Vitales Knochengewebe ist ständigen Umbauprozessen unterworfen. Entsteht ein Defekt, wird der Knochen durch neugeformte Strukturen repariert. In diesen Prozess sind verschiedene Zelltypen involviert, darunter Osteoblasten, Osteozyten und Osteoklasten (Teitelbaum, 2000a; Ross und Christiano, 2006; Zhang et al., 2012). In der Wiederherstellungs-Chirurgie ist Knochenersatz von großer Bedeutung, wenn schwere skelettale Schäden auftreten (Onoda et al., 2011). Auto- als auch Allotransplantationen von Knochengeweben sind aufgrund der guten osteoinduktiven und biochemischen Eigenschaften noch immer der Goldstandard (Parikh, 2002; Sen und Miclau, 2007; Zhang et al., 2012). Aufgrund der Knappheit der zur Verfügung stehenden muskuloskelettalen Spendermaterialien und der zugleich steigenden Anzahl von notwendigen Knochenmaterialtransplantationen wird vermehrt nach Materialersatz gesucht. Der ideale Knochentransplantatersatz ist biokompatibel, bioresorbierbar, dirigiert die Richtung der Knochenneubildung (osteokonduktiv), regt die Knochenneubildung an (osteoinduktiv), ist strukturell knochenähnlich, einfach anzuwenden und kosteneffektiv (Greenwald et al., 2001; Parikh, 2002; Chim und Schantz, 2005; Zhang et al., 2012). Tissue Engineering ist ein interdisziplinäres Gebiet der Wissenschaft, welches die Prinzipien des Ingenieurwesens und der Biowissenschaften auf die Entwicklung biologischer Ersatzmaterialien anwendet, die für die Wiederherstellung, Erhaltung oder Verbesserung von Gewebe- oder Organfunktionen eingesetzt werden (Langer, 1993; Nerem und Sambanis, 1995). Langfristig sollen für die Implantation geeignete Systeme entwickelt oder in vivo Geweberemodelling ermöglicht werden. Hauptkomponente des Tissue Engineering ist der Einsatz lebender Zellen und/oder extrazellulärer Matrixbestandteile in der Entwicklung solcher Systeme und Konstrukte, die implantiert zur Wiederherstellung oder zum Ersatz der biologischen Funktionen führen. Um das biologische Verhalten der Konstrukte kontrollieren zu können, erfordert die Entwicklung das Verständnis der Struktur-Funktions-Beziehung von Zellen, Geweben und Organen. Die extrazelluläre Matrix der biologischen Systeme ist ebenfalls von großer Bedeutung, da sie ihre mechanischen Eigenschaften bestimmt. Chemische und strukturelle Stabilität sind weitere notwendige Eigenschaften, um das Überleben der Zellen nach der Implantation in der in vivo Umgebung zu gewährleisten (Nerem und Sambanis, 1995). Denkansätze im Tissue Engineering beinhalten die Nutzung von Scaffolds, Zellen und deren Kombination. Häufigster Ansatz ist der Einsatz resorbierbarer oder biologisch abbaubarer Scaffolds, die an die Umgebung des lebenden Gewebes angepasst sind und mit lebenden Zellen besiedelt werden können. Die Zellen proliferieren und organisieren sich in der dreidimensionalen Struktur des Scaffolds und beginnen mit der Produktion adäquater extrazellulärer Matrix. Während der Formierung, Ablagerung und Organisation der neu generierten Matrix wird die Startmatrix des Scaffolds abgebaut, resorbiert und metabolisiert (Nerem und Sambanis, 1995; Stock und Vacanti, 2001). Die Zellen differenzieren sich auf dem Scaffold zu den gewünschten Organ- beziehungsweise Gewebezellen bevor die in vitro besiedelten Matrizen implantiert werden. Am Ende des Prozesses ist ein lebendes Gewebe oder Organ entstanden, welches die Funktion des Gewebes / Organs im Körper erhält, wieder herstellt oder verbessert. Das Risiko immunologischer Abwehrreaktionen, ebenso wie das Risiko viraler Infektionen wird beim Tissue Engineering durch den Einsatz autologer Spenderzellen umgangen. Die eingesetzten Scaffolds müssen zudem biokompatibel sein und den nutritiven als auch biologischen Ansprüchen der spezifischen Zellpopulation gerecht werden, die in der Gewebeformation involviert ist (Stock und Vacanti, 2001). Ein weiterer Ansatz ist es, Zellen von biologischer Matrix enzymatisch oder durch Detergenzien zu entfernen und diese dezellularisierte Matrix anschließend zu verwenden. Es handelt sich dabei um allogenes oder xenogenes Gewebe. Diese