Orientador: Paulo Tambasco de Oliveira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-26T15:44:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Teixeira_LucasNovaes_D.pdf: 3520593 bytes, checksum: e42a5497740bc09fe80b9a6a035947df (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: O carcinoma espinocelular (CEC) oral representa a neoplasia maligna mais prevalente das estruturas bucais, podendo invadir o tecido ósseo e promover sua reabsorção em até 56% dos casos. A expressão da proteína matricelular osteopontina (OPN) tem sido relacionada a uma maior agressividade de neoplasias malignas, incluindo o CEC oral. No tecido ósseo, a OPN representa a proteína mais abundante da matriz não colágena, concentrada nas interfaces ósseas, i.e. lâminas limitantes, linhas de cimentação e reversas, sendo essencial para adesão e funções de osteoblastos e osteoclastos. Apesar de no microambiente tumoral a OPN estar associada a um fenótipo neoplásico mais agressivo, ainda não está estabelecido o papel da OPN secretada por osteoblastos sobre células neoplásicas derivadas de CEC oral e o impacto sobre osteoclastos. O presente estudo teve como objetivos avaliar a expressão de OPN em sistemas de coculturas de células osteoblásticas e epiteliais neoplásicas malignas humanas e os efeitos da expressão de OPN secretada por osteoblastos sobre o fenótipo neoplásico in vitro. Adicionalmente, avaliou-se o efeito das coculturas sobre a atividade osteoclástica. Células epiteliais neoplásicas malignas derivadas de CEC oral (SCC9) foram plaqueadas sobre membranas de Transwell®, recobertas ou não por uma camada fina e uniforme de Matrigel, e cocultivadas com células osteoblásticas (SAOS-2) durante seu pico de expressão de OPN (10o dia de cultura). Células SCC9 expostas a culturas SAOS-2 silenciadas para OPN por RNA de interferência (RNAi) e células SCC9 cultivadas isoladamente foram usadas como controles. Após 24 h de cocultivo, células SCC9 foram avaliadas, quantitativamente, para adesão, proliferação, migração e invasão de Matrigel. A atividade de osteoclastos derivados de células monocíticas U-937 foi avaliada, quantitativamente, por meio dos ensaios de reabsorção de fosfato cálcio e de dosagem de citocinas em eluentes obtidos de células SCC9 e SAOS-2 após o cocultivo durante o pico de OPN ou com o seu silenciamento. A análise estatística foi realizada pelo teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis (p < 0,05). Os resultados indicaram indução recíproca na expressão de OPN em SAOS-2 e SCC9 em cocultura. A OPN secretada por células SAOS-2 afetou o fenótipo de culturas SCC9, promovendo a adesão e a proliferação celulares e a invasão de Matrigel, a qual também estava aumentada, mas em menor intensidade, com o silenciamento para OPN. A migração celular não foi afetada. O cocultivo com SAOS-2, principalmente durante o pico de OPN, resultou na sobre-expressão das citocinas IL 6 e IL 8 pelas células SCC9, aumentando a capacidade de células osteoclásticas em reabsorver fosfato de cálcio. Conjuntamente, esses resultados sugerem que a OPN derivada de osteoblastos afeta as interações entre células epiteliais neoplásicas malignas, osteoblastos e osteoclastos, possivelmente contribuindo para a progressão de lesões ósseas do CEC oral / Abstract: The oral squamous cell carcinoma (OSCC) is the most prevalent malignant neoplasm of the oral structures. It may invade bone in up to 56% of the cases and promote osteoclast-mediated bone extracellular matrix (ECM) resorption. Expression of the matricellular protein osteopontin (OPN) in malignant neoplasms, including OSCC, has been positively correlated with aggressive tumor behavior. OPN is the most abundant non collagenous ECM protein in bone, where it preferentially accumulates at interfaces, including cement lines, laminae limitantes and reversal lines, being essential for the adhesion and function of osteoblasts and osteoclasts. Despite the importance attributed to OPN in the tumor microenvironment, indicative of more aggressive neoplastic phenotypes, the effects of osteoblast-derived OPN on OSCC cells and on OSCC-induced osteoclast activity are still not fully understood. The present in vitro study aimed to evaluate temporal expression of OPN in cocultures of human osteoblastic cells and malignant neoplastic epithelial cells and the effects of osteoblast-derived OPN on the neoplastic cell phenotype. Additionally, the effects of cocultures on osteoclastic activity were evaluated. Human OSCC-derived epithelial cells (SCC9 cell line) were plated on Transwell® membranes coated or not by a thin uniform layer of Matrigel and cocultured