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Orientador: Wagner Bettiol / Coorientador: Carlos Gilberto Raetano / Banca: Antonio Carlos Maringoni / Banca: Miguel Angel Dita Rodriguez / Resumo: A indução de supressividade a Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc) em bananeira por meio de produtos orgânicos foi avaliada pela incorporação ao solo, artificialmente infestado com o patógeno, de biocarvão de serragem de Eucalyptus (BC), casca de camarão (CC), composto de lodo de esgoto (LE), concha de marisco (CM), bio-óleo de casca de arroz (BA) e de serragem de Eucalyptus (BE), emulsão (EP) e hidrolisado de peixe (HP). Características químicas do solo; área abaixo da curva de progresso do índice da doença (AACPID); severidade final; descoloração interna do rizoma; respiração microbiana por meio da liberação de CO2; comunidade de F. oxysporum, fungos e bactérias totais; a inibição do crescimento micelial e da germinação de microconídios pelos extratos aquosos e pela liberação de compostos voláteis tóxicos foram os parâmetros avaliados. A CC e o LE reduziram a severidade externa (50 e 37%, respectivamente) e a descoloração interna do rizoma (56 e 36%, respectivamente). As CC e CM reduziram o desenvolvimento das plantas nas fases iniciais de cultivo, mostrando sintomas de fitotoxicidade. A elevação do pH, condutividade elétrica (CE), K, Mg, S, Na, Fe, Zn, CO2 e comunidade de bactérias foram as características que apresentaram maior influência na redução da severidade, enquanto que o aumento no pH, CE, CO2, P, Ca, S, Na e B também contribuíram para reduzir a população de F. oxysporum no solo. O BA, o BE e o HP reduziram em 94, 84 e 40% a AACPID, respectivamente. Os teores de Zn, a inibição do crescimento micelial e inibição da germinação dos microconídios pela ação de compostos voláteis e de extratos aquosos foram os mecanismos que mais explicaram o controle ... / Abstract: The induction of suppressiveness to Fusarium wilt in banana by the incorporation of Eucalyptus sawdust biochar (BC), shrimp shells (CC), composted sewage sludge (LE), clamshell (CM), bio-oil of rice husk (BA) and bio-oil of Eucalyptus sawdust (BE), fish emulsion (EP) and fish hydrolyzate (HP) to soil was evaluated. Soil chemical characteristics; the area under the curve of progress of the disease index (AUPCDI), final severity and internal discoloration of the rhizome; microbial respiration through the release of CO2; the populations of F. oxysporum, fungi and total bacteria; and inhibition of mycelial growth and microconidia germination through the compounds volatile toxic and aqueous extracts were the parameters evaluated. The CC and LE reduced final severity (50 and 37%, respectively) and the internal discoloration of the rhizome (56 and 36%, respectively). The incorporation of CC and CM reduced plant development in the early stages of cultivation, showing symptoms of phytotoxicity. The increase in pH, electric ... / Mestre

Les champignons endophytes sont des microorganismes non-pathogènes impliqués dans des associations mutualistes avec les plantes. Les endophytes foliaires, en particulier, représentent un groupe très divers, mais leurs interactions avec la plante hôte et ses micro-organismes associés sont peu connues. Des travaux préliminaires initiés par notre équipe, explorant la diversité microbienne foliaire du conifère Cephalotaxus harringtonia, ont permis d’isoler la souche fongique Paraconiothyrium variabile (Ascomycota), un antagoniste du phytopathogène Fusarium oxysporum. Au cours de leur interaction, on détecte des quantités moindres de beauvéricine, une mycotoxine synthétisée par F. oxysporum. En parallèle, on observe une augmentation de la synthèse de deux oxylipines, l’acide 13-hydroperoxyoctadécadiénoïque (13-HPODE) et l’acide 13-oxo-octadécadiénoïque (13-oxo-ODE), dans la zone de confrontation. L'objectif de ce travail était de comprendre les mécanismes conduisant à la diminution de la beauvéricine au cours de l'interaction et d'explorer le rôle des oxylipines dans la régulation de cette dernière. Dans mon travail de thèse, je montre la présence de deux gènes lox chez P. variabile (pvlox1 et pvlox2) codant tous deux pour des manganèse lipoxygénases, potentiellement à l'origine des acides 13-HPODE et 13-oxo-ODE. Pvlox2 est spécifiquement induit pendant l'interaction, et ces résultats sont corroborés par une synthèse accrue de 13-HPODE chez P. variabile. Par ailleurs, l'interaction avec l’endophyte, ainsi que l'ajout de l’oxylipine 13-HPODE, régulent positivement la voie de biosynthèse de la beauvéricine, comme l’indiquent les teneurs plus élevées en mycotoxines observées chez F. oxysporum. Enfin, nous avons montré que la beauvéricine inhibait la croissance de l’endophyte, mais que ce dernier était capable de dégrader la mycotoxine, expliquant ainsi les faibles quantités de beauvericine observées initialement dans la zone de compétition. Ce travail contribue à la compréhension du rôle des oxylipines dans la communication inter-microbienne. / Endophytic fungi are non-pathogenic microorganisms involved in mutualistic associations with their host. Foliar endophytes, in particular, represent a very diverse group but little is known about their interactions with the host and its associated micro-organisms. In preliminary work, exploring the leaf microbial diversity of the conifer Cephalotaxus harringtonia, our team isolated the fungal strain Paraconiothyrium variabile (Ascomycota), an antagonist of the phytopathogen Fusarium oxysporum. During their interaction, decreased amounts of the F. oxysporum mycotoxin beauvericin, and higher amounts of the two oxylipins, 13-hydroperoxyoctadecadienoic acid (13-HPODE) and 13-oxo-octadecadienoic acid (13-oxo-ODE), were observed in the confrontation zone. The objective of the present work was to understand the mechanisms leading to beauvericin decrease during the interaction and to explore the role of oxylipins in beauvericin regulation. In my thesis work I show the presence of two lox genes in P. variabile (pvlox1 and pvlox2) coding both for manganese lipoxygenases, potentially at the origin of 13-HPODE and 13-oxo-ODE. Pvlox2 is specifically induced during the interaction, which lead to an increased synthesis of 13-HPODE in P. variabile. The endophyte itself, as well as the oxylipin 13-HPODE, up-regulated the beauvericin biosynthesis gene beas, which was paralleled by higher mycotoxin content in the mycelium of F. oxysporum. Finally, we showed that beauvericin inhibited the endophyte’s growth, but the latter was capable to degrade the mycotoxin, which explains the lower amounts of beauvericin found in the competition zone. This work presents pioneer undertaking to elucidate the role of oxylipins in inter-microbial crosstalk.