Matrix ist dann theoretisch biologisch abbaubar beziehungsweise resorbierbar und müsste sich gut für die Besiedlung mit Zellen eignen. Alternativ werden artifizielle Matrizen im Tissue Engineering eingesetzt (Stock und Vacanti, 2001; Heinemann et al., 2011). In Abbildung 1.1 ist das Prinzip des Tissue Engineering dargestellt (Drosse et al., 2008). Bei der Therapie von Knochendefekten in lasttragenden Regionen werden häufig nichtresorbierbare Materialien wie Metalle und Keramiken eingesetzt (Navarro et al., 2008). Der Einsatz von resorbierbaren Materialien ist erstrebenswert, da sich diese nach der Transplantation in den Prozess des Knochenremodellings integrieren und somit mit der Zeit durch körpereigenes Material ersetzt werden (Hutmacher, 2000; Boccaccini und Maquet, 2003; Navarro et al., 2008). Damit erlangt der Knochen langsam seine natürlichen biomechanischen Eigenschaften zurück (Baron, 1995; Teitelbaum, 2000b). Wichtig ist jedoch, dass die Resorption und der Ersatz durch körpereigenes Knochenmaterial ausgewogen stattfinden, sodass die mechanische Stabilität des Gewebes gewährleistet ist. Daher sind Untersuchungen zur Resorption von Biomaterialien von großer Bedeutung, bevor diese in der Klinik in vivo zum Einsatz kommen (Zhang et al., 2012). Osteoklasten sind für die Resorption von Knochen verantwortliche Zellen, weshalb sie in Zellexperimenten zur Untersuchung von Resorption eingesetzt werden. Typische Untersuchungsmethoden zum Nachweis von osteoklastärer Aktivität sind die Feststellung von Vielkernigkeit, die genanalytische Bestimmung von tartratresistenter saurer Phosphatase 5b (TRAP 5b) (Minkin, 1982; Ek-Rylander et al., 1991; Ljusberg et al., 2005; Detsch et al., 2010b), Carboanhydrase II (CAII) (Lehenkari et al., 1998; Detsch et al., 2010b; Schilling et al., 2004), Kathepsin K (Bossard et al., 1996; Littlewood-Evans et al., 1997; Votta et al., 1997; Söderström et al., 1999; Dodds et al., 2001; Ljusberg et al., 2005), des Kalzitoninrezeptors und des Vitronektinrezeptors (Detsch und Boccaccini, 2014; Blair, 1998; Schilling et al., 2004). Die enzymatische Messung von TRAP 5b (Halleen et al., 2000; Janckila et al., 2001) und CAII (Detsch et al., 2010a) und die Bestimmung der Kalziumkonzentration im Überstand der Zellkulturen (Neutzsky-Wulff et al., 2010; Reichert et al., 2013) sind weitere Marker, die zur Beschreibung osteoklastärer Zelldifferenzierung genannt wurden. Zudem können Kollagenspaltprodukte im Zellkulturüberstand nachgewiesen werden (Karsdal et al., 2003; Neutzsky-Wulff et al., 2010). Eine weitere große Rolle bei Resorptionsuntersuchungen an Biomaterialien spielt die Analyse von Resorptionspits. Allerdings gibt es hierbei einige Nachteile. Die mikroskopische Beurteilung der Resorptionslakunen ist sehr zeitaufwändig und kostenintensiv. Zudem ist eine sehr geringe Rauigkeit des eingesetzten Materials nötig, um die Resorption mikroskopisch anhand von Resorptionslakunen zu quantifizieren, da die Messmethoden die resorbierte Fläche und das resorbierte Volumen relativ zur originalen Oberflächenbeschaffenheit ermitteln. Ideal ist hierbei eine Rauigkeit von unter 1 m (Zhang et al., 2012) damit zwischen bereits vorher existierenden strukturellen Unebenheiten und neu entstandenen Pits unterschieden werden kann. Zudem können bisher bekannte Resorptionsassays nur die Resorption auf glatten Knochenstrukturen imitieren. Im Körper machen hingegen der trabekuläre oder spongiöse Knochen den größten Anteil aus, allerdings sind solche Strukturen in vitro schwer zu imitieren und Resorptionsstudien dazu sind noch nicht sehr zuverlässig (Zhang et al., 2012). Auf unregelmäßigen oder porösen Materialien können bisher noch keine quantifizierenden Aussagen über die Resorption gemacht werden. Die Motivation dieser Arbeit war es, biochemische Verfahren für die Quantifizierung von osteoklastärer Resorption zu entwickeln. Während die biochemischen Messungen der Aktivitäten von TRAP 5b und CAII bereits als osteoklastäre Marker eingesetzt werden, sollte hier erstmals die enzymatische Aktivität von