with human osteoblastic cells (SAOS-2 cell line) during its peak of OPN expression (day 10 of SAOS-2 culture). SCC9 cells exposed to OPN-silenced SAOS-2 cultures by means of interference RNA and SCC9 cells cultured alone were used as controls. At 24 h of coculture, SCC9 cells were quantitatively evaluated for cell adhesion, proliferation, migration and invasion of Matrigel. The impact of coculturing SCC9 and SAOS-2 cells either during the OPN peak expression or under the silencing of OPN was quantitatively evaluated in terms of calcium phosphate resorption by U-937-derived osteoclastic cells and expression of cytokines in the culture medium by ELISA assay. The statistical analyses were carried out using the non-parametric Kruskal-Wallis test (p < 0.05). The results showed a reciprocal induction of SAOS-2 and SCC9 cells in terms of OPN expression over the coculture interval. SAOS-2-secreted OPN altered the SCC9 cell phenotype, leading to enhanced cell adhesion and proliferation and higher Matrigel invasion, which was also enhanced, but to a lesser degree, by SAOS-2 cultures silenced for OPN. Cell migration was not affected. Cocultures with SAOS-2, mainly during the peak expression of OPN, resulted in overexpression of IL 6 and IL 8 by SCC9 cells, which corresponded with an enhanced resorptive capacity of osteoclastic cells. Taken together, the results suggest that osteoblast-derived OPN affects the interactions among malignant neoplastic epithelial cells, osteoblasts and osteoclasts, likely contributing to the progression of bone lesions in OSCC / Doutorado / Patologia / Doutor em Estomatopatologia

INTRODUCCION. La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad crónica desmielinizante inflamatoria adquirida del sistema nervioso central. La patogenia es inmune. Las citoquinas son producidas por células inmunes y están involucradas en la desmielinización. La osteopontina (OPN) es una citoquina con actividad proinflamatoria que participa en la inmunidad celular Th1. Está sintetizada por diversas células inmunes, como los monocitos/macrófagos activados, las células T activadas y las células natural killer activadas. La OPN tiene funciones proinflamatorias: función quimiotáctica, inducción de la proliferación de células B y producción de anticuerpos, y aumentar la supervivencia celular de células inflamatorias; así como funciones reparadores: está implicada en la reparación de tejidos y tiene un actividad antiinflamatoria, inhibiendo la producción del óxido nítrico.PACIENTES Y METODO. Se estudiaron 221 pacientes con EM y 36 controles sanos (CS). Los pacientes presentaban diferentes formas clínicas: 115 EM remitente-recurrente (EMRR) (46 en remisión, 26 en brote y 43 en tratamiento con IFN-beta), 35 EM secundaria progresiva (EMSP) y 71 EM primaria progresiva (EMPP). La discapacidad se evaluó mediante la escala de estado de discapacidad ampliada (EEDA). El protocolo inmunológico consistió en recoger sangre periférica mediante venopunción con anticoagulante (EDTA) para obtener plasma. Los niveles plasmáticos de OPN fueron cuantificados mediante la técnica ELISA utilizando un kit comercial. RESULTADOS Y DISCUSION. Los niveles de OPN en plasma son más elevados en pacientes con EMSP en comparación a CS, EMRR en remisión y EMPP, con unas diferencias estadísticamente significativas. Los niveles plasmáticos de OPN son significativamente más elevados en pacientes con EMRR durante el brote en comparación a pacientes con EMRR en remisión clínica(p=0,004), por lo que pensamos que la OPN juega un papel en la actividad aguda de la enfermedad. Los niveles de OPN son más elevados en pacientes con EMSP sin incremento de la discapacidad en el año previo, con unas diferencias estadísticamente significativas (p=0,005); por lo que creemos que la OPN tiene propiedades reparadoras durante la fase progresiva de la EMSP. No encontramos diferencias en los niveles plasmáticos de OPN entre pacientes con EMPP y CS. Tampoco hallamos diferencias en los niveles de OPN en plasma entre aquellos pacientes tratados con IFN-beta de aquellos no tratados.CONCLUSIONES: 1) La OPN tiene una función proinflamatoria en la actividad aguda de la enfermedad; 2) La OPN tiene una actividad reparadora en la fase progresiva de la EMSP; 3) La OPN no está implicada en la patogenia de la EMPP; y 4) El IFN-beta no modifica la producción de OPN. / INTRODUCTION. Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system. The etiology of MS is immune. Cytokines produced by these infiltrating cells appear to be involved in the pathogenesis of inflammatory demyelination. The osteopontin (OPN) is a proimflammatory cytokine, classified as a Th1 cytokine. OPN is widely produced by a variety of immune cells including T cells, macrophages and NK cells. OPN exhibits pleiotropic functions including roles in inflammation, cell-mediated immunity and cell survival; also has recovery functions including tissue remodeling and anti-inflammatory properties inhibiting nitric oxide production in macrophages.PATIENTS AND METHOD. Two-hundred and twenty-one patients with multiple sclerosis were included in the study and 36 healthy controls. 115 relapsing-remitting MS (RRMS) patients (46 in clinical remission, 26 in relapse and 43 patients that had been receiving therapy with interferon (IFN)-beta); 35 secondary-progressive MS (SPMS) and 71 primary-progressive MS (PPMS). Disability was measured using the Kurtzke´s expanded disability status scale (EDSS). Peripheral blood was collected by standard venipuncture into vacuum tubes with EDTA. Levels of OPN in plasma samples were measured with a solid-phase sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using a commercially available kit.RESULTS AND DISCUSSION. Levels of OPN in plasma were significantly elevated in SPMS patients compared with healthy controls, RRMS patients in remission, and PPMS patients. Patients with RRMS during relapses presented significantly higher OPN plasma levels than RRMS patients in clinical remission (p=0,004). In this respect, it could be hypothesized that OPN has to play a role as a proinflammatory cytokine in acute disease activity. Levels of OPN in plasma were significantly elevated in SPMS patients with no disease progression in the last year (p=0,005). Thus suggesting a role of OPN in promoting recovery in the progression of SPMS. Not found differences between OPN levels to the primary progressive form of MS and HC. Neither found differences between OPN plasma levels of RRMS patients receiving therapy with IFN-beta and untreated RRMS patients. CONCLUSIONS. 1) OPN has proinflammatory properties in acute disease activity; 2) OPN plays a role in promoting recovery in the progression stage of SPMS; 3) OPN is not implicated to EMPP pathogenesis; and 4) IFN beta effect is not mediated through changes in OPN production.

Submitted by Biblioteca do Instituto Biomédico BIB (uffbib@gmail.com) on 2017-06-05T19:10:20Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Nataly Melo.pdf: 1795665 bytes, checksum: d444f8f78deb979ec897ad76fde8f8cd (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-05T19:10:20Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Nataly Melo.pdf: 1795665 bytes, checksum: d444f8f78deb979ec897ad76fde8f8cd (MD5) / Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro. / Uma série de genes vem sendo estudados por terem sua expressão aberrante em tumores de endométrio. Dentre eles, a osteopontina (OPN) e a p53, os quais são expressos de forma aberrante no carcinoma de endométrio (CE). Tem sido demonstrado que a expressão da OPN é capaz de regular a expressão de p53 e vice-versa. No entanto, ainda não há dados sobre as isoformas destes produtos gênicos e suas possíveis relações no CE. Este trabalho teve por objetivo avaliar o perfil de expressão e o potencial papel fisiopatológico das isoformas da OPN e da p53 em distintas linhagens celulares de endométrio. A expressão destes alvos foi avaliada por PCR em tempo real, imunoblot e imunofluorescência. Observamos que a OPNa é a isoforma predominante dentre as três isoformas, tanto em linhagens tumorais quanto não tumorais de endométrio. No entanto, apenas a isoforma OPNc apresenta expressão diferencial entre linhagens tumorais e uma não tumoral. De forma similar, todas as isoformas de p53 também são expressas nestas linhagens investigadas, sendo a p53 completa a isoforma predominante em linhagens tumorais e a Δ40p53 a segunda mais expressa, em especial em linhagens representativas de tumores do Tipo I. A variante Δ40p53 apresenta expressão predominante em linhagens celulares não tumorais de endométrio. Em conjunto, estes dados evidenciam correlação entre a expressão predominante da isoforma OPNa e a variante completa da p53, com padrões específicos de expressão da OPNc e da Δ40p53, de acordo as linhagens analisadas. Estes achados abrem perspectivas da potencial aplicação de isoformas variantes da OPN e de p53 enquanto biomarcadores no diagnóstico diferencial e também para avaliação prognóstica em tumores de endométrio. / Several genes have been studied by being overexpressed in endometrial tumors. Among them, osteopontin (OPN) and p53, which are overexpressed in endometrial carcinoma (EC). It has been demonstrated that the expression of OPN can