Trichoderma spp. is at the present time, one of the fungi most studied as biocontrol agent, being antagonistic to several pathogens in different crops, besides promoting vegetable growth. The pathogen Fusarium oxysporum causes the fusarial wilt and is difficult to control mainly because of its capacity to remain in the soil for long periods, even without the presence of the host. Studies of the population dynamics of Trichoderma spp., Fusarium spp. and native microorganisms are necessary, mainly to observe the impact of the biocontrol agent addition to the soil. Vegetables as cucumber and tomato are commonly cultivated in South Brazil and are sensitive to a variety of diseases, as the fusarial wilt which is one of, their main diseases, specially in protected environment. For the biological control of the fusarial wilt in the cultivation of tomato and cucumber by Trichoderma and to study the population dynamics of the biocontrol agent when added to the soil, the following objectives were proposed: to study the space distribution of both Trichoderma and Fusarium in rhizosphere and bulk soil, in the cultivation of cucumber and tomato, in vegetable garden and greenhouse; to find a method for the mass selection of fungi isolates antagonistic to Fusarium solani and Fusarium oxysporum in microenvironment, and to identify the more effective ones; to verify the action of Trichoderma harzianum isolates in the development and protection of seedlings against the fusarial wilt of tomato and cucumer, identifying the best form of the biocontrol agent application in the control of the fusarial wilt; to analyze the population dynamics of Trichoderma and Fusarium, and of part of the microorganisms of the soil, with the addition of the biocontrol agents, in the cultivation of the tomato and cucumber, in greenhouse and vegetable garden. Both Trichoderma and Fusarium were found in the rhizosphere and bulk soil and the rhizosphere soil had the greater frequence of Trichoderma specially in greenhouse. The method of mass selection, in substrat, of fungi isolates antagonistic to the pathogens F. solani and F. oxysporum was efficient, since the three isolates of Trichoderma harzianum selected, besides reducing the population of the pathogens in substrate were also effective against the fusarial wilt of tomato and cucumber when applied as seed or substrate treatment. A population flutuation of Trichoderma spp. ocurred when isolates of T. harzianum were added to the soil in the cultivation of tomato and cucumber, in vegetable garden and greenhouse. There was a tendency of the population of Trichoderma spp. to return to the initial parameters, i.e. before the biocontrole agent was added to the soil. The population of bacteria, Fusarium spp. and general fungi did not show great alterations with the presence of the isolates of the biocontrol agent. / Trichoderma spp. é um dos fungos mais pesquisados na atualidade como agente de biocontrole, sendo antagonista a vários fitopatógenos em diferentes culturas, além de auxiliar no desenvolvimento vegetal. O patógeno Fusarium oxysporum causador da murcha de fusário ou fusariose é difícil de ser controlado, principalmente pela sua capacidade em manter-se no solo por longos períodos, mesmo sem a presença do hospedeiro. Estudos da dinâmica populacional de Trichoderma spp., Fusarium spp. e microbiota nativa são necessários, principalmente para observar-se o impacto da adição do agente de biocontrole no ambiente solo. Olerícolas, como pepineiro e tomateiro, são comumente cultivadas na Região Sul, porém são sensíveis a uma gama de doenças, dentre as quais, a fusariose, que figura como principal doença, principalmente em ambiente protegido. Para buscar o controle biológico da fusariose no cultivo do tomateiro e pepineiro por Trichoderma e estudar a dinâmica populacional desse agente de biocontrole quando adicionado ao solo, foram propostos os seguintes objetivos: estudar a distribuição espacial dos gêneros Trichoderma e Fusarium em solo rizosférico e não rizosférico, no cultivo do pepineiro e tomateiro, em horta e estufa; utilizar micro-ambiente para realizar a seleção massal de isolados fúngicos antagônicos a Fusarium solani e Fusarium oxysporum e identificar, em nível de espécie, os isolados fúngicos mais efetivos; verificar a ação de isolados de Trichoderma harzianum no desenvolvimento e na proteção de mudas contra a murcha de fusário do tomateiro e do pepineiro, identificando a melhor forma de aplicação do agente de biocontrole no controle da fusariose; analisar a dinâmica populacional dos gêneros Trichoderma e Fusarium e de parte da microbiota do solo, com a adição de agente de biocontrole, no cultivo do tomateiro e pepineiro, em estufa e horta. Tanto Trichoderma quanto Fusarium foram encontrados em solo rizosférico e não rizosférico de horta e estufa, sendo que Trichoderma foi encontrado em maior número de coletas em solo rizosférico de estufa. O método de seleção massal, em substrato, de isolados fúngicos antagônicos aos patógenos F. solani e F. oxysporum foi eficiente, pois os três isolados de Trichoderma harzianum selecionados, além de reduzirem a população dos patógenos em substrato, foram efetivos contra a fusariose do tomateiro e pepineiro, em tratamento de semente ou de substrato. Ocorreu flutuação populacional de Trichoderma spp. quando isolados de T. harzianum foram adicionados ao solo no cultivo do tomateiro e pepineiro, em horta e estufa. Observou-se uma tendência da população de Trichoderma spp. voltar aos parâmetros iniciais, ou seja, antes do agente de biocontrole ser adicionado ao ambiente solo. A população de bactérias, Fusarium spp. e fungos gerais não apresentou grandes alterações pela presença dos isolados do agente de biocontrole.

