Adenosine (ADO) is an endogenous neuroprotectant. Under ischemic conditions ADO levels rise in the brain up to 100-fold. ADO in the brain is dependent on the movement across cell membranes by equilibrative nucleoside transporters (ENT) or produced from membrane bound ecto-5’ nucleotidase (eN). We used transgenic neurons with neuronal specific expression of human ENT1 (hENT1) and eN knockout (CD73 KO) astrocytes. The aim of this research was to determine the role of ENT1 and eN in ADO release from ischemic-like conditions in primary cultured neurons, astrocytes or co-cultures. Neurons primarily release intracellular ADO via ENTs; this effect was blocked by transporter inhibitor, dipyridamole (DPR). Astrocytes primarily convert ADO extracellularly from eN; this effect was with eN inhibitor α, β-methylene ADP (AOPCP). Combined neuron and KO astrocytes produced less ADO, extracellular ADO was inhibited by DPR but not AOPCP. Overall these results suggest that eN is prominent in the formation of ADO but other enzymes or pathways contribute to rising ADO levels in ischemic conditions.

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Ces dernières années, alors qu’aucun agent neuroprotecteur n’a été efficace en clinique pour parer les dommages de l’ischémie cérébrale, le concept d’unité neurovasculaire (UNV) est apparu comme un nouveau paradigme pour l’investigation et le traitement des accidents vasculaires cérébraux ischémiques. La rupture de la barrière hémato-encéphalique (BHE) localisée au niveau des capillaires cérébraux, et ses corollaires l’œdème vasogénique et l’hémorragie intracérébrale, constituent des événements critiques de la maladie, et restreignent considérablement l’éligibilité des patients à la thrombolyse au rtPA, seul traitement de phase aiguë disponible actuellement en clinique. La complexité des intercommunications qui s’exercent au sein de l’UNV rend difficile l’appréhension de la dysfonction microvasculaire in vivo, soulignant l’importance des études in vitro pour compléter les connaissances dans ce domaine. C’est par cette approche combinée que les travaux effectués au cours de ce doctorat démontrent l’impact de la nécrose cérébrale sur la cinétique de la perte d’intégrité de la BHE au décours de la reperfusion. Cependant, même si l’endothélium microvasculaire demeure fonctionnel après un épisode ischémique dans un contexte non lésionel, il devient vulnérable à certaines molécules comme le rtPA dans une situation de thrombolyse. Ces résultats illustrent le rôle déterminant de l’environnement moléculaire périvasculaire sur la dysfonction de la BHE lors de l’ischémie cérébrale, et orientent les nouvelles stratégies thérapeutiques vers des approches ciblant la protection de l’ensemble de l’UNV. / In the recent years, while no neuroprotective agent was clinically effective in reducing brain ischemic damage, the neurovascular unit (NVU) concept emerged as a new paradigm for stroke investigation and treatment. The breakdown of the blood-brain barrier (BBB), localized in brain capillaries, with ensuing vasogenic edema and intracerebral hemorrhage, appears as a critical event of this disease, and severely restricts the eligibility of patients for rtPA thrombolysis, the only acute-phase treatment currently available. The complex intercommunications occurring within the NVU makes the microvascular dysfunction difficult to study in vivo, highlighting the importance of in vitro approaches to complete the knowledge in this field. In this context, the work done in this PhD demonstrates that brain tissue necrosis influences the kinetics of the loss of BBB integrity during reperfusion. However, even when the BBB remains functional in a non-lesional ischemic context, it becomes vulnerable to certain molecules such as rtPA in a thrombolysis situation. These results illustrate the key role of molecular perivascular environment on the BBB dysfunction during cerebral ischemia, and orientate new therapeutic strategies towards the protection of the entire NVU.

Yes / Inhibitory GABAB receptors (GABABRs) can down-regulate most excitatory synapses in the CNS by reducing postsynaptic excitability. Functional GABABRs are heterodimers of GABAB1 and GABAB2 subunits and here we show that the trafficking and surface expression of GABABRs is differentially regulated by synaptic or pathophysiological activation of NMDA receptors (NMDARs). Activation of synaptic NMDARs using a chemLTP protocol increases GABABR recycling and surface expression. In contrast, excitotoxic global activation of synaptic and extrasynaptic NMDARs by bath application of NMDA causes the loss of surface GABABRs. Intriguingly, exposing neurons to extreme metabolic stress using oxygen/glucose deprivation (OGD) increases GABAB1 but decreases GABAB2 surface expression. The increase in surface GABAB1 involves enhanced recycling and is blocked by the NMDAR antagonist AP5. The decrease in surface GABAB2 is also blocked by AP5 and by inhibiting degradation pathways. These results indicate that NMDAR activity is critical in GABABR trafficking and function and that the individual subunits can be separately controlled to regulate neuronal responsiveness and survival. / BBSRC, MRC and the European Research Council