regulate the expression of p53 and vice-versa. However, data is lacking regarding these gene products and their putative associations in EC. This work aims to evaluate the expression profile and the potential physiopathological roles of OPN and p53 isoforms in distinct endometrial cell lines.The expression of these gene targets has been evaluated here by real time PCR, immunoblot and immunofluorescense. We observed that OPNa is the predominant isoform among those three tested, both in tumor and non-tumoral cell lines. However, only OPNc isoform is differentially expressed between tumor and non-tumoral cell lines. Similarly, all p53 isoforms are expressed in these tested cell lines, being the full lenght p53 the predominant isoform in tumor cell lines, while Δ40p53 is the second variant in expression levels, especially in cell lines that are representative of Type I tumors. The Δ40p53 variant has predominat expression in non-tumoral cell lines. As a whole, these data evidence correlation between the predominant expression of OPNa and the full lenght p53 variant, with specific expression patterns observed for OPNc and Δ40p53, according to analyzed cell lines. These data open perspectives of the potential use of OPN and p53 isoform variants as biomarkers for differential diagnosis and prognostic evaluation in endometrial tumors.

Os bisfosfonatos são drogas capazes de inibir a reabsorção óssea por meio de seu efeito direto sobre as células ósseas, interferindo na dinâmica dos tecidos mineralizados. O alendronato (ALN), um tipo de bisfosfonato nitrogenado, foi utilizado com o objetivo de investigar os seus efeitos sobre os tecidos dentários e periodontais após luxação lateral de molares com as raízes em desenvolvimento. Ratos Wistar com 21 dias de idade tiveram os segundos molares superiores luxados lateralmente. Doses diárias de 2,5 mg / kg de ALN começaram no dia seguinte à luxação; os controles receberam solução salina estéril. As maxilas foram fixadas, descalcificadas e incluídas em parafina ou em resina Spurr 7, 14 e 21 dias pós-luxação. Os cortes foram corados com H & E, incubados por histoquímica TRAP e imuno marcados para osteopontina (OPN), bem como para análise ultraestrutural. Após 21 dias, o ápice dos molares luxados sem ALN estava aberto e desorganizado, coberto por uma camada irregular de cemento celular. Os molares luxados dos animais tratados com ALN apresentaram alguns locais de anquilose, bem como lacunas de reabsorção na superfície do cemento. Os osteoclastos TRAP positivos foram mais numerosos no grupo ALN, apesar de sua aparência latente e sua localização, afastados das trabéculas ósseas, em relação aos controles, achado que foi confirmado com a análise ultraestrutural. A imunomarcação de OPN revelou uma linha grossa imunopositiva na dentina, que deve ter surgido a partir do momento da luxação, enquanto que as amostras tratadas com ALN não apresentaram alterações na dentina. Os resultados indicam que o alendronato inibe algumas alterações na dentina e na formação do cemento, induzidas pelo trauma dental de luxação. / Bisphosphonates are drugs that inhibit bone resorption through its direct effect on bone cells, interfering with the dynamics of mineralized tissues. Alendronate (ALN), a nitrogenated bisphosphonate, was used in order to investigate their effects on dental and periodontal tissues after lateral dislocation of molars with developing roots. Twenty one days old Wistar rats had their second molars laterally l. Daily doses of 2.5 mg / kg ALN started the day following the dislocation, while controls received saline solution. The maxillae were fixed, decalcified and embedded in paraffin or in Spurr resin after 7, 14 and 21 days post-dislocation. The sections were stained with H & E, incubated for TRAP, immunolabeled for osteopontin (OPN), and ultrastructurally analyzed by transmission electron microscopy. After 21 days, the apex of the luxated molar without ALN was open and disorganized, covered by an irregular layer of cellular cementum. The luxated molar from ALN-treated animals showed some areas of ankylosis and resorption lacunae on the cementum surface. TRAP-positive osteoclasts were more numerous in the ALN group, despite their latent appearance compared to controls, a finding that was ultrastructurally confirmed. OPN immunostaining revealed a thick immunopositive line in dentin, which must be resultant from the moment of dislocation, while the samples treated with ALN showed no changes in dentin. The results indicate that alendronate inhibits some changes in dentin and cementum formation induced by dental trauma of lateral luxation.