Orientador: Wagner Bettiol / Banca: Marcelo Augusto Boechat Morandi / Banca: Eugenio Alfredo Sanfuentes Von Stowasser / Banca: Miguel Angel Dita Rodriguez / Banca: Carlos Gilberto Raetano / Resumo: Os resíduos orgânicos e agentes de biocontrole podem constituir em alternativas no controle dos fitopatógenos habitantes do solo. O trabalho teve por objetivo estudar o controle de Fusarium spp. com resíduos orgânicos e agentes de biocontrole. Inicialmente foi avaliado o efeito de hidrolisado e emulsão de peixe, nas concentrações de 0, 10, 20, 30, 40 e 50% do volume de água para atingir a capacidade de campo do solo; e de alga, casca de camarão, concha de marisco e caroço de abacate moídos, nas concentrações de 0, 1, 2, 3, 4 e 5% v/v, na germinação de microconídios de Fusarium oxysporum f. sp. lactucae, em casa de vegetação. Enquanto a emulsão e o hidrolisado de peixe reduziram a germinação de microconídios do patógeno, os demais resíduos não apresentaram efeito. Também foi avaliado o efeito de resíduos de alga, concha de marisco, casca de caranguejo e repolho triturado fresco, nas concentrações de 0, 1, 2 e 4% v/v, sobre a germinação de microconídios de Fusarium circinatum em condições controladas, e associado ou não, a Trichoderma harzianum, no controle da fusariose (F. circinatum) em plantas de Pinus radiata mantidas em casa de vegetação. Nenhum resíduo reduziu a germinação de microconídios de F. circinatum ou a doença em casa de vegetação. No terceiro estudo foi avaliado o efeito de hidrolisado de peixe nas concentrações de 0, 5, 10, 15 e 20% do volume de água necessário para atingir a capacidade de campo, a partir do solo seco, associados ou não a T. harzianum (Iblf 006) ... / Abstract: The organic residues and biocontrol agent might be alternative in the control of soilborne plant pathogens. This work aimed to study the control of Fusarium species with organic residues and biocontrol agents. First, the effect of fish hydrolyzed and fish emulsion was evaluated, at concentrations of 0, 10, 20, 30, 40 and 50% of volume of water required to reach the water retention capacity of the soil; and the seaweed, shrimp shells, clamshell and grounded avocado seeds at concentration of 0, 1, 2, 3, 4 and 5% v/v in the microconidia germination of Fusarium oxysporum f. sp. lactucae in greenhouse. Fish emulsion and fish hydrolyzed reduced the microconidia germination and none of the other residues presented effect. Also, it was evaluated the effect of seaweed, clamshell, crab shell and fresh triturated cabbage, at concentrations of 0, 1, 2 and 4% v/v, in the germination of Fusarium circinatum microconidia under controlled conditions and associated or not with Trichoderma harzianum in Pinus radiata to control the disease caused by F. circinatum in greenhouse. Neither residue reduced the F. circinatum microconidia germination or the disease in greenhouse. In the third study the effect of fish hydrolyzed was evaluated at concentration of 0, 5, 10, 15 and 20% of volume of water to required to reach the water retention capacity of the soil, from dry soil, associated or not with T. harzianum (Iblf 006) and Bacillus subtilis + Bacillus licheniformis in the control of F. oxysporum ... / Doutor

Orientador: Gabriela Alves Macedo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-10T02:54:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fraga_LairaPriscila_M.pdf: 554432 bytes, checksum: 56119a190bf37124ca4c590d3059597c (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Cutinases são enzimas amplamente encontradas na natureza, podendo ser obtidas de fontes vegetais ou microorganismos. Trata-se de uma esterase que atua tanto como esterase quanto como lipase, capaz de hidrolisar uma ampla variedade de ésteres sintéticos e triglicerídeos. Este perfil de atividade oferece-lhe um número de aplicações importantes nas indústrias como detergentes de roupas e louças, alimentos, fármacos, agroquímicos e cosméticos. Utilizando a fermentação em estado sólido (FES) é possível a produção de uma enzima com características interessantes de catálise, com baixo custo de produção e bom rendimento, e que possa ser empregada na indústria de modo geral. Este trabalho utilizou FES para produção de cutinase por Fusarium oxysporum utilizando sub-produtos agrícolas visando à seleção dos melhores meios e indutores para produção da enzima (utilizando fontes de carbono e minerais), otimização das condições de cultivo (avaliando os parâmetros temperatura e quantidade de água do meio além do estudo do inóculo), produção de cutinases utilizando diferentes substratos (farelo de trigo, casca de soja, farelo de arroz e produzida por meio líquido) e comparação entre eles, além da aplicação das enzimas em reações de esterificação para separação enantiomérica de substâncias racêmicas como o 2-octanol e o Ibuprofeno. De um modo geral o trabalho mostrou a produção de enzima de grande interesse comercial usando substratos diferentes e seu comportamento frente a reações de esterificação. Três meios sólidos foram selecionados (farelo de trigo, casca de soja e farelo de arroz) e suas condições de cultivo otimizadas (temperatura 28ºC e quantidade de água do meio 100%). Nos testes de aplicação das cutinases, para resolução enantiomérica do 2-octanol todas as cutinases tiveram bons valores de esterificação e enantioseletividade com destaque para farelo de trigo (76,4% de esterificação após 200 horas) e casca de soja (71,9% de esterificação após 200 horas). Para resolução do fármaco racêmico Ibuprofeno as cutinases mais efetivas foram as produzidas por farelo de arroz (5,1% de conversão após 200 horas) e meio líquido (2,9% de conversão após 200 horas). Esses resultados mostraram a diferença entre o comportamento de cutinases, do mesmo microorganismo, produzidas em diferentes meios, e a grande possibilidade de utilização de cutinases para processos de interesse industrial / Abstract: Cutinases enzymes are often found in nature and may be obtained from plant sources or microorganisms. This is an enzyme that acts both as esterases and as lipases, capable of hydrolyzed a several variety of synthetic esters and