Doctor en Bioquímica / Autorizada por el autor, pero con restricción para ser publicada a texto completo hasta diciembre de 2015, en el Portal de Tesis Electrónicas / El péptido similar a glucagón-1 (GLP-1) es una incretina secretada por las células intestinales. Su acción clásica es regular la respuesta secretoria de insulina por el páncreas. Sin embargo, recientemente se ha descrito que GLP-1 posee acciones extrapancreáticas muy similares a la insulina, con mecanismos de señalización tejido-específicos. Por sus muchas acciones fisiológicas, y la mayoría relacionadas con los efectos insulinotrópicos de esta incretina, derivados peptidomiméticos de GLP-1 se utilizan actualmente para controlar la hiperglicemia en individuos con diabetes mellitus tipo 2. Debido a esto se hace muy interesante investigar su acción específica sobre distintos tipos celulares que sufren alteraciones en patologías relacionadas con alteraciones metabólicas asociadas a la diabetes mellitus. En particular, se hace muy interesante estudiar el efecto de GLP-1 sobre las células vasculares musculares lisas (VSMC). Estas células responden a variadas señales ambientales fisiopatológicas o bioquímicas, regulando su función y su fenotipo. Sin embargo, aún no se comprende la totalidad de mecanismos involucrados en los cambios fenotípicos que ocurren en estas células en patologías como la diabetes. Evidencias recientes han involucrado a las alteraciones metabólicas que sufren las VSMC con la mayor incidencia de aterosclerosis en pacientes diabéticos. Las mitocondrias son los principales organelos asociados con el control del metabolismo energético dentro de una célula. Actualmente, se sabe que procesos subcelulares tales como la interacción mitocondria-retículo endoplásmico y los fenómenos de fusión y fisión mitocondrial, conocido como dinámica mitocondrial, son capaces de regular la función y el metabolismo mitocondrial. La dinámica mitocondrial está finamente regulada por las proteínas Mitofusinas 1/2 y OPA-1 para el caso del proceso de fusión, y Drp-1 y Fis-1 para el caso del proceso de fisión mitocondrial. Se ha descrito un papel trascendental para la proteína Drp-1 en la regulación del proceso de fisión, ya que puede sufrir modificaciones postraduccionales que modulan su interacción con la mitocondria generando cambios en el proceso de fisión. Dentro de las modificaciones postraduccionales de Drp-1 se destaca una fosforilación inhibitoria por PKA. Debido a que el receptor clásico de GLP-1 es una proteína de siete dominios de transmembrana acoplada a proteína Gs, la activación por GLP-1 de este receptor aumentaría los niveles intracelulares de cAMP activando PKA, pudiendo regular potencialmente el proceso de fisión mitocondrial vía Drp-1. Esta regulación podría ser un nuevo mecanismo por el cual GLP-1 podría regular, vía el control de la dinámica, el metabolismo mitocondrial y por ende el metabolismo celular. Con todos estos antecedentes se propuso como hipótesis que GLP 1 inhibe el proceso de fisión mitocondrial, incrementando el metabolismo mitocondrial a través de la fosforilación de Drp 1, en células de la línea A7r5. Para probar esta hipótesis, células A7r5 correspondientes a células embrionarias de VSMC de aorta de rata se trataron con GLP-1 (100 nM) por 0 – 24 h y se incubaron con la sonda Mitotracker Orange en los últimos 30 min de exposición a la hormona. Posteriormente, las células se visualizaron en un microscopio confocal, la red mitocondrial se reconstruyó tridimensionalmente a partir de las imágenes obtenidas, determinándose el número, volumen promedio y área promedio de las mitocondrias. Los resultados muestran que GLP-1 inhibió el proceso de fisión de la red mitocondrial a las 3 h de tratamiento, lo cual se evidenció por un aumento del volumen y el área mitocondrial promedio. Además, en estas condiciones, los niveles de la proteína constitutiva mitocondrial mtHsp70 no se modificaron en relación a los controles, descartando que GLP-1 induzca biogénesis mitocondrial. El metabolismo mitocondrial se evaluó mediante la determinación de potencial de membrana mitocondrial, usando la sonda JC1; producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), usando la sonda dihidrocloro fluoresceína; niveles intracelulares de ATP, usando lucifenina/luciferasa; y tasa de respiración, medido por oxigrafía. GLP-1 (100 nM) aumentó el potencial de la membrana mitocondrial, los niveles de ROS, los niveles intracelulares de ATP y el consumo de oxígeno. Se demostró que en células A7r5, GLP-1 activa a la vía transduccional dependiente de PKA. Además, mediante inmunoprecipitación de Drp-1 y posterior detección de la fosforilación de Drp-1 por Western blot se determinó que GLP-1 induce la fosforilación de Drp-1 de una manera similar a la inducida por forskolina. Además, mediante inmunofluorecencia se observó que GLP-1 previene la translocación de Drp-1 a la mitocondria. Utilizando H-89, un inhibidor específico de PKA, se demostró que la inhibición del proceso de fisión mitocondrial es dependiente de la activación de PKA. Posteriormente, se analizó la dependencia de la vía PKA para la acción de GLP-1 sobre el metabolismo