Submitted by Cássio da Cruz Nogueira (cassionogueirakk@gmail.com) on 2017-05-05T11:48:50Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_PolimorfismosGeneOsteopontina.PDF: 512218 bytes, checksum: 778ee81294f6547b26545b2516f0d00f (MD5) / Approved for entry into archive by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br) on 2017-05-09T21:55:15Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_PolimorfismosGeneOsteopontina.PDF: 512218 bytes, checksum: 778ee81294f6547b26545b2516f0d00f (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-09T21:55:15Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_PolimorfismosGeneOsteopontina.PDF: 512218 bytes, checksum: 778ee81294f6547b26545b2516f0d00f (MD5) Previous issue date: 2012-09-24 / Este trabalho teve como objetivo identificar polimorfismos neste gene e associar os mesmos aos parâmetros de fertilidade de búfalos criados de forma extensiva. Foram utilizados 306 machos bubalinos, acima de 18 meses de idade, criados em duas propriedades, uma no estado do Amapá e outra no estado do Pará. Os resultados obtidos para a extração de DNA através de pêlos foram de excelente quantidade, com concentração maior que 50ng/l. Ambos pares de primers amplificaram as regiões específicas do gene da osteopontina. Foram identificados 3 polimorfismos do tipo SNP para a região amplificada pelo primer OS4 (5`UTR) e 4 polimorfismos do tipo SNP para a região amplificada pelo primer OS9 (éxon 5 ao éxon 6). Os polimorfismos foram nas posições 1478, 1513 e 1611 na região amplificada pelo OS4 e nas posições 6690, 6737, 6925 e 6952 na região amplificada pelo OS9. Para todas as características estudadas foram encontrados SNPs significativos a 5%. Para circunferência escrotal, o SNP 6690; para volume testicular, o SNP 6737; para a concentração, o SNP 6690; para motilidade, o SNP 6690 e para patologia espermática, o SNP 6690. Estando os polimorfismos do SNP 6690 relacionado com quatro características. Para a característica CE o genótipo AA foi associado (P<0,05) com os animais que apresentaram maior média de circunferência escrotal, maior média de concentração espermática, maior média de motilidade e menor número de patologias totais. Entretanto, para a característica volume testicular, os animais que apresentaram maior volume estão correlacionados com a presença do genótipo GG, para o SNP 6737. Isso indica que o gene da osteopontina pode influenciar as características reprodutivas em machos bubalinos. / Because the osteopontin gene can influence the fertility of water buffaloes, the aim of this work was to identify polymorphisms in this gene and associate them with fertility parameters of animals kept under extensive grazing. We used 306 male buffaloes older than 18 months, bred on two farms, one in the state of Amapá and the other in the state of Pará. We identified three SNP for the region amplified by the primer OS4 (5`UTR) and four SNP polymorphisms for the region amplified by the primer OS9 (exon 5 to exon 6). The polymorphisms were in positions 1478, 1513 and 1611 in the region amplified by OS4 and positions 6690, 6737, 6925 and 6952 in the region amplified by OS9. We calculated correlations with the traits scrotal circumference and volume and sperm motility, concentration and pathology. There were SNPs for all the traits studied at 5% significance: for circumference, SNP 6690; for volume, SNP 6737; for concentration, SNP 6690; for motility, SNP 6690; and for pathology, SNP 6690. Therefore, SNP 6690 was related to four traits. The AA genotype of SNP 6690 presented the highest averages for scrotal circumference, sperm concentration and motility and the lowest total number of pathologies. However, for the scrotal volume trait, the animals with the largest volume were correlated with the presence of the GG genotype of SNP 6737. This indicates that the osteopontin gene is important because it can have a substantial influence on the reproductive traits of male buffaloes.