triglycerides. This activity profile gives a number of important applications in industries such detergents, clothes and dishes, foods, drugs, chemicals and cosmetics. Using solid state fermentation SSF it is possible production of an enzyme interesting of catalysis with low production cost and good yields, and it can be employed in the industries. This work used SSF for the cutinase production by Fusarium oxysporum using agro-industrial sub-products to find selection of the best media and inducer to enzyme production (using sources of carbon and minerals), optimization of fermentation conditions (modifying the parameters temperature and water amount and after the inoculum study), cutinases production using different substrates (wheat bran, soy rind, rice bran and produced by liquid medium), comparison among them and enzymes application in esterification reactions to enantiomeric separation of racemic substances such 2-octanol and drug Ibuprofen. In general the work showed enzyme production of great commercial interest using various substrates and their behavior in esterification reactions. Three solid media were selected (wheat bran, soy rind, and rice bran) and their fermentation conditions optimized (temperature 28ºC and water amount 100%). In tests of cutinases application for enantiomeric resolution of 2-octanol all cutinases had good values to esterification and enantioselectivity and the best results was using wheat bran (76.4% of esterification after 200 hours) and soy rind (71.9% of esterification after 200 hours). The test using racemic drug Ibuprofen the more effective resolution was found with cutinase produced by rice bran (5.1% of esterification after 200 hours) and liquid medium (2.9% of esterification after 200 hours). These results showed the difference among behavior of cutinases using same strain, produced by different media, and the great possibility of cutinases with interesting catalysis characteristics and it can be employed in the industry / Mestrado / Mestre em Ciência de Alimentos

Orientadores: Gabriela Alves Macedo, Patricia de Oliveira Carvalho / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-16T15:43:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Speranza_Paula_M.pdf: 2790177 bytes, checksum: c48b32a4db9fbe192ae18d8080a3c523 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: A cutinase (E.C. 3.1.1.74) é uma enzima que catalisa a hidrólise de ligações ésteres da cutina. A cutina é um biopolímero insolúvel em água, composto de ácidos graxos com C16 e C18, e que está presente na superfície externa das partes aéreas das plantas. Estudos têm sido realizados com o objetivo de caracterizar bioquimicamente cutinases produzidas por diferentes processos fermentativos, micro-organismos e meios de cultivo. As cutinases têm-se mostrado bastante estáveis em diferentes condições de análise. O conhecimento das condições ótimas de ação desta classe de enzimas, assim como dos fatores que afetam a sua atividade são de extrema importância para se compreender melhor a atuação e as alterações sofridas por estas enzimas em diferentes condições de estocagem e trabalho. Tendo em vista estas observações, o objetivo deste estudo foi caracterizar bioquimicamente e comparar as cutinases produzidas por Fusarium oxysporum em quatro meios de cultivo sólidos distintos, compostos por farelo de trigo, casca de soja, farelo de arroz e torta de pinhão manso. A caracterização de cada uma dessas enzimas mostrou que estas apresentam temperatura ótima entre 30 e 37°C, temperatura de estabilidade de 30°C para as enzimas produzidas em meios com de farelo de trigo e farelo de arroz e 37°C para as enzimas produzidas em meios com casca de soja e torta de pinhão manso. O pH ótimo de ação das quatro enzimas mostrou-se levemente alcalino, sendo igual a 8,0 nas enzimas produzidas em meios com farelo de trigo, casca de soja e farelo de arroz e 9,0 para a enzima produzida em meio com torta de pinhão manso. O pH em que as quatro enzimas foram mais estáveis foi igual a 6,0. As quatro enzimas apresentaram boa afinidade pelo substrato, com valores de constante cinética (km) que variaram de 0,25 a 0,65 mM. A enzima produzida em meio com casca de soja apresentou a maior velocidade máxima (vmax), 7,86 U/mL. A maioria dos sais minerais testados inativaram ou ativaram pouco as enzimas produzidas em meios com farelo de trigo, casca de soja e farelo de arroz, enquanto que a enzima produzida em meio com torta de pinhão manso foi bastante ativada na presença da maioria dos sais minerais. As enzimas de farelo de trigo, casca de soja e torta de pinhão manso apresentaram maior especificidade por ésteres de cadeia carbônica média (p-nitrofenil caprilato), enquanto que a enzima produzida em meio com farelo de arroz apresentou maior especificidade por ésteres de cadeia curta (p-nitrofenil butirato). A enzima produzida em meio com torta de pinhão manso foi bastante ativa na presença de solventes orgânicos, especialmente o hexano. A eletroforese por SDS-PAGE mostrou uma banda de 27-30 kDa nas enzimas produzidas em meios com farelo de trigo, casca de soja e torta de pinhão manso. Em relação as suas propriedades enantiosseletivas, a enzima produzida em meio com casca de soja foi a que apresentou melhor resultado (E=5,9) / Abstract: Cutinase (E.C. 3.1.1.74) is an enzyme that catalyzes the hydrolysis of esters bonds in cutin. Cutin is a biopolymer insoluble in water composed of fatty acids C16 and C18 and found in the outside surface of the plants¿ aerial parts. Studies have been conducted with the aim of biochemically characterizing the cutinases produced by different fermentation conditions, microorganisms and growth medium. Cutinases have proved to be very stable in different conditions of analysis. The knowledge of optimum conditions of this class of enzymes, as well as of the factors that affect their activity are very important in order to understand the action of such enzymes and the alterations they go through in different conditions of storage and use. Considering that, the objective of this study is to biochemically characterize and compare cutinases produced by Fusarium