Kathepsin K biochemisch bestimmt werden. Dazu wurden Osteoklasten auf verschiedenen Materialien kultiviert und untersucht. Durch biochemische Analyse sollten dann Rückschlüsse auf die Resorptionsaktivität der Zellen gezogen werden. Das Fernziel dieser Arbeit ist, das Resorptionsverhalten von Osteoklasten auf Biomaterialien zu quantifizieren, sodass die zeit- und kostenintensive mikroskopische Beurteilung ersetzt werden kann. Ein Schritt auf dem Weg zu diesem Ziel ist es, die Osteoklastogenese auf den Modellsubstraten genauer zu untersuchen und herauszufinden, wie die in vitro Resorption auf den verschiedenen Substraten beeinflusst werden kann. Die gemessenen Enzymaktivitäten sollten schließlich mit der Resorptionsaktivität der Osteoklasten in Korrelation gebracht werden.

Osteoporosis, a classical age-related disease and known to be more common in women than in men, has been reported increasingly often in men during the past few years. Although men at all ages after puberty have larger bones than women, resulting in greater bending strength, mortality after a hip fracture, one of the major complications of osteoporosis, is more common in men than in women. Sex hormone deficiency is associated with unrestrained osteoclast activity and bone loss. Even though estrogen deficiency is more pronounced in women, it appears to be a major factor in the pathogenesis of osteoporosis in both genders. In contrast to osteoporosis in postmenopausal women, the treatment of osteoporosis in men has been scarcely reported. Nevertheless, some drugs commonly used for the treatment of osteoporosis in women also appear to be effective in men. The aim of this study is to review primary osteoporosis in the elderly with particular emphasis on gender-related aspects. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.

The study of regeneration has inspired centuries of scientific research. Among the many model organisms used in present days, the axolotl has become the gold standard for studying limb regeneration in vertebrates. Limb regeneration is an intricated multi-step process that involves timely regulated events such as an immune response, dedifferentiation and migration of progenitor cells, and the re-establishment of the missing structures. Although axolotl limb regeneration has long been considered a case of perfect regeneration, the mechanisms whereby a regenerated limb is able to properly integrate into the mature tissue seamlessly have long been unstudied. In this work, I have investigated how the skeletal tissue is primed to successfully regenerate and restore its functionality. To properly achieve my research, I have first sought to understand the basic appendicular skeleton biology, particularly, how the skeletal elements change with growth and age. In the first part of my thesis, I show the changes associated with growth in the zeugopodial elements, radius and ulna. A cartilaginous skeleton defines the limb during the early life stages, and ossification starts around the time the animals reach sexual maturity, a process that extends throughout their lives. In the second part of my work, I have extensively described a regeneration-induced skeletal resorption. This process is carried out by osteoclasts and it is absolutely necessary for a successful integration of the skeletal tissue. Interestingly, a direct correlation between the resorption rate and the integration efficiency could be observed. Moreover, my work provides strong evidence linking the formation of the wound epithelium with the induction of skeletal resorption and the position of resorption with blastema formation. Altogether, this work provides a comprehensive study of axolotl skeleton biology in homeostasis and regeneration, with an emphasis on how a histolytic process primes the skeletal tissue for efficient regeneration. From a comparative perspective, the understanding of the events involved in axolotl limb regeneration provides an excellent platform for evaluating how regeneration could be enhanced in non-regenerative animals, such as humans.