Toxoplasma gondii é um parasito do filo Apicomplexa que infecta uma grande variedade de hospedeiros, incluindo os humanos. O parasito invade a célula hospedeira por penetração ativa, com a participação das proteínas de suas organelas secretoras durante esse processo. Até o momento, somente um número limitado de proteínas secretoras tem sido descoberto, além disso, as moléculas efetoras envolvidas na invasão e sobrevivência do parasito não estão completamente compreendidas. A osteopontina (OPN) é uma glicofosfoproteína adesiva secretada, multifuncional, que contém o domínio arginina-glicina-ácido aspártico (RGD) de ligação à integrina, que está envolvida em uma variedade de eventos fisiológicos e patológicos, incluindo sinalização e sobrevivência celular. Pela primeira vez, nós demonstramos pelas técnicas de imunofluorescência e imunocitoquímica ultraestrutural que há uma intensa marcação para uma proteína OPN-like nos grânulos densos de taquizoítos de T. gondii extracelulares. O western blotting e o RT-PRC confirmaram a expressão de OPN-like nos taquizoítos. Nossos resultados também mostram que após a invasão dos macrófagos, a proteína OPN-like está localizada na membrana do vacúolo parasitóforo. Esses dados sugerem que os grânulos densos secretam uma proteína OPN-like, e nós podemos especular que essa proteína participa durante o processo de interação do parasito com as células hospedeiras. . / Toxoplasma gondii is an apicomplexan parasite infecting a broad host range, including humans. The parasite invades host cell by active penetration with the participation of its secretory organelles proteins during this process. Until now, only a limited number of secretory proteins have been discovered, and the effectors molecules involved in parasite invasion and survival are not well understood. Osteopontin (OPN) is a multifunctional secreted adhesive glycophosphoprotein containing the arginine-glycine-aspartic acid (RGD) integrin-binding domain, which is involved in various physiological and pathological events including cell signaling and survival. For the first time we demonstrated by immunofluorescence and immunoelectron microscopy approaches that there is an intense labeling for an OPN-like protein in the dense granules of extracellular T. gondii tachyzoites. Western blotting and RTPCR confirmed this protein expression in tachyzoites. Our results also showed that after macrophage invasion the OPN-like protein is localized at the parasitophorous vacuole membrane. These data suggest that dense granules secrete an OPN-like protein, and we can speculate that this protein participates during the parasite interaction process with host cells.

Toxoplasma gondii é um parasito do filo Apicomplexa que infecta uma grande variedade de hospedeiros, incluindo os humanos. O parasito invade a célula hospedeira por penetração ativa, com a participação das proteínas de suas organelas secretoras durante esse processo. Até o momento, somente um número limitado de proteínas secretoras tem sido descoberto, além disso, as moléculas efetoras envolvidas na invasão e sobrevivência do parasito não estão completamente compreendidas. A osteopontina (OPN) é uma glicofosfoproteína adesiva secretada, multifuncional, que contém o domínio arginina-glicina-ácido aspártico (RGD) de ligação à integrina, que está envolvida em uma variedade de eventos fisiológicos e patológicos, incluindo sinalização e sobrevivência celular. Pela primeira vez, nós demonstramos pelas técnicas de imunofluorescência e imunocitoquímica ultraestrutural que há uma intensa marcação para uma proteína OPN-like nos grânulos densos de taquizoítos de T. gondii extracelulares. O western blotting e o RT-PRC confirmaram a expressão de OPN-like nos taquizoítos. Nossos resultados também mostram que após a invasão dos macrófagos, a proteína OPN-like está localizada na membrana do vacúolo parasitóforo. Esses dados sugerem que os grânulos densos secretam uma proteína OPN-like, e nós podemos especular que essa proteína participa durante o processo de interação do parasito com as células hospedeiras. . / Toxoplasma gondii is an apicomplexan parasite infecting a broad host range, including humans. The parasite invades host cell by active penetration with the participation of its secretory organelles proteins during this process. Until now, only a limited number of secretory proteins have been discovered, and the effectors molecules involved in parasite invasion and survival are not well understood. Osteopontin (OPN) is a multifunctional secreted adhesive glycophosphoprotein containing the arginine-glycine-aspartic acid (RGD) integrin-binding domain, which is involved in various physiological and pathological events including cell signaling and survival. For the first time we demonstrated by immunofluorescence and immunoelectron microscopy approaches that there is an intense labeling for an OPN-like protein in the dense granules of extracellular T. gondii tachyzoites. Western blotting and RTPCR confirmed this protein expression in tachyzoites. Our results also showed that after macrophage invasion the OPN-like protein is localized at the parasitophorous vacuole membrane. These data suggest that dense granules secrete an OPN-like protein, and we can speculate that this protein participates during the parasite interaction process with host cells.