oxysporum in four different solid growth medium composed of wheat bran, soy rind, rice bran and Jatropha curcas seed cake. The characterization of each one of these enzymes showed that they present the optimum temperature between 30 and 37°C, stability temperature at 30°C for wheat bran and rice bran and 37°C for soy rind and Jatropha curcas seed cake. The optimum pH of action of the four enzymes was little alkaline: 8.0 for the enzymes produced by wheat bran, soy rind and rice bran and 9.0 for the enzyme produced by Jatropha curcas seed cake. The most stable pH for the four enzymes was 6.0. The four enzymes showed good affinity by the substrate, with values of km ranging from 0.25 to 0.65 mM. The enzyme produced in soy rind showed higher value of vmax 7.86 U/mL. Most of the tested mineral salts inactivated or activated just a little the enzymes produced by wheat bran, soy rind and rice bran, whereas the enzyme produced by Jatropha curcas seed cake was very activated in the presence of most of the mineral salts. The enzymes of wheat bran, soy rind and Jatropha curcas seed cake showed more specificity for mediumlength carbonic chain esters (p-NPC), whereas the enzyme of rice rind showed more specificity for short-length chain esters (p-NPB). The enzyme of Jatropha curcas seed cake was very activated by the presence of organic solvents, especially hexane. The electrophoresis by SDS-PAGE showed a band of 27-30 kDa in the enzymes produced by wheat bran, soy rind and Jatropha curcas seed cake. Regarding enantioselectivity proprieties the enzyme produced in soy rind showed the best result (E= 5.9 ) / Mestrado / Mestre em Ciência de Alimentos

Orientador: Glaucia Maria Pastore / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-12T23:31:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bicas_JulianoLemos_D.pdf: 1661445 bytes, checksum: 73851fe13d8b9c41e2fbd0029e3dbb53 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: O objetivo do presente trabalho foi efetuar estudos de biotransformação de substratos terpênicos para a obtenção de compostos de aromas naturais, ou bioaromas, enfatizando os processos bioquímicos envolvidos nos procedimentos empregados e a otimização da produção para possíveis aplicações industriais. Assim, o estudo se iniciou com o isolamento de quase 300 linhagens, das quais 121 mostraram-se resistentes a concentrações de 2% de R-(+)-limoneno e 70 foram capazes de utilizar este substrato como única fonte de carbono. Dentre todas as linhagens potencialmente degradantes do R-(+)-limoneno, nenhuma mostrou acúmulo significativo de metabólito de interesse em concentrações que justificassem estudos de otimização. A seguir, o método de Superfície de Resposta foi empregado para otimizar os principais parâmetros do processo de produção de R-(+)-a-terpineol a partir do R-(+)-limoneno pelo fungo Fusarium oxysporum 152b. Dentre os 10 parâmetros analisados (concentração de glicose, peptona, extrato de malte e de levedura no meio de biotransformação; concentração de R-(+)- limoneno; concentração de biosurfactantes; temperatura; agitação; pH; tamanho do inóculo), três (concentração de substrato, temperatura e agitação) influenciaram significativamente (p < 0,10) a produção de R-(+)-a-terpineol, dentro das faixas estudadas. A otimização dessas variáveis por um Delineamento Composto Central Rotacional revelou que as condições ótimas para a biotransformação foram de 0,5% de R-(+)-limoneno, 26 °C e 240 rpm, resultando em uma concentração de cerca de 2,4 g.L-1 de R-(+)-a-terpineol ao final de 72 h de processo. Aproveitando-se do fato de essa linhagem fúngica ser reconhecida pela produção de lípase alcalina, um sistema integrado de produção foi posteriormente proposto a fim de explorar todo potencial biotecnológico do microrganismo. Assim, a biomassa resultante da produção de lipase, antes descartada, foi avaliada quanto à preservação da atividade de biotransformar o R-(+)- limoneno. Os resultados demonstraram ser possível a coprodução de lipase/R-(+)-a-terpineol, apesar de que o rendimento máximo do bioaroma foi cerca de 50% inferior quando comparado ao do procedimento convencional. Os estudos com duas linhagens bacterianas (Pseudomonas rhodesiae CIP 107491 e P. fluorescens NCIMB 11671) para a bioconversão de alguns monoterpenos indicaram a presença de uma via metabólica envolvendo ß-pineno, a-pineno, a-pineno oxido, isonovalal e ácido dimetil pentanóico para ambas espécies, além de outras duas vias de degradação do limoneno para P. fluorescens. Nesse caso, a bactéria usava o limoneno como única fonte de carbono e energia, passando por limoneno-1,2-diol, e também hidroxilava este substrato na posição 8 formando R-(+)-a-terpineol como forma de diminuir a toxicidade do substrato (metabolismo de xenobióticos). Essa última via ocorria em ausência de cofatores graças à ação de uma hidratase enantioespecífica capaz de converter anaerobicamente R-(+)-limoneno a R-(+)-a-terpineol e S-(¿)-limoneno a S-(¿)-a-terpineol em meios bifásicos, empregando n-hexadecano como fase orgânica. Foi posteriormente demonstrado que os rendimentos e produtividade poderiam ser significativamente elevados e que a produção poderia ser mais que duplicada (de ~10 para ~25 g.L-1) com o uso de fases orgânicas não convencionais, como óleos vegetais. Finalmente, estudos preliminares de avaliação do potencial bioativo do principal produto relatado nessa tese demonstraram que o a-terpineol revelou uma elevada capacidade de absorção de radical de oxigênio (ORAC) e atividade antiploriferativa contra cinco linhagens de células cancerosas, apesar da baixa atividade de captura de radical DPPH. Esses resultados abrem precedentes para que pesquisas in vivo sejam consideradas a fim de determinar o potencial funcional desse bioaroma, algo ainda praticamente inexplorado / Abstract: The objective of the present work was to study the biotransformation of terpene substrates to obtain natural flavor compounds (bioflavors), focusing the biochemical processes involved in the procedures investigated and optimization of production for possible industrial applications. Therefore, the study started with