BACKGROUND: Bone remodeling relies on the tightly regulated interplay between bone forming osteoblasts and bone digesting osteoclasts. Several studies have now described the molecular mechanisms by which osteoblasts control osteoclastogenesis and bone degradation. It is currently unclear whether osteoclasts can influence bone rebuilding. METHODOLOGY/PRINCIPAL FINDINGS: Using in vitro cell systems, we show here that mature osteoclasts, but not their precursors, secrete chemotactic factors recognized by both mature osteoblasts and their precursors. Several growth factors whose expression is upregulated during osteoclastogenesis were identified by DNA microarrays as candidates mediating osteoblast chemotaxis. Our subsequent functional analyses demonstrate that mature osteoclasts, whose platelet-derived growth factor bb (PDGF-bb) expression is reduced by siRNAs, exhibit a reduced capability of attracting osteoblasts. Conversely, osteoblasts whose platelet-derived growth factor receptor beta (PDGFR-beta) expression is reduced by siRNAs exhibit a lower capability of responding to chemotactic factors secreted by osteoclasts. CONCLUSIONS/SIGNIFICANCE: We conclude that, in vitro mature osteoclasts control osteoblast chemotaxis via PDGF-bb/PDGFR-beta signaling. This may provide one key mechanism by which osteoclasts control bone formation in vivo.

Das RANKL/RANK/OPG-System spielt eine entscheidende Rolle in der Steuerung der Osteoklastendifferenzierung und -aktivierung durch Osteoblasten/ Knochenmarkbindegewebszellen im Rahmen des Knochenremodelings. Osteoblasten/Knochenmarkbindegewebszellen exprimieren RANKL. Dieses hat im Körper zwei Rezeptoren: RANK und OPG. RANKL kann durch Bindung an RANK auf Osteoklasten/Osteoklastenvorläuferzellen in Gegenwart von M-CSF seine osteoklastenstimulierende Wirkung entfalten. Der ebenfalls von Osteoblasten gebildete „decoy“-Rezeptor OPG blockiert als freies Protein durch Bindung an RANKL dessen Interaktion mit RANK und verhindert somit die Osteoklastogenese und Osteoklastenaktivierung. Das RANKL/RANK/OPG-System erfüllt im Körper noch weitere Funktionen im Immunsystem, in der Organentwicklung lymphatischer Gewebe und in der Entwicklung der laktierenden Brustdrüse. Viele Zytokine greifen hemmend oder aktivierend in die Osteoklastogenese ein. Sie können dies zum einen durch die Beeinflussung des RANKL/OPG-Verhältnisses, zum anderen durch direkte Interaktion mit Osteoklasten/Osteoklastenvorläuferzellen tun. Zytokine, die die Osteoklastogenese begünstigen, werden vor allem bei inflammatorischen Prozessen ausgeschüttet. Zusammen mit dem, bei diesen Zuständen von aktivierten T-Zellen produzierten RANKL kann dies längerfristig zu einem Knochenverlust führen, welcher sich im klinischen Bild der Osteoporose äußert. Aus den in der vorliegenden Dissertation durchgeführten Untersuchungen ergeben sich folgende Schlussfolgerungen: 1. Monozyten der Zelllinie RAW 264.7 lassen sich, wie bereits in der Literatur beschrieben, durch Zugabe von M-CSF und RANKL zu osteoklastenähnlichen Zellen differenzieren. 2. Die Osteoklastogenese lässt sich anhand der Veränderung verschiedener osteoklastenspezifischer Parameter charakterisieren. Es zeigt sich bei den mit M-CSF und RANKL stimulierten Monozyten eine erhöhte Transkription von CTR (Calcitoninrezeptor)- und TRAP (tartratresistente saure Phosphatase)-mRNA, eine erhöhte Expression des CTR-Proteins, eine erhöhte TRAP-Aktivität und eine Formierung TRAP-positiver mehrkerniger Riesenzellen, die in diesen Eigenschaften Osteoklasten entsprechen. Die zusätzliche Zugabe von TGF-b1 in Kombination mit M-CSF und RANKL resultiert in einer verstärkten Expression von CTR-mRNA und CTR-Protein. TRAP-mRNA-Expression und TRAP-Aktivität bleiben davon unbeeinflusst. 3. Als funktionelles Merkmal der in vitro differenzierten Osteoklasten können ihre Fähigkeit zur Ausbildung von Aktinringen und die Resorption von mineralisiertem Kollagen nachgewiesen werden. 4. Im Verlauf ihrer Differenzierung sekretieren Osteoblasten unterschiedliche Mengen an OPG. Das Maximum der Synthese liegt bei Tag 11. Freies RANKL lässt sich in Überständen von MC3T3-E1-Osteoblasten nicht nachweisen. 5. Das von Osteoblasten in das Medium abgegebene OPG ist in der Lage, die durch RANKL induzierte Osteoklastogenese von RAW-Monozyten zu hemmen. 6. In Kokulturen von MC3T3-E1-Osteoblasten und RAW-Monozyten kann keine Osteoklastogenese beobachtet werden, wahrscheinlich durch Fehlen der RANKLExprimierung oder zu starke OPG-Sekretion durch Osteoblasten. Besonders in der westlichen Welt mit ihrer hohen Lebenserwartung haben Krankheiten mit Knochenverlust sowie bösartige Neubildungen mit Knochenbefall eine große medizinische Bedeutung. Die Beeinflussung des RANKL/RANK/OPG-Systems bietet eine vielversprechende Möglichkeit zur Entwicklung hochwirksamer und nebenwirkungsarmer Medikamente zur Behandlung dieser Zustände.