Os bisfosfonatos são drogas capazes de inibir a reabsorção óssea por meio de seu efeito direto sobre as células ósseas, interferindo na dinâmica dos tecidos mineralizados. O alendronato (ALN), um tipo de bisfosfonato nitrogenado, foi utilizado com o objetivo de investigar os seus efeitos sobre os tecidos dentários e periodontais após luxação lateral de molares com as raízes em desenvolvimento. Ratos Wistar com 21 dias de idade tiveram os segundos molares superiores luxados lateralmente. Doses diárias de 2,5 mg / kg de ALN começaram no dia seguinte à luxação; os controles receberam solução salina estéril. As maxilas foram fixadas, descalcificadas e incluídas em parafina ou em resina Spurr 7, 14 e 21 dias pós-luxação. Os cortes foram corados com H & E, incubados por histoquímica TRAP e imuno marcados para osteopontina (OPN), bem como para análise ultraestrutural. Após 21 dias, o ápice dos molares luxados sem ALN estava aberto e desorganizado, coberto por uma camada irregular de cemento celular. Os molares luxados dos animais tratados com ALN apresentaram alguns locais de anquilose, bem como lacunas de reabsorção na superfície do cemento. Os osteoclastos TRAP positivos foram mais numerosos no grupo ALN, apesar de sua aparência latente e sua localização, afastados das trabéculas ósseas, em relação aos controles, achado que foi confirmado com a análise ultraestrutural. A imunomarcação de OPN revelou uma linha grossa imunopositiva na dentina, que deve ter surgido a partir do momento da luxação, enquanto que as amostras tratadas com ALN não apresentaram alterações na dentina. Os resultados indicam que o alendronato inibe algumas alterações na dentina e na formação do cemento, induzidas pelo trauma dental de luxação. / Bisphosphonates are drugs that inhibit bone resorption through its direct effect on bone cells, interfering with the dynamics of mineralized tissues. Alendronate (ALN), a nitrogenated bisphosphonate, was used in order to investigate their effects on dental and periodontal tissues after lateral dislocation of molars with developing roots. Twenty one days old Wistar rats had their second molars laterally l. Daily doses of 2.5 mg / kg ALN started the day following the dislocation, while controls received saline solution. The maxillae were fixed, decalcified and embedded in paraffin or in Spurr resin after 7, 14 and 21 days post-dislocation. The sections were stained with H & E, incubated for TRAP, immunolabeled for osteopontin (OPN), and ultrastructurally analyzed by transmission electron microscopy. After 21 days, the apex of the luxated molar without ALN was open and disorganized, covered by an irregular layer of cellular cementum. The luxated molar from ALN-treated animals showed some areas of ankylosis and resorption lacunae on the cementum surface. TRAP-positive osteoclasts were more numerous in the ALN group, despite their latent appearance compared to controls, a finding that was ultrastructurally confirmed. OPN immunostaining revealed a thick immunopositive line in dentin, which must be resultant from the moment of dislocation, while the samples treated with ALN showed no changes in dentin. The results indicate that alendronate inhibits some changes in dentin and cementum formation induced by dental trauma of lateral luxation.