the isolation of more than 300 wild strains followed by the selection of 121 capable of resisting to 2% (v.v-1) of R-(+)-limonene and 70 that could use this terpene as sole carbon and energy source. None of the strains tested showed accumulation of intermediate metabolites in levels that justified further optimization studies. Subsequently, the Response Surface Methodology was employed to optimize the main parameters of the process of biotransformation of R-(+)-limonene to R-(+)-a-terpineol by the fungal strain Fusarium oxysporum 152b. Only three (R-(+)-limonene concentration, temperature and agitation) of the ten parameters tested (concentration of glucose, peptone, malt extract and yeast extract; substrate concentration; biosurfactant concentration; temperature; agitation; pH; inoculum size) influenced significantly (p < 0.1) the R-(+)-a-terpineol production. The optimization of these variables applying a Central Composite Design revealed that the optimal biotrasformation conditions were 0.5% of R-(+)-limonene, 26 °C and 240 rpm, resulting in a R- (+)-a-terpineol concentration close to 2,4 g.L-1 after a 72 h. Since this fungus has been recognized for its high alkaline lipase production, an integrated process was proposed to explore the full biotechnological potential of this microorganism. Therefore, the biomass resulting from the lipase production, which was previously discharded, was tested to evaluate the preservation of R-(+)-limonene-biotransformation activity. The results have shown that the co-production of lipase/R-(+)-a-terpineol was feasible, although the maximal yield of the bioflavor was approximately 50 % lower when compared to the conventional process. The studies with two pseudomonad strains (Pseudomonas rhodesiae CIP 107491 e P. fluorescens NCIMB 11671) for the conversion of some monoterpenes indicated the presence of one metabolic route involving ß-pinene a-pinene a-pinene oxide, isonovalal and dimethyl pentanoic acid for both species, besides two other pathways for the degradation of limonene by P. fluorescens. In this case, the bacterium used the substrate as sole carbon and energy source, with limonene-1,2-diol as intermediate, and also hydroxylated limonene in the position 8 to R-(+)-a- terpineol as a detoxifying strategy (xenobiotic metabolism). The last pathway occurred in the absence of cofactors due to the action of an enantiospecific hydratase capable of converting anaerobically R-(+)-limonene to R-(+)-a-terpineol and S-(¿)-limonene to S-(¿)-a-terpineol in biphasic mediums, employing n-hexadecane as organic phase. It was later demonstrated that the yields and productivities could be significantly enhanced and that the final concentration of the product could be more than duplicated (from ~10 to ~25 g.L-1) if unconventional organic phases (vegetable oils) were used. Finally, preliminary studies evaluating the bioactive potential of the main product reported in this thesis have revealed that the a-terpineol demonstrated an oxygen radical absorbance capacity (ORAC) and an antiproliferative activity against five cancer lines, although the DPPH radical scavenging activity was low. These results encourages in vivo research to determine the functional potential of this bioflavor, something practically unexplored / Doutorado / Doutor em Ciência de Alimentos

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The objectives of this study were to identify lines of common bean, previously characterized as resistant to fusarium wilt under controlled conditions, which combine resistance to fusarium wilt in the field and other favorable characters; obtain and select segregating populations of common bean with black beans resistant to fusarium wilt, with high grain yield and commercial grain size; select promising black bean lines with resistance to fusarium wilt, high grain yieldy and mass of 100 grains; estimate correlations and genetic and phenotypic parameters for these three characters. In the evaluation of the elite lines previously obtained as resistant to fusarium wilt, the tests were conducted in a randomized block design with three replications and plots consisting of four rows of four meters. Six lines were used, one carioca and five black beans, along with five cultivars in 28 experiments, between the years 2009 to 2011, in wet, winter and rainy growing seasons, at Paraná, Distrito Federal and Goiás States. In these trials were carried out evaluations for grain yield, plant architecture, lodging tolerance, reaction to fusarium wilt and reaction to anthracnose. Variance and mean grouping test analyzes were performed for the data obtained from five traits and analysis of adaptability and stability was realized for grain yield, using the method Nunes. For obtaining and selecting segregating populations under field conditions, the segregating populations were obtained from crosses in complete diallel scheme. Crosses were realized with eight lines with black granis and with different levels of resistance to fusarium wilt. The trials were composed by 28 populations obtained and two cultivars, one resistant and one susceptible to fusarium wilt. The populations obtained were evaluated in a randomized block design with three replications, in F2, F3 and F4, in winter/2012, winter/2013 and winter/2014, respectively. The three trials were conducted in Santo Antônio de Goiás in field infested by Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli under irrigation by central pivot. The reaction to fusarium wilt, grain yield and weight of 100 grains were evaluated. Analyses were performed for individual and joint variance and for reaction to fusarium wilt was also carried out diallel analysis according Griffing (1956). Means were grouped using the Scott knot test. From the data obtained, two segregating populations were selected. 