Biologically active metal ions in low doses have the potential to accelerate bone defect healing. For successful remodelling the interaction of bone graft materials with both bone-forming osteoblasts and bone resorbing osteoclasts is crucial. In the present study brushite forming calcium phosphate cements (CPC) were doped with Co2+, Cu2+ and Cr3+ and the influence of these materials on osteoclast differentiation and activity was examined. Human osteoclasts were differentiated from human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) both on the surface and in indirect contact to the materials on dentin discs. Release of calcium, phosphate and bioactive metal ions was determined using ICP-MS both in the presence and absence of the cells. While Co2+ and Cu2+ showed a burst release, Cr3+ was released steadily at very low concentrations (below 1 μM) and both calcium and phosphate release of the cements was considerably changed in the Cr3+ modified samples. Direct cultivation of PBMC/osteoclasts on Co2+ cements showed lower attached cell number compared to the reference but high activity of osteoclast specific enzymes tartrate resistant acid phosphatase (TRAP), carbonic anhydrase II (CAII) and cathepsin K (CTSK) and significantly increased gene expression of vitronectin receptor. Indirect cultivation with diluted Co2+ cement extracts revealed highest resorbed area compared to all other modifications and the reference. Cu2+ cements had cytotoxic effect on PBMC/osteoclasts during direct cultivation, while indirect cultivation with diluted extracts from Cu2+ cements did not provoke cytotoxic effects but a strictly inhibited resorption. Cr3+ doped cements did not show cytotoxic effects at all. Gene expression and enzyme activity of CTSK was significantly increased in direct culture. Indirect cultivation with Cr3+ doped cements revealed significantly higher resorbed area compared to the reference. In conclusion Cr3+ doped calcium phosphate cements are an innovative cement modification because of their high cytocompatibility and support of active resorption by osteoclasts.

BACKGROUND: Bone remodeling relies on the tightly regulated interplay between bone forming osteoblasts and bone digesting osteoclasts. Several studies have now described the molecular mechanisms by which osteoblasts control osteoclastogenesis and bone degradation. It is currently unclear whether osteoclasts can influence bone rebuilding. METHODOLOGY/PRINCIPAL FINDINGS: Using in vitro cell systems, we show here that mature osteoclasts, but not their precursors, secrete chemotactic factors recognized by both mature osteoblasts and their precursors. Several growth factors whose expression is upregulated during osteoclastogenesis were identified by DNA microarrays as candidates mediating osteoblast chemotaxis. Our subsequent functional analyses demonstrate that mature osteoclasts, whose platelet-derived growth factor bb (PDGF-bb) expression is reduced by siRNAs, exhibit a reduced capability of attracting osteoblasts. Conversely, osteoblasts whose platelet-derived growth factor receptor beta (PDGFR-beta) expression is reduced by siRNAs exhibit a lower capability of responding to chemotactic factors secreted by osteoclasts. CONCLUSIONS/SIGNIFICANCE: We conclude that, in vitro mature osteoclasts control osteoblast chemotaxis via PDGF-bb/PDGFR-beta signaling. This may provide one key mechanism by which osteoclasts control bone formation in vivo.