O trabalho teve como objetivo avaliar e quantificar o tecido ósseo neoformado, a distribuição e a importância das proteínas não colágenas (osteocalcina, osteopontina e osteonectina) no processo de reparação tecidual do alvéolo dental de ratos Wistar idosos após exodontia. Para sua realização, foram utilizados 80 Rattus Norvegicus albinus, linhagem Wistar, machos. Os animais foram distribuídos em dois grupos: Grupo Controle, correspondente a animais com 60 dias de vida; e Grupo Experimental correspondente aos animais com 2 anos de vida (700 dias em média). Cada grupo foi dividido em 4 subgrupos de 10 animais em cada grupo. Os animais foram submetidos à exodontia do incisivo superior direito e foram sacrificados com 05, 15, 21 e 28 dias de pós-operatório. Após a dissecção, 5 amostras foram submetidas à análise por microscopia convencional com coloração por Hematoxilina e Eosina e análise da imunohistoquímica e 5 amostras para análise por RT-PCR. Os resultados mostraram que o processo de envelhecimento não alterou a cronologia do reparo ósseo alveolar e não promoveu maior remodelação do alvéolo dental. A osteocalcina não apresentou atuação importante nos períodos pós-operatórios estudados. A osteonectina apresentou-se importante no processo de reparo, não sofrendo alterações no início da reparação óssea, apresentando marcação mais intensa durante a maturação óssea entre 21 e 28 dias de pós-operatório no grupo controle e diminuição da marcação no grupo experimental aos 28 dias de pósoperatório. O envelhecimento proporcionou uma diminuição da imunomarcação da osteonectina e demonstrou marcações positivas principalmente em osteoblastos e matriz mineralizada. A osteopontina apresentou-se importante no processo de reparo ósseo durante todos os períodos pós-operatório, apresentando marcações em osteoblastos, matriz osteóide, osteócitos e matriz mineralizada, apresentando maior marcação dos tipos celulares do no grupo experimental aos 28 de pós-operatório. Apesar desses achados, novos estudos são necessários para o melhor entendimento do processo de reparo ósseo alveolar em ratos adultos e idosos. / The aim of the present study was to evaluate and quantify the newly formed bone tissue, as well as the distribution and the importance of non-collagen proteins (osteocalcin, osteopontin and osteonectin) in the process of dental alveolar repair in Wistar aged rats submitted to tooth extraction. To perform that, about 80 male Rattus Norvegicus albinus, Wistar strain, were randomly distributed into two groups: Control Group corresponding to 60 days old rats; and Experimental Group corresponding to 2 years old animals (about 700 days old). Both groups were later subdivided into 4 subgroups consisting of 10 animals each. All animals were submitted to the upright incisive tooth extraction and were euthanized 05, 15, 21 and 28 days after the tooth extraction surgery. After the dissection, five samples from each subgroup underwent conventional microscopy analysis by hematoxylin-eosin stain as well as immunohistochemistry. Bone tissue from other five samples of each groups were subjected to Real Time RT-PCR analysis of non-collagen proteins expression The results obtained suggest that aging process was not able to change either the chronology of alveolar bone repair or the remodeling of dental alveolus. Osteocalcin did not present any important action in the post-operation periods evaluated. On the other hand, osteonectin showed an important role during the repair process, since its expression was increased in the control group and decreased in comparison to the experimental group at 28 days. Osteopontin was important in the bone repair in all times evaluated, since it was present in osteoblasts, osteiod matrix, osteocytes and mineralized matrix, being even more stained at 21 days after the surgery. Finally, besides the results obtained in the present work, other studies are necessary to better understand the alveolar bone repair in adult and aged rats.

Acreditava-se que a reparação do osso alveolar durante a movimentação ortodôntica só ocorresse após a diminuição da carga aplicada. No entanto, recentemente foi observado reparação do osso alveolar utilizando força contínua. Osteopontina é uma proteína não colágena da matriz com importante papel na remodelação óssea. Para analisar as reações no periodonto de sustentação e a distribuição de OPN, uma força contínua de 15cN foi aplicada aos primeiros molares superiores de ratos por 12d, 15d e 18d. Como controle, outros animais não tiveram seus molares movimentados. As maxilas foram processadas para análise ultra-estrutural morfológica, imunocitoquímica para OPN e histoquímica para fosfatase ácida resistente ao tartarato. No tempo inicial do estudo não foram encontradas reabsorções radiculares. Nos tempos intermediário e final, no entanto, reabsorções radiculares estavam presentes e aumentavam sua severidade com o tempo. Além disso, foi observado sinal de reparação do cemento. A expressão de OPN apresentou-se aumentada na superfície óssea e radicular. / It is believed that repair during orthodontic movement occurs after decreasing of force. However, signs of repair in alveolar bone submitted to continuous orthodontic force have been recently observed. Osteopontin is a major noncollagenous matrix protein that plays a role in physiological remodeling and mechanical stress. In order to test periodontal reactions and the distribution of OPN, a continuous 15cN force was applied to upper first rat molars for 12d, 15d, 18d, while other rats did not have their molars moved as a control. Maxillae were processed for ultrastructural analysis, immunocytochemistry for OPN and tartarate-resistant acid phosphatase histochemistry. Ultrastructural analysis revealed root resorption at 15d and 18d. Deep lacunae appeared in some regions of the pressure area after 18 days, most of them reaching the underlying root dentine. Signs of repair were detected concomitant with tissue damage and resorption of the root surfaces. At all times studied, overexpression of OPN was observed recovering alveolar bone and root surface.