cell lines. The anti tumor activity of the Ep-CAM specific 4D5MOC-B-ETA immunotoxin is described in the second part. In vitro 4D5MOC-B-ETA specifically inhibited protein synthesis in Ep-CAM positive cancer cells of diverse histological origin assessed by [H3]leucin incorporation and reduced cell viability with IC50 ranging from 0.01 to 1 pM. Ep-CAM negative cells were taken as control and were not harmed by the immunotoxin at concentrations up to 10.000 pM, which proves the 4D5MOC-B-ETA Ep-CAM specific potential. In athymic mice, the systemic application of 4D5MOC-B-ETA at a dose of 0.01 mg per day resulted in the regression of established tumor xenografts during the time of treatment. This highly potent anti-tumor activity of a recombinant scFv immunotxin deserves further attention for use in cancer therapy.

Die hydrolysestabile C-C-Bindung von Nukleosiden, deren Nukleobase über ein aromatisches oder methylen-verbrücktes Kohlenstoffatom an Ribose oder 2-Desoxyribose gebunden ist, ermöglicht die Synthese von neuartigen Strukturen und Eigenschaften, die bei N-Nukleosiden nicht stabil oder nicht gegeben wären. In dieser Arbeit wurde die die Cuprat-vermittelte Glycosylierung und die Friedel-Crafts-Alkylierung als Methoden zur Darstellung von Desoxyribose-basierenden C-Nukleosiden weiterentwickelt. Die Cuprat-vermittelte Glycosilierung ermöglichte die Synthese von C-Nukleosiden in bis zu 93% Ausbeute, wenn Grignard-basierende Normant-Cuprate verwendet wurden. Die Verwendung Organolithium-basierender Gilman-Cuprate war ebenfalls möglich. In Gegenwart von Sauerstoff wurden O-Glycoside isoliert in über 80 % Ausbeute isoliert. Mit den C-Nukleosiden wurden modifizierte Oligonukleotide, die als potentiell verbesserte Binder an M.TaqI und E.coli Dam dienen, dargestellt. Nach ihrer Charakterisierung über Schmelzwerte und Fluoreszenzeigenschaften wurde diese an die Arbeitsgruppe von Prof. Elmar Weinhold weitergereicht und dort erfolgreich als optimierte Binder an an M.TaqI und E.coli Dam getestet. Oligonukleotide, die ein oder mehrere 1,1-Binaphthyl-Chromophore als einen neuen Typus eines torsionsflexiblen Farbstoffes enthalten, wurden untersucht. Die Einführung mehrerer aufeinander folgender Binaphthyle führte zu einer thermodynamischen Stabilisierung von Duplex-Oligonukleotiden. Die geringe Neigung Binaphthyls zur Selbstlöschung bewirkte dabei einen starken Anstieg der Fluoreszenz. / The stable C-C-bond of ncleosides, whose nucleobase is attached to the ribose or 2-deoxyribose via an aromatic or methylen-bridged carbon atom, is stable to hydrolyses. This allows the synthesis of new structures and properties, which would not be available in N-nucleosides. In this work, a cuprate-mediated glycosilation and the Friedel-Crafts-alkylation as methods for the preparation of doxyribose-based C-nucleosides were developed. The cuprate-mediated glycosilation allowed the synthesis of C-nucleosides in up to 93 % yield, when Grignard-based Normant-Cuprates were used. The use of Organolithium-based Gilman-Cuprates was also possible. In the presence of oxygen O-glycosides were isolated in over 80 % yield. With the C-nucleosides modified oligonucleotides, which serve as potentially improved binders of the DNA-methyltransferases M.TaqI und E.coli, were prepared. After their charakterisation via melting point measurements and fluorescence properties, the oligonucleotides were given to the working group of Prof. Elmar Weinhold and successfully tested as improved binders of the DNA-methyltransferases M.TaqI und E.coli. Oligonucleotides, which contain one or multiple 1,1-binaphthyles as a new type of a torsionally flexible chromophore, were charakterised. The incorporation of several successive binaphthyls led to a thermodynamical stabilisation of the duplex-oligonucleotides. The low tendency of the Binaphthyl for self-quenching caused a remarkable increase of the fluorescence.

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Die Telomere sind spezialisierte DNA-Protein-Komplexe, die sich an den Enden der Chromosomen der eukaryotischen Zellen befinden. Die Telomerase ist ein Ribonukleoprotein, welches für die vollständige Replikation der Telomere bei den meisten Eukaryoten verantwortlich ist. Die katalytische Untereinheit des Enzyms (hTERT beim Menschen) besitzt Reverse-Transkriptase-Aktivität, und nutzt eine integrierte RNA (hTR beim Menschen) als Template, um Telomer-Wiederholungssequenzen an den Enden der Chromosomen zu synthetisieren. Die Telomerase ist in den meisten normalen humanen somatischen Zellen unterdrückt. In den meisten Krebszellen jedoch, stellt die Reaktivierung der Telomerase zur Beibehaltung der Telomerlänge eine Voraussetzung für deren unbegrenztes Wachstumspotential dar. Im Rahmen dieser Arbeit sollte ein neuer, einfacher und selektiver Assay für den Nachweis der humanen Telomerase entwickelt werden. In dem neuen Assay sollten die beiden Kernkomponenten des Enzyms, die Protein-Untereinheit und die RNA, die Targets sein. Der Test ist in seiner Grundstruktur wie folgt aufgebaut : 1. Immobilisierung der Telomerase über die hTERT an eine Festphase, beschichtet mit Phosphorothioat-modifizierten (PS) Oligonukleotiden oder Heparin. Zusammen mit der Telomerase werden bei diesem Schritt die Heparin-bindenden Proteine, die in der Probe enthalten sind, an die Festphase gebunden. 2. Spezifischer Nachweis der hTR. Zur Detektion der hTR wird ein Oligonukleotid-Ligations-Assay (OLA) oder eine Reverse-Transkriptase-PCR (RT-PCR) eingesetzt. In der optimierten Endversion wurde zur Immobilisierung des Enzyms eine Festphase, beschichtet mit PS-Oligonukleotiden, verwendet. Die hTR wurde mittels RT-PCR nachgewiesen. Mit dem neuen Assay wurden erfolgreich 75 Tumorzellen detektiert. / Telomeres are specialized DNA-Protein structures located at the ends of linear eukaryotic chromosomes. Telomerase is a ribonucleoprotein, which is responsible for the complete replication of the telomeres in most eukaryotes. The catalytic reverse transcriptase protein subunit (hTERT in humans) of the nucleoprotein uses an integral RNA (hTR in humans) as a template for the addition of telomeric repeat sequences to the ends of chromosomes. Telomerase is repressed in most normal human somatic cells, while the reactivation of telomerase to maintain telomere length is necessary for the unlimited growth potential of most human cancer cells. The aim of this work was the development of a new, simple and selective assay for the detection of human telomerase. The targets of the new assay were the two core subunits of the enzyme : hTERT and hTR. The test comprises two principal steps : 1. Immobilization of the telomerase via the hTERT subunit on a solid phase, coated with heparin or phosphorothioate-modified (PS) oligonucleotides. In this step telomerase is bound together with the heparin-binding proteins of the analysed sample to the surface. 2. Specific detection of the hTR. For the detection of the hTR an oligonucleotide ligation assay (OLA) or a reverse transcriptase PCR (RT-PCR) was used. In the optimized final version of the assay a PS-coated solid phase was used for the immobilization of the enzyme. Reverse transcriptase PCR was applied for detection of the hTR. 75 tumor cells were successfully detected with the new assay.