Biologically active metal ions in low doses have the potential to accelerate bone defect healing. For successful remodelling the interaction of bone graft materials with both bone-forming osteoblasts and bone resorbing osteoclasts is crucial. In the present study brushite forming calcium phosphate cements (CPC) were doped with Co2+, Cu2+ and Cr3+ and the influence of these materials on osteoclast differentiation and activity was examined. Human osteoclasts were differentiated from human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) both on the surface and in indirect contact to the materials on dentin discs. Release of calcium, phosphate and bioactive metal ions was determined using ICP-MS both in the presence and absence of the cells. While Co2+ and Cu2+ showed a burst release, Cr3+ was released steadily at very low concentrations (below 1 μM) and both calcium and phosphate release of the cements was considerably changed in the Cr3+ modified samples. Direct cultivation of PBMC/osteoclasts on Co2+ cements showed lower attached cell number compared to the reference but high activity of osteoclast specific enzymes tartrate resistant acid phosphatase (TRAP), carbonic anhydrase II (CAII) and cathepsin K (CTSK) and significantly increased gene expression of vitronectin receptor. Indirect cultivation with diluted Co2+ cement extracts revealed highest resorbed area compared to all other modifications and the reference. Cu2+ cements had cytotoxic effect on PBMC/osteoclasts during direct cultivation, while indirect cultivation with diluted extracts from Cu2+ cements did not provoke cytotoxic effects but a strictly inhibited resorption. Cr3+ doped cements did not show cytotoxic effects at all. Gene expression and enzyme activity of CTSK was significantly increased in direct culture. Indirect cultivation with Cr3+ doped cements revealed significantly higher resorbed area compared to the reference. In conclusion Cr3+ doped calcium phosphate cements are an innovative cement modification because of their high cytocompatibility and support of active resorption by osteoclasts.

Osteoporosis, a classical age-related disease and known to be more common in women than in men, has been reported increasingly often in men during the past few years. Although men at all ages after puberty have larger bones than women, resulting in greater bending strength, mortality after a hip fracture, one of the major complications of osteoporosis, is more common in men than in women. Sex hormone deficiency is associated with unrestrained osteoclast activity and bone loss. Even though estrogen deficiency is more pronounced in women, it appears to be a major factor in the pathogenesis of osteoporosis in both genders. In contrast to osteoporosis in postmenopausal women, the treatment of osteoporosis in men has been scarcely reported. Nevertheless, some drugs commonly used for the treatment of osteoporosis in women also appear to be effective in men. The aim of this study is to review primary osteoporosis in the elderly with particular emphasis on gender-related aspects. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.

Vitales Knochengewebe ist ständigen Umbauprozessen unterworfen. Entsteht ein Defekt, wird der Knochen durch neugeformte Strukturen repariert. In diesen Prozess sind verschiedene Zelltypen involviert, darunter Osteoblasten, Osteozyten und Osteoklasten (Teitelbaum, 2000a; Ross und Christiano, 2006; Zhang et al., 2012). In der Wiederherstellungs-Chirurgie ist Knochenersatz von großer Bedeutung, wenn schwere skelettale Schäden auftreten (Onoda et al., 2011). Auto- als auch Allotransplantationen von Knochengeweben sind aufgrund der guten osteoinduktiven und biochemischen Eigenschaften noch immer der Goldstandard (Parikh, 2002; Sen und Miclau, 2007; Zhang et al., 2012). Aufgrund der Knappheit der zur Verfügung stehenden muskuloskelettalen Spendermaterialien und der zugleich steigenden Anzahl von notwendigen Knochenmaterialtransplantationen wird vermehrt nach Materialersatz