Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, Programa de Pós-Graduação em Fitopatologia, 2014. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2015-05-08T15:31:34Z No. of bitstreams: 1 2014_EleniceAlvesBarboza.pdf: 2756246 bytes, checksum: da497bca2a4dbe7795ad54ef3b1d07b4 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2015-05-11T11:14:23Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_EleniceAlvesBarboza.pdf: 2756246 bytes, checksum: da497bca2a4dbe7795ad54ef3b1d07b4 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-11T11:14:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_EleniceAlvesBarboza.pdf: 2756246 bytes, checksum: da497bca2a4dbe7795ad54ef3b1d07b4 (MD5) / A irrigação é um insumo indispensável para a produção de alimentos durante grande parte do ano. Entretanto, a fonte de água utilizada pode carregar propágulos de patógenos que causam doenças em plantas cultivadas. Entre os microrganismos que frequentemente são isolados de ambientes aquáticos, destacam-se os representantes do Filo Oomycota, incluindo espécies de fitopatógenos dos gêneros Pythium e Phytophthora. A detecção e o monitoramento dessas espécies tornou-se um passo chave para o manejo de doenças de plantas, principalmente em países que reciclam a água da irrigação. No Brasil, ainda é muito incipiente o conhecimento sobre a diversidade e os aspectos ecológicos de Pythium spp. e Phytopthora spp. em ecossistemas aquáticos, assim como a disponibilidade de métodos práticos e acessíveis para a detecção das espécies na água. Desta forma, na primeira etapa deste estudo foram avaliadas folhas de diferentes espécies vegetais como iscas para Pythium e Phytophthora em fontes de água usada para irrigação de tomateiro. A patogenicidade dos isolados obtidos foi testada em frutos de tomate verdes. Em todos os locais de coleta e meses foi possível o isolamento de Pythium e Phytophthora da água por meio da utilização de iscas, no entanto a frequência de isolamento variou entre os locais e entre os meses de amostragem. A maior frequência de detecção de Phytophthora foi observada no reservatório do Sítio Cachoeira e no Córrego Capoeira Grande em todos os meses, exceto em setembro em que a frequência foi maior na nascente do Sítio Cachoeira. Para Pythium, houve diferença entre os locis e os meses de coleta dependendo do meio de cultura, com uma menor frequência de detecção no meio BARPNH. A maior frequência de isolamento foi observada no córrego do Roncador e no córrego Capoeira Grande, nos meios de cultura BAPRN e BARPNH, respectivamente. As folhas de tomateiro permitiram uma alta frquência de detecção, independente do local e mês de coleta, e foi considerada promissora como iscas para Pythium e Phytophthora em ambientes aquáticos. Folhas de capim elefante também possibilitaram alta recuperação de isolados de Pythium da água, assim como folhas de manga para Phytophthora. Por fim, os isolados obtidos das fontes de água foram caracterizados por meio da observação dos caracteres morfológicos e do sequenciamento da região ITS1, 5.8S e ITS2 do rDNA. Como resultado, foi possível identificar sete espécies diferentes, das quais cinco pertenciam ao gênero Pythium e duas, ao gênero Phytophthora. A análise filogenética demonstrou que as espécies de Pythium foram separadas de acordo com a morfologia dos esporângios, assim, P. helicoides e P. chamaihyphon, que possuem esporângios globosos, permaneceram no mesmo clado, enquanto as espécies P. catenulatum, P. myriotylum e P. graminicola, com esporângios filamentosos, permaneceram em um clado separado. Todas as espécies de Phytophthora foram incluídas no clado 9, de acordo com a análise das sequências da região ITS, que engloba várias espécies encontradas em ambientes aquáticos. No teste de patogenicidade, apenas para o isolado de P. helicoides foi comprovadamente patogênico, causando podridão de frutos em todas as repetições no segundo dia após a inoculação. Os isolados de Phytophthora não se mostram patogênicos à frutos de tomate. Os resultados observados para os demais isolados foram menos conclusivos devido à maior diferença entre os experimentos conduzidos em diferentes épocas. Dessa forma, foi possível recuperar espécies de fitopatógenos de fontes de água de irrigação por meio do uso de folhas, sendo que as folhas de tomateiro se apresentaram como eficientes iscas para os dois gêneros testados. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Irrigation is an essential input for the agricultural yeld year round. However, the source of water used for it can carry propagules of pathogens that cause disease in cultivated plants. Among the microorganisms that are frequently isolated from aquatic environments, the representatives of the Phylum Oomycota stand out, including plant pathogen species of the genus Pythium and Phytophthora. The detection and monitoring of these species has become a key step for the management of plant diseases, mainly where irrigation water is recycled. In Brazil, knowledge about the diversity and ecological aspects of Pythium spp. and Phytopthora spp. in aquatic ecosystems is incipient, as well as the availability of practical and affordable methods for the detection of species in water. Thus, in the first stage of this study, leaves of different plant species were tested as bait for Pythium and Phytophthora monitoring in water souces used for irrigation of tomato. The pathogenicity of the obtained oomycete isolates was tested on green tomato fruits. In all sampling places and months it was possible to isolate Pythium and Phytophthora of the water through the use of baits, however the frequency of isolation ranged among the sampling spots and among sampling months. The highest frequency of detection of Phytophthora was observed in the Sítio Cachoeira reservoir and the Capoeira Grande stream in every month, except in september when the isolation rate was highest in the Sítio Cachoeira headspring. For Pythium, there were differences between sampling sites and months depending on the culture medium, with a lowest detection frequency in the BARPNH medium. The highest frequency of isolation was observed in the Roncador stream and Capoeira Grande stream, in the BAPRN and BARPNH culture media, respectively. The tomato leaves enabled a high detection frequency, independent of location and sampling month, and its considered promising as a specie bait for Pythium and Phytophthora in aquatic environments. Napier grass leaves also enabled high recovery of isolates of Pythium from water, as well as mango leaves to Phytophthora. Finally, isolates obtained from water sources were characterized by morphological characters and sequencing of the ITS1, 5.8S e ITS2 region of the rDNA. As a result, seven different species, five from the genus Pythium and two from the genus Phytophthora, were identified. Phylogenetic analysis showed that Pythium species were clustered according to the morphology of the sporangia, thus, P. helicodes and P. chamaihyphon, that have globose sporangia were grouped in the same clade, while P. catenulatum, P. myriotylum and P. graminicola species, with filamentous sporangia, remained in a separate clade. All Phytophthora species were included in the clade 9, according to the sequences of the ITS region, that includes several species found in aquatic environments. In the pathogenicity tests, only the strain of P. helicoides was proven pathogenic, causing rotting of fruits in every replications on the second day after inoculation. Isolates of Phytophthora not show pathogenic to tomato fruits. The results observed for the remaining isolates were less conclusive due to a big difference between the experiments conducted at different times. Thus, it was possible to recover plant pathogens species of water sources of irrigation by using leaves, being the tomato leaves presented to be effective baits for the two genera tested.

O aumento da resistência microbiana devido a fatores como uso excessivo e ineficiente de antibióticos convencionais acarreta a necessidade da busca por novos compostos bioativos que atuem por mecanismos de ação diferentes aos fármacos já conhecidos. Na agricultura, o uso intensivo de pesticidas para o combate de microrganismos que comprometem principalmente a parte alimentícia também traz diversos problemas relacionados à resistência antimicrobiana e a riscos ambientais, oriundos do acúmulo dessas substâncias no solo. Dentro deste aspecto, o pseudofungo Pythium aphanidermatum, da classe dos oomicetos, destaca-se por ser uma espécie agressiva e altamente resistente a fungicidas comuns, apodrecendo raízes e frutos de cultivos de tomate, beterraba, pepino, pimentão, etc. A própolis verde, constituída em sua grande parte por material resinoso coletado e processado pela abelha da espécie Apis mellifera tem sido utilizada na medicina tradicional devido ao seu amplo espectro de ações preventivas e tratamentos de doenças, possuindo propriedades anti-inflamatórias, antimicrobianas, anticancerígenas e antioxidantes, tornando-se um produto de grande interesse na busca de novos compostos bioativos. Dentro destes aspectos apresentados, neste trabalho investigamos a ação da própolis verde contra o fitopatógeno P. aphanidermatum e identificamos através da técnica de cromatografia e bioensaios que a Artepillin C (3,5-diprenil-4-ácido-hidroxicinâmico), majoritária na própolis verde, foi o