58 lines from each population were obtained, totalizing 116 lines which were evaluated with five controls. The evaluation of the lines was carried out in the winter/2015 in triple lattice design 11x11 with plots of two lines of 3 meters, also in Santo Antônio de Goiás - GO, in naturally infested area. There is variability in reaction to fusarium wilt, grain yield, plant architecture, lodging tolerance and reaction to anthracnose, among the lines evaluated. The genotype x environment interaction is important for the five characters evaluated. The five lines of black beans (CNFP 15867, CNFP 15870, CNFP 15869, CNFP 15868 and CNFP 15871) were resistant to fusarium wilt. Already CNFC 15872 line, with carioca grain, showed moderately susceptible. The CNFP 15867 and CNFP 15870 lines showed potential for use in breeding. BRS Esplendor cultivars and BRS Notavel are also good choices for planting in areas with fusarium wilt, with good agronomic performance. Regarding the evaluation of segregating populations was detected genetic variability for the three characters. The diallel analysis for reaction to wilt fusarium showed difference between the general combining ability (CGC) of parents and between the specific combination capacity (CEC) of the populations. The resistance to fusarium wilt was explained by additive and non-additive effects. The CNFP 15867 line showed positive estimate of CGC, been indicated for new crosses. Considering together, the mean of population for all traits and diallel analysis for reaction to fusarium wilt, populations BRS Esplendor x BRS Expedito and BRS Expedito x CNFP 15867 were selected. Considering the lines obtained from these two populations, the estimates of heritability, genetic variance and gain expected selection were high for the three traits, indicating good chance of successful selection. Considering the simultaneous selection, it was possible to obtain gains for the three traits, especially for reaction to fusarium wilt (31%). Eight lines have been identified that meet resistance to fusarium wilt, high grain yield and good grain size. There was a significant genetic correlation between fusarium wilt and grain yield, so lines resistant to fusarium wilt present high grain yield. / A murcha-de-fusário, causada pelo fungo Fusarium oxysporium f sp phaseoli, é considerada uma das doenças mais importantes que acometem a cultura do feijoeirocomum, sobretudo em áreas de cultivos intensos e sucessivos na safra de inverno. Existem poucas informações acerca da variabilidade do patógeno e poucas cultivares de feijoeiro-comum utilizadas no Brasil são resistentes. Assim, os objetivos deste trabalho foram: identificar linhagens elite de feijoeiro-comum, previamente caracterizadas como resistentes à murcha-de-fusário em condições controladas, que associem resistência à murcha-de-fusário em campo e outros caracteres favoráveis; obter e selecionar populações segregantes de feijoeiro-comum com grãos pretos resistentes à murcha-de-fusário, com alta produtividade e tamanho comercial de grãos; selecionar linhagens de grãos pretos promissoras com resistência à murchade- fusário, alta produtividade e massa de 100 grãos; estimar correlações e parâmetros genéticos e fenotípicos para esses três caracteres. Na avaliação das linhagens elite previamente obtidas como resistentes à murcha-de-fusário, os ensaios foram conduzidos em delineamento blocos ao acaso, com três repetições e parcelas constituídas de quatro linhas de quatro metros. Foram avaliadas seis linhagens, sendo uma do tipo carioca e cinco de grãos pretos, juntamente com cinco cultivares, em 28 experimentos, entre os anos de 2009 a 2011, nas safras da seca, inverno e das águas, nos Estados de Paraná, Distrito Federal e Goiás. Nesses experimentos foram realizadas avaliações para produtividade de grãos, arquitetura de plantas, tolerância ao acamamento, reação à murcha-de-fusário e reação à antracnose. Foram realizadas análises de variância e testes de agrupamento de médias para os dados obtidos dos cinco caracteres e análise de adaptabilidade e estabilidade para a produtividade de grãos, utilizando o método de Nunes. Para a obtenção e seleção de populações segregantes, em condições de campo, as populações segregantes foram obtidas a partir de cruzamentos em esquema de dialelo completo sem recíprocos. Foram cruzadas oito linhagens/cultivares de feijoeiro-comum com grãos pretos com níveis diferenciados de resistência à murcha-de-fusário. Os ensaios foram compostos pelas 28 populações obtidas nos cruzamentos e duas testemunhas, sendo uma resistente e outra suscetível à murcha-de-fusário. As populações obtidas foram avaliadas em delineamento em blocos casualizados com três repetições, nas gerações F2, F3 e F4, nas safras de inverno/2012, inverno/2013 e inverno/2014, respectivamente. Os três ensaios foram conduzidos em Santo Antônio de Goiás em campo infestado por Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli sob irrigação por pivô central. Foram avaliadas a reação à murcha-de-fusário, produtividade e massa de 100 grãos. Realizaram-se análises de variância individual e conjunta e para reação a murcha-de-fusário também foi realizada análise dialélica segundo Griffing (1956). As médias foram agrupadas utilizando-se o teste de scott knot. A partir dos dados obtidos, foram selecionadas duas populações segregantes, das quais foram obtidas 58 linhagens de cada uma, totalizando 116 linhagens, que foram avaliadas juntamente com cinco testemunhas. A avaliação das linhagens foi realizada na safra de inverno/2015, em delineamento látice triplo 11x11, com parcelas constituídas de duas linhas de 3 metros, também em Santo Antônio de Goiás – GO, em área infestada naturalmente. Existe variabilidade para reação à murcha-de-fusário, produtividade de grãos, arquitetura de plantas, tolerância ao acamamento e reação à antracnose, entre as linhagens avaliadas. A interação genótipos x ambientes é importante para os cinco caracteres avaliados. As cinco linhagens de grãos pretos (CNFP 15867, CNFP 15870, CNFP 15869, CNFP 15868 e CNFP 15871) foram resistentes à murcha-de-fusário. Já a linhagem CNFC 15872, de grão carioca, apresentou-se moderadamente suscetível. As linhagens CNFP 15867 e CNFP 15870 apresentaram potencial para utilização em novos cruzamentos, entretanto, não superaram as melhores testemunhas. As cultivares BRS Esplendor e BRS Notável ainda são boas opções para plantio em áreas com incidência de