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Die Wirkung von zwei endogen neuroprotektiven Substanzen, Melatonin und 17 beta-Estradiol wurde an drei Caspase-abhängigen, apoptotischen, aber Exzitotoxin-unabhängigen Schadensmodellen an neuronalen Primärkulturen untersucht und mit der bei vorwiegend nekrotischen Schadensmodellen verglichen. Es zeigten sich eine Abhängigkeit des neuroprotektiven Potentials von der Art des Zelluntergangs sowie unterschiedliche Mechanismen der Neuroprotektion. Melatonin wirkte in allen drei apoptischen Modellen nicht neuroprotektiv, sondern verstärkte die Schädigung der Neurone noch, während partiell gegen die OGD-induzierte Nekrose (OGD, engl. Oxygen glucose deprivation, kombinierter Sauerstoff- und Glukoseentzug) kortikaler Neurone Schutz erzielt wurde. Der Einsatz des endogenen neuroprotektiven Faktors Melatonin als Therapeutikum ist möglicherweise nur bei neurodegenerativen Erkrankungen mit exzitotoxischer Schädigung durch Glutamat oder oxidativem Stress wie bei Epilepsie oder dem Schlaganfall durch Ischämie sinnvoll. Die fehlende bzw. potenzierenden Wirkung von Melatonin bei neuronaler Apoptose in vitro, stellt jedoch einen therapeutischen Erfolg bei der Behandlung der mit apoptotischer Schädigung einhergehenden Alzheimer'schen Erkrankung in Frage. Bei klinischer Anwendung ist auch der von uns erhobene Befund zu beachten, dass in vitro native neuronale Zellen durch Melatonin geschädigt werden. 17 beta-Estradiol wirkte sowohl bei nekrotischer als auch bei apoptotischer Zellschädigung. Dabei zeigten sich wesentliche Unterschiede in den Mechanismen der Neuroprotektion und in der Ansprechbarkeit verschiedener Regionen des Gehirns. Schutz vor Apoptose konnte nur durch eine Langzeitvorbehandlung (20 h) in septalen und hippokampalen Kulturen, nicht jedoch in kortikalen Kulturen beobachtet werden. Dieser Effekt liess sich durch Rezeptorantagonisten, Proteinsynthesehemmung sowie durch Hemmung der Phosphoinositol-3-Kinase blockieren. Eine Kurzzeitbehandlung war gegen Apoptose nicht wirksam, zeigte gegen OGD und Glutamattoxizität jedoch neuroprotektives Potential. Dieser Effekt liess sich nicht antagonisieren, so dass hier ein direkter antioxidativer Mechanismus wahrscheinlich erscheint. Die antiapoptotische Wirkung in septalen und hippokampalen Kulturen korrelierte mit einer höheren Dichte des Estrogenrezeptors-alpha und einer erhöhten Expression antiapoptotischer Proteine in diesen Regionen. Da bei der Alzheimer'schen Erkrankung der Kortex betroffen ist, könnte der fehlende Effekt von 17 beta-Estradiol in kortikalen Neuronen sowohl auf die neuronale Apoptose als auch auf die Proteinexpression von Bcl-2 und Bcl-xL möglicherweise auf experimenteller Basis erklären, warum eine langfristige Estrogentherapie bei Frauen mit milder bis moderater Alzeimer'scher Erkrankung den Progress der Erkrankung nicht aufhalten konnte (Mulnard et al. 2000). / The neuroprotective effect of melatonin and 17 beta-estradiol has been evaluated in several in vitro models of neuronal apoptosis and necrosis. Melatonin was not neuroprotective in three models of apoptosis but showed a pro-apoptotic effect in primary cortical neurons. Melatonin revealed to damage naïve neurons, too. Partial protection was observed against necrotic neurodegeneration after oxygen-glucose deprivation (OGD). The use of melatonin as a therapeutic agent might be of interest in neurodegenerative diseases with excitotoxic damage like epilepsia or ischemia, but is questioned in case of apoptotic neurodegeneration. 17 beta-estradiol was neuroprotectiv in both necrotic and apoptotic neurodegeneration. Differences in the mechanism of neuroprotetion and in the efficacy in different regions of the brain were observed. A neuroprotective effect was visible only in hippocampal and septal cultures if 17 beta-estradiol was applied 20 h prior (long term pre-treatment) but not in cortical neurons. This effect correlates with an increased density of estrogen receptor-alpha and an increased expression of anti-apoptotic proteins like Bcl-2 and Bcl-xL in these regions. These effect could be blocked with receptor antagonists, protein synthesis inhibitors and an inhibitor of the phosphatidylinositol 3-kinase. A short term pre-treatment revealed a receptor independent neuroprotective potential against OGD and glutamate toxicity. The failure of 17 beta-estradiol to protect cortical neurons against apoptosis could be an experimental basis to understand, why a long lasting treatment with estrogens of women with mild to moderate Alzheimer´s disease failed to inhibit the progress of the illness (Mulnard et al., 2000)