gesucht. Der ideale Knochentransplantatersatz ist biokompatibel, bioresorbierbar, dirigiert die Richtung der Knochenneubildung (osteokonduktiv), regt die Knochenneubildung an (osteoinduktiv), ist strukturell knochenähnlich, einfach anzuwenden und kosteneffektiv (Greenwald et al., 2001; Parikh, 2002; Chim und Schantz, 2005; Zhang et al., 2012). Tissue Engineering ist ein interdisziplinäres Gebiet der Wissenschaft, welches die Prinzipien des Ingenieurwesens und der Biowissenschaften auf die Entwicklung biologischer Ersatzmaterialien anwendet, die für die Wiederherstellung, Erhaltung oder Verbesserung von Gewebe- oder Organfunktionen eingesetzt werden (Langer, 1993; Nerem und Sambanis, 1995). Langfristig sollen für die Implantation geeignete Systeme entwickelt oder in vivo Geweberemodelling ermöglicht werden. Hauptkomponente des Tissue Engineering ist der Einsatz lebender Zellen und/oder extrazellulärer Matrixbestandteile in der Entwicklung solcher Systeme und Konstrukte, die implantiert zur Wiederherstellung oder zum Ersatz der biologischen Funktionen führen. Um das biologische Verhalten der Konstrukte kontrollieren zu können, erfordert die Entwicklung das Verständnis der Struktur-Funktions-Beziehung von Zellen, Geweben und Organen. Die extrazelluläre Matrix der biologischen Systeme ist ebenfalls von großer Bedeutung, da sie ihre mechanischen Eigenschaften bestimmt. Chemische und strukturelle Stabilität sind weitere notwendige Eigenschaften, um das Überleben der Zellen nach der Implantation in der in vivo Umgebung zu gewährleisten (Nerem und Sambanis, 1995). Denkansätze im Tissue Engineering beinhalten die Nutzung von Scaffolds, Zellen und deren Kombination. Häufigster Ansatz ist der Einsatz resorbierbarer oder biologisch abbaubarer Scaffolds, die an die Umgebung des lebenden Gewebes angepasst sind und mit lebenden Zellen besiedelt werden können. Die Zellen proliferieren und organisieren sich in der dreidimensionalen Struktur des Scaffolds und beginnen mit der Produktion adäquater extrazellulärer Matrix. Während der Formierung, Ablagerung und Organisation der neu generierten Matrix wird die Startmatrix des Scaffolds abgebaut, resorbiert und metabolisiert (Nerem und Sambanis, 1995; Stock und Vacanti, 2001). Die Zellen differenzieren sich auf dem Scaffold zu den gewünschten Organ- beziehungsweise Gewebezellen bevor die in vitro besiedelten Matrizen implantiert werden. Am Ende des Prozesses ist ein lebendes Gewebe oder Organ entstanden, welches die Funktion des Gewebes / Organs im Körper erhält, wieder herstellt oder verbessert. Das Risiko immunologischer Abwehrreaktionen, ebenso wie das Risiko viraler Infektionen wird beim Tissue Engineering durch den Einsatz autologer Spenderzellen umgangen. Die eingesetzten Scaffolds müssen zudem biokompatibel sein und den nutritiven als auch biologischen Ansprüchen der spezifischen Zellpopulation gerecht werden, die in der Gewebeformation involviert ist (Stock und Vacanti, 2001). Ein weiterer Ansatz ist es, Zellen von biologischer Matrix enzymatisch oder durch Detergenzien zu entfernen und diese dezellularisierte Matrix anschließend zu verwenden. Es handelt sich dabei um allogenes oder xenogenes Gewebe. Diese Matrix ist dann theoretisch biologisch abbaubar beziehungsweise resorbierbar und müsste sich gut für die Besiedlung mit Zellen eignen. Alternativ werden artifizielle Matrizen im Tissue Engineering eingesetzt (Stock und Vacanti, 2001; Heinemann et al., 2011). In Abbildung 1.1 ist das Prinzip des Tissue Engineering dargestellt (Drosse et al., 2008). Bei der Therapie von Knochendefekten in lasttragenden Regionen werden häufig nichtresorbierbare Materialien wie Metalle und Keramiken eingesetzt (Navarro et al., 2008). Der Einsatz von resorbierbaren Materialien ist erstrebenswert, da sich diese nach der Transplantation in den Prozess des Knochenremodellings integrieren und somit mit der Zeit durch körpereigenes Material ersetzt werden (Hutmacher, 2000; Boccaccini und Maquet, 2003; Navarro et al., 2008). Damit