principal composto nesta ação. Os efeitos terapêuticos desta molécula tem sido foco de muitos estudos, porém ainda não há evidência em sua interação com agregados anfifílicos que mimetizam membranas celulares. O caráter anfifílico do composto, elevado pela presença dos grupos prenilados ligados ao ácido cinâmico, favoreceram a sua inserção nas membranas modelo, principalmente em seu estado agregado. Estas conclusões puderam ser inferidas devido às alterações nas propriedades das bicamadas lipídicas na presença da Artepillin C, podendo causar, especificamente para o caso de fitopatógenos como o P. aphanidermatum, perdas funcionais das proteínas de membranas, liberação de eletrólitos intracelulares e desintegração citoplasmática dos micélios e esporos. Ainda, as diferentes composições lipídicas nas vesículas influenciam no modo de interação do composto e consequentes alterações em suas estruturas, principalmente na presença do colesterol, que auxilia na manutenção da permeabilidade da bicamada lipídica, que pode contribuir para a integridade do conteúdo citoplasmático da célula. / The increase in the microbial resistance due to the excessive and inefficient use of conventional antibiotics brings the necessity to search new bioactive compounds which play their mechanism of action differently from the known drugs. In the agriculture, the intensive use of pesticide for the combat of microorganisms which undermine mainly the food portion also brings several issues related to the antimicrobial resistance and environment risks, originated from the high amount of these substances on the soil. In this aspect, the fungus-like Pythium aphanidermatum microorganism, from class Oomycete, stands out for being an aggressive species and highly resistant to common fungicides, rotting roots and fruits of tomato, beet, cucumber, pepper, etc. Green propolis, constituted by resinous material collected and processed by bees of the species Apis mellifera, has been used in the traditional medicine due its wide spectrum of preventive actions and diseases treatments, promoting anti-inflammatory, antimicrobial, anticancer and antioxidant properties, becoming a product of interest for investigation in the research of new bioactive compounds. Under all the aspects showed so far, in this work we investigated the action of the green propolis against the phytopathogen P. aphanidermatum and identified through chromatography and bioassays that Artepillin C (3,5-diprenyl-4-hydroxycinnamic acid), majority in the green propolis, was the main compound in this action. The therapeutic effects of this molecule have been the focus of several studies, but, so far there is no evidence for its interaction with amphiphilic aggregates that mimic cell membranes. The amphiphilic character of the compound, enhanced by the presence of two prenylated groups bounded to the cinnamic acid, favors the insertion of the compound in the model membranes mainly in its aggregation state. These conclusions could be inferred due the alterations in the properties of the lipid bilayer in the presence of Artepillin C, that may cause, specifically in the case of phytopathogens like P. aphanidermatum, functional losses of membrane proteins, releasing of intracellular electrolytes and cytoplasmatic disintegration of mycelium and spores. Moreover, the difference of the lipid composition in the vesicles influence in the action of the compound and consequent alteration in their structures, mainly in the presence of cholesterol, that provides the maintenance of permeability of the lipid bilayer, contributing to the integrity of the cytoplasmic material of the cell.

Submitted by (lucia.rodrigues@ufrpe.br) on 2017-02-17T13:13:31Z No. of bitstreams: 1 Antonio Alves Pimenta Neto.pdf: 891078 bytes, checksum: 3c3c0666af1521e887fa16686d4d993c (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-17T13:13:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Antonio Alves Pimenta Neto.pdf: 891078 bytes, checksum: 3c3c0666af1521e887fa16686d4d993c (MD5) Previous issue date: 2012-02-29 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / This study aimed to evaluate the effectiveness of extracts and vegetable oils in controlling diseases of Solanaceae caused by Phytophthora nicotianae and its effects on the isolates of the pathogen. The effect of means and methods of cultivation in the sporulation of the pathogen was first studied to enable the inoculations and tests with oils and plant extracts. The first study was to evaluate the influence of various liquid and solid culture media, obtained from plant host tissues and/or indicated in the literature for the cultivation of Phytophthora spp, as well as