murcha-de-fusário, apresentando bom desempenho agronômico. Com relação à avaliação das populações segregantes, detectou-se variabilidade genética para os três caracteres. A análise dialélica para reação à murcha-de-fusário mostrou diferença entre as capacidades gerais de combinação (CGC) dos genitores e entre as capacidades específicas de combinação (CEC) das populações. A resistência a murcha-de-fusário foi explicada pelos efeitos aditivos e não-aditivos. A linhagem CNFP 15867 apresentou estimativa positiva de CGC, sendo indicada para realização de novos cruzamentos. Considerando em conjunto, a média das populações para todos os caracteres e a análise dialélica para reação à murcha-de-fusário, foram selecionadas as populações BRS Esplendor x BRS Expedito e BRS Expedito x CNFP 15867. Considerando as linhagens obtidas dessas duas populações, as estimativas de herdabilidade, variância genética e ganho esperado com a seleção foram elevadas para os três caracteres, indicando boa possibilidade de sucesso com a seleção. Considerando a seleção simultânea, foi possível obter ganhos para os três caracteres, com destaque para a reação à murcha-de-fusário (31%). Foram identificadas oito linhagens que reúnem resistência à murcha-de-fusário, alta produtividade e bom tamanho de grão. Foi identificada correlação genética significativa entre murcha-defusário e produtividade de grãos, portanto linhagens resistentes à murcha-de-fusário são mais produtivas.

Fusarium oxysporum f.sp. cubense Schlecht (Foc), causal agent of Fusarium wilt of banana (Panama disease), is considered to be one of the most serious threats to banana production in the world. There is no effective control measure for Fusarium wilt, except for the replacement of susceptible with resistant banana varieties. However, resistant varieties are not always acceptable to producers and local consumer markets. A greater awareness of the detrimental effect of chemicals on the environment has stimulated research on biological control of plant pathogens. The use of indigenous microorganims, such as non-pathogenic F. oxysporum and the bacterium Pseudomonas fluorescens, therefore, offers not only an environmentally safe but also an economical approach to combat Fusarium wilt of banana as part of an integrated disease management strategy. Non-pathogenic F. oxysporum and P. fluorescens isolates have previously been isolated from the root rhizosphere in disease suppressive soils. These isolates have the ability to reduce the incidence of Fusarium wilt in greenhouse pathogenicity trials. In this study we had hoped to expand on existing knowledge on the biological control of Fusarium wilt of banana with non-pathogenic endophytic F. oxysporum and P. fluorescens. Isolates that significantly suppress disease development in greenhouse trials were tested under field conditions. Physiological and histological studies were also performed to understand the modes of action of putative biological control agents. For the histological investigations, non-pathogenic F. oxysporum isolates were modified with green and red fluorescent proteins. Chapter 1 depicts a general overview of the biological control of Fusarium wilt diseases of agricultural crops. This chapter addresses the biology and pathogenesis of F. oxysporum, before strategies to control Fusarium wilt are discussed. The application of biological control organisms was analysed in terms of potentially useful organisms, where they can be isolated, and their possible modes of action. Finally, factors that influence biological control of Fusarium wilt diseases are discussed. A good source of prospective biocontrol agents is suppressive soils. In Chapter 2, non-pathogenic F. oxysporum isolates were collected from healthy banana roots in disease suppressive soil. Random Fragment Length Polymorphisms of the intergenic spacer region were then applied to group the non-pathogenic F. oxysporum isolates into genotypes, from which candidates were selected for biological control studies. The selected endophytes were then inoculated onto banana roots to determine their ability to act as biocontrol agents against Foc. The isolates that protected banana best against Fusarium wilt in the greenhouse, together with P. fluorescens WCS 417, were tested in the field to determine whether these isolates could effectively reduce disease incidence in an uncontrolled environment. The ability of non-pathogenic F. oxysporum and P. fluorescens WCS 417 to induce systemic resistance in Cavendish banana plants against Foc was investigated in Chapter 3 with the use of a split-root technique. The putative biocontrol agents were inoculated, separately and in combination, on one half of the roots in a split-root experiment, while the other half was challenged by a pathogenic isolate of Foc. Five different phenolic acids were assayed which included total soluble phenolic acids, non-conjugated (free acids) phenolic acids, ester-bound phenolic acids, glycosidebound phenolic acids and cell wall-bound phenolic acids. The knowledge gained will contribute to the understanding of how the biocontrol agents may induce defense responses in banana roots against Foc. Non-pathogenic isolates of F. oxysporum were transformed with the green fluorescent protein (GFP) and DsRed-Express genes in Chapter 4. These isolates were used to visualise their interactions with a GFP-transformed Foc isolate on the banana root in a non-destructive manner by means of confocal laser scanning microscopy (CLSM) in Chapter 5. The ability of non-pathogenic F. oxysporum and P. fluorescens WCS 417 to induce structural changes was also investigated with a split-root system using the CLSM. Antibioses as a mode of action of the two potential biocontrol agents was tested in vitro. Understanding the modes of action of non-pathogenic F. oxysporum and P. fluorescens WCS 417 are important when considering strategies for the implementation of these isolates in an integrated disease management strategy against Fusarium wilt of banana. / Dissertation (MSc (Plant Pathology))--University of Pretoria, 2011. / Microbiology and Plant Pathology / unrestricted