erlangt der Knochen langsam seine natürlichen biomechanischen Eigenschaften zurück (Baron, 1995; Teitelbaum, 2000b). Wichtig ist jedoch, dass die Resorption und der Ersatz durch körpereigenes Knochenmaterial ausgewogen stattfinden, sodass die mechanische Stabilität des Gewebes gewährleistet ist. Daher sind Untersuchungen zur Resorption von Biomaterialien von großer Bedeutung, bevor diese in der Klinik in vivo zum Einsatz kommen (Zhang et al., 2012). Osteoklasten sind für die Resorption von Knochen verantwortliche Zellen, weshalb sie in Zellexperimenten zur Untersuchung von Resorption eingesetzt werden. Typische Untersuchungsmethoden zum Nachweis von osteoklastärer Aktivität sind die Feststellung von Vielkernigkeit, die genanalytische Bestimmung von tartratresistenter saurer Phosphatase 5b (TRAP 5b) (Minkin, 1982; Ek-Rylander et al., 1991; Ljusberg et al., 2005; Detsch et al., 2010b), Carboanhydrase II (CAII) (Lehenkari et al., 1998; Detsch et al., 2010b; Schilling et al., 2004), Kathepsin K (Bossard et al., 1996; Littlewood-Evans et al., 1997; Votta et al., 1997; Söderström et al., 1999; Dodds et al., 2001; Ljusberg et al., 2005), des Kalzitoninrezeptors und des Vitronektinrezeptors (Detsch und Boccaccini, 2014; Blair, 1998; Schilling et al., 2004). Die enzymatische Messung von TRAP 5b (Halleen et al., 2000; Janckila et al., 2001) und CAII (Detsch et al., 2010a) und die Bestimmung der Kalziumkonzentration im Überstand der Zellkulturen (Neutzsky-Wulff et al., 2010; Reichert et al., 2013) sind weitere Marker, die zur Beschreibung osteoklastärer Zelldifferenzierung genannt wurden. Zudem können Kollagenspaltprodukte im Zellkulturüberstand nachgewiesen werden (Karsdal et al., 2003; Neutzsky-Wulff et al., 2010). Eine weitere große Rolle bei Resorptionsuntersuchungen an Biomaterialien spielt die Analyse von Resorptionspits. Allerdings gibt es hierbei einige Nachteile. Die mikroskopische Beurteilung der Resorptionslakunen ist sehr zeitaufwändig und kostenintensiv. Zudem ist eine sehr geringe Rauigkeit des eingesetzten Materials nötig, um die Resorption mikroskopisch anhand von Resorptionslakunen zu quantifizieren, da die Messmethoden die resorbierte Fläche und das resorbierte Volumen relativ zur originalen Oberflächenbeschaffenheit ermitteln. Ideal ist hierbei eine Rauigkeit von unter 1 m (Zhang et al., 2012) damit zwischen bereits vorher existierenden strukturellen Unebenheiten und neu entstandenen Pits unterschieden werden kann. Zudem können bisher bekannte Resorptionsassays nur die Resorption auf glatten Knochenstrukturen imitieren. Im Körper machen hingegen der trabekuläre oder spongiöse Knochen den größten Anteil aus, allerdings sind solche Strukturen in vitro schwer zu imitieren und Resorptionsstudien dazu sind noch nicht sehr zuverlässig (Zhang et al., 2012). Auf unregelmäßigen oder porösen Materialien können bisher noch keine quantifizierenden Aussagen über die Resorption gemacht werden. Die Motivation dieser Arbeit war es, biochemische Verfahren für die Quantifizierung von osteoklastärer Resorption zu entwickeln. Während die biochemischen Messungen der Aktivitäten von TRAP 5b und CAII bereits als osteoklastäre Marker eingesetzt werden, sollte hier erstmals die enzymatische Aktivität von Kathepsin K biochemisch bestimmt werden. Dazu wurden Osteoklasten auf verschiedenen Materialien kultiviert und untersucht. Durch biochemische Analyse sollten dann Rückschlüsse auf die Resorptionsaktivität der Zellen gezogen werden. Das Fernziel dieser Arbeit ist, das Resorptionsverhalten von Osteoklasten auf Biomaterialien zu quantifizieren, sodass die zeit- und kostenintensive mikroskopische Beurteilung ersetzt werden kann. Ein Schritt auf dem Weg zu diesem Ziel ist es, die Osteoklastogenese auf den Modellsubstraten genauer zu untersuchen und herauszufinden, wie die in vitro Resorption auf den verschiedenen Substraten beeinflusst werden kann. Die gemessenen Enzymaktivitäten sollten schließlich mit der Resorptionsaktivität der Osteoklasten in Korrelation gebracht werden.