different light regimes: constant dark (D), 12h alternating light (LD), and constant light (L) and the hydrogen potential in growth and sporulation of P. nicotianae. The mycelial growth was obtained at 10 and 15 days of culture, through the quantification of biomass. The development of the colonies in the agar media was monitored through daily measurement of radial growth. The spore (zoospores/mL) was obtained in different ways in the 10th and 15th day in a Neubauer chamber, and the data transformed to √ x +1. In the agar media, (D) showed the largest growth increases, however means differed in all light regimes, especially those of cassava, eggplant, tomato and vegetable juice (V8), the first two with the largest increases and the last two with the lowest. The light regimes did not significantly affect growth in liquid media with 10 days of incubation. In some ways the presence of light is inversely proportional to the vegetative growth, but was an essential factor for sporulation, since it showed the presence of zoospores only (L) and (LD), except for the V8 medium, where it obtained the highest sporulation in the absence of light (D). Strains, media, and the presence of agar, promoted statistical difference in the number of zoospores/mL in (L) and (LD). More acids culture media induced more sporulation of P. nicotianae and less mycelial growth. The second study was divided in "in vitro" and "in vivo” bioassays aiming to analyse the antifungal and biocontrole effect of vegetable oils and extracts of Syzygium aromaticum and Cymbopogon nardus on fruit and tomato and eggplant seedlings inoculated with P. nicotianae. It was found that the products inhibited the germination of the mycelial growth and zoospores obtained from S. aromaticum at 0,5 μL/ ml and 10% concentrations CAE and EO, respectively. Treatments with C. nardus EO and CAE at 1,0 μL/ ml and 20% respectively, delayed progression of disease in fruit and seedlings compared to inoculated control. It can be inferred that the products obtained from S. aromaticum and C. nardus, have the potential to reduce the attack of this pathogen on tomato and eggplant. / O presente trabalho teve como objetivo avaliar a eficiência de extratos e óleos vegetais no controle de doenças causadas por Phytophthora nicotianae em tomateiro e berinjela, bem como seus efeitos sobre os isolados do patógeno. A esporulação do patógeno foi inicialmente estudado para viabilizar as inoculações e os testes com os óleos e extratos vegetais. O primeiro estudo consistiu em avaliar a influência de diferentes meios de cultura líquidos e agarisados, obtidos de órgão vegetais de hospedeiros e/ou indicados na literatura para o cultivo de Phytophthora spp; além de diferentes regimes de luminosidade: ausência de luz (E), alternância luminosa de 12h (LE), e luz constante (L); e potencial hidrogeniônico no crescimento e esporulação de P. nicotianae. Nos meios agarisados, (E) proporcionou os maiores crescimentos, entretanto em todos os regimes de luz os meios se diferenciaram, destacando-se dos demais os de mandioca, berinjela, tomate, e suco de vegetais (V8), os dois primeiros com os maiores crescimentos e os dois últimos com os menores. Os regimes de luz não influenciaram significativamente o crescimento nos meios líquidos com 10 dias de incubação. Em alguns meios a presença de luz foi inversamente proporcional ao crescimento vegetativo, mas foi um fator essencial para a esporulação, pois se verificou a presença de zoósporos somente em (L) e (LE), a exceção do meio V8, no qual se obteve a mais alta esporulação na ausência de luz (E). Em (L) e (LE), os isolados, meios e a presença ou não de ágar, promoveram diferenças estatísticas quanto ao número de zoósporos/mL. Verificou-se que meios mais ácidos proporcionam um menor crescimento, mas uma maior esporulação para P. nicotianae. O segundo estudo foi dividido em bioensaios “in vitro” e “in vivo”, analisado o efeito fungitóxico e biocontrolador de óleos e extratos vegetais de Syzygium aromaticum e Cymbopogon nardus em frutos e plântulas de tomateiro e berinjela inoculados com P. nicotianae. Constatou-se que os produtos que mais inibiram o crescimento micelial e a germinação dos zoósporos, foram obtidos de S. aromaticum, a partir das concentrações de 0,5 μL/mL e 10% do OE e EBA, respectivamente. Enquanto que o tratamento que mais retardou a evolução da doença em frutos e plântulas quando comparado com a testemunha inoculada, foi o OE e EBA de C. nardus nas concentrações de 1,0 μL/mL e 20%, respectivamente. Com isso podemos inferir que os produtos obtidos de S. aromaticum e C. nardus, têm potencial para reduzir o ataque deste patógeno em plantas de tomate e berinjela.

O aumento da resistência microbiana devido a fatores como uso excessivo e ineficiente de antibióticos convencionais acarreta a necessidade da busca por novos compostos bioativos que atuem por mecanismos de ação diferentes aos fármacos já conhecidos. Na agricultura, o uso intensivo de pesticidas para o combate de microrganismos que comprometem principalmente a parte alimentícia também traz diversos problemas relacionados à resistência antimicrobiana e a riscos ambientais, oriundos do acúmulo dessas substâncias no solo. Dentro deste aspecto, o pseudofungo Pythium aphanidermatum, da classe dos oomicetos, destaca-se por ser uma espécie agressiva e altamente resistente a fungicidas comuns, apodrecendo raízes e frutos de cultivos de tomate, beterraba, pepino, pimentão, etc. A própolis verde, constituída em sua grande parte por material resinoso coletado e processado pela abelha da espécie Apis mellifera tem sido utilizada na medicina tradicional devido ao seu amplo espectro de ações preventivas e tratamentos de doenças, possuindo propriedades anti-inflamatórias, antimicrobianas, anticancerígenas e antioxidantes, tornando-se um produto de grande interesse na busca de novos compostos bioativos. Dentro destes aspectos apresentados, neste trabalho investigamos a ação da própolis verde contra o fitopatógeno P. aphanidermatum e identificamos através da técnica de cromatografia e bioensaios que a Artepillin C (3,5-diprenil-4-ácido-hidroxicinâmico), majoritária na própolis verde, foi o principal composto nesta ação. Os efeitos terapêuticos desta molécula tem sido foco de muitos estudos, porém ainda não há evidência em sua interação com agregados anfifílicos que mimetizam membranas celulares. O caráter anfifílico do composto, elevado pela presença dos grupos prenilados ligados ao ácido cinâmico, favoreceram a sua inserção nas membranas modelo, principalmente em seu estado agregado. Estas conclusões puderam ser inferidas devido às alterações nas propriedades das bicamadas lipídicas na presença da Artepillin C, podendo causar, especificamente para o caso de fitopatógenos como o P. aphanidermatum, perdas funcionais das proteínas de membranas, liberação de eletrólitos intracelulares e desintegração citoplasmática dos micélios e esporos. Ainda, as diferentes composições lipídicas nas vesículas influenciam no modo de interação do composto e consequentes alterações em suas estruturas, principalmente na presença do colesterol, que auxilia na manutenção da permeabilidade da bicamada lipídica, que pode contribuir para a integridade do conteúdo citoplasmático da célula. / The increase in the microbial resistance due to the excessive and inefficient use of conventional antibiotics brings the necessity to search new bioactive compounds which play their mechanism of action differently from the known drugs. In the agriculture, the intensive use of pesticide for the combat of microorganisms which undermine mainly the food portion also brings several issues related to the antimicrobial resistance and environment risks, originated from the high amount of these substances on the soil. In this aspect, the fungus-like Pythium aphanidermatum microorganism, from class Oomycete, stands out for being an aggressive species and highly resistant to common fungicides, rotting roots and fruits of tomato, beet, cucumber, pepper, etc. Green propolis, constituted by resinous material collected and processed by bees of the species Apis mellifera, has been used in the traditional medicine due its wide spectrum of preventive actions and diseases treatments, promoting anti-inflammatory, antimicrobial, anticancer and antioxidant properties, becoming a product of interest for investigation in the research of new bioactive compounds. Under all the aspects showed so far, in this work we investigated the action of the green propolis against the phytopathogen P. aphanidermatum and identified through chromatography and bioassays that Artepillin C (3,5-diprenyl-4-hydroxycinnamic acid), majority in the green propolis, was the main compound in this action. The therapeutic effects of this molecule have been the focus of several studies, but, so far there is no evidence for its interaction with amphiphilic aggregates that mimic cell membranes. The amphiphilic character of the compound, enhanced by the presence of two prenylated groups bounded to the cinnamic acid, favors the insertion of the compound in the model membranes mainly in its aggregation state. These conclusions could be inferred due the alterations in the properties of the lipid bilayer in the presence of Artepillin C, that may cause, specifically in the case of phytopathogens like P. aphanidermatum, functional losses of membrane proteins, releasing of intracellular electrolytes and cytoplasmatic disintegration of mycelium and spores. Moreover, the difference of the lipid composition in the vesicles influence in the action of the compound and consequent alteration in their structures, mainly in the presence of cholesterol, that provides the maintenance of permeability of the lipid bilayer, contributing to the integrity of the cytoplasmic material of the cell.