mitocondrial. H-89 revertió el efecto de GLP-1 sobre el potencial de membrana mitocondrial y el incremento de los niveles de ROS. En resumen, los datos obtenidos permite sugerir que GLP-1 aumenta el metabolismo mitocondrial en las células A7r5 por un mecanismo que involucra la inhibición del proceso de fisión mitocondrial y la fosforilación de Drp-1 a través de una vía transduccional dependiente de PKA / Glucagon like peptide-1 (GLP-1) is an incretin hormone secreted by intestinal cells. Its classical action is to regulate insulin secretion in the pancreas. However, recently extrapancreatic insulinotropic actions of GLP-1 were described involving tissue-specific signaling pathways. Because GLP-1 have a variety of physiological actions mainly related with its insulinotropic actions, currently GLP-1 peptide mimetics are used to treat hyperglycemia in diabetes mellitus type 2 patients. For this reason, GLP-1 actions on different cell types that undergo pathological metabolic alterations related with diabetes mellitus are very interesting to explore. Particularly, we have focused on GLP-1 effects on vascular smooth muscle cells (VSMC). These cells can regulate both function and phenotype depending on biochemical and physiopathological environmental signals. However, mechanisms involved in VSMC phenotypic change in diseases such as diabetes are just beginning to be understood. Recent evidences have associated the existence of metabolic alterations in VSMC with an increase of atherosclerosis in diabetic patients. Mitochondria are the main organelle that controls energetic metabolism within cells. Specifically, subcellular events such as the interaction between mitochondria and endoplasmic reticulum and mitochondrial fusion and fission (i.e. mitochondrial dynamics) regulate mitochondrial function and metabolism. Mitochondrial dynamics is regulated by proteins, Mitofusins 1/2 and OPA-1 control fusion, and Drp-1 and Fis-1 control fission. Drp-1 has an important role in fission control, because it can be post-translationally modified, changing its interaction with mitochondria and affecting the mitochondrial fission rate. The most important post-translational modification is an inhibitory phosphorylation by PKA. The classical GLP-1 receptor (GLP-1R) is a seven transmembrane Gs-protein coupled receptor, and its activation causes an increase of cAMP levels activating PKA. Because this PKA activations GLP-1R could potentially regulates mitochondrial fission by Drp-1 phosphorylation. This regulation could be a novel GLP-1-dependent mechanism to control mitochondrial dynamics, mitochondrial metabolism and cellular metabolism. Consequently, we hypothesized that GLP-1 decreases mitochondrial fission and increases metabolism through Drp-1 phosphorylation in the A7r5 cell line. To test this hypothesis, A7r5 cells (rat embryonary aortic VSMC) were exposed to GLP-1 (100 nM) for 0 – 24 h and incubated with Mitotracker Orange dye in the last 30 min of “the hormone treatment”. Later, cells were observed under confocal microscope, mitochondrial network was reconstructed from images obtained, and number, average volume and area were determined. Our findings showed that GLP-1 decreased mitochondrial fission at 3 h, evidenced by the increase in mitochondrial volume average and area. These events did not affect mitochondrial constitutive mtHsp70 protein levels, discarding mitochondrial biogenesis induced by GLP-1. Mitochondrial metabolism was evaluated by measuring mitochondrial membrane potential, using JC1 dye; reactive oxygen species (ROS), by dihydrochloro fluorescein dye; intracellular ATP level, using luciferin/luciferase; and respiration rate, by oxygraphy. GLP-1 (100 nM) increased mitochondrial membrane potential, ROS levels, ATP content and oxygen consumption. We demonstrated that GLP-1 activates PKA signaling pathway in A7r5 cells. Moreover, through Drp-1 immunoprecipitation and phospho-Drp-1 detection by Western blot, we showed that GLP-1, as well as forskolin, induced Drp-1 phosphorylation. Consequently, Drp-1 translocation to the mitochondria was prevented by GLP-1, as determined by immunofluorescence. Using the PKA specific inhibitor, H-89, it was demonstrated that GLP-1 decreased mitochondrial fission depends on PKA activation. Subsequently, PKA dependence on GLP-1-induced mitochondrial metabolism was explored. We determined that H-89 prevented GLP-1 effects on both mitochondrial membrane potential and ROS production. In summary, our data suggest that GLP-1 increases mitochondrial metabolism in A7r5 cells by a mechanism involving mitochondrial fission and Drp-1 phosphorylation through a PKA-dependent signaling pathway / FONDECYT FONDAP ANILLO ACT1111

El presente estudio tuvo por objetivo inmunolocalizar la distribución de las células enteroendocrinas L, productoras del péptido similar al glucagón (GLP-1), en el intestino de alpacas. Una incretina de gran importancia debido a su función reguladora de la glucemia. Se utilizaron 36 crías de alpaca de 0-45 días de edad y adultos, distribuidos en 7 grupos etáreos. 0 días= <24h, 1-7 días, 8-15 días, 16-21 días, 27-34 días, 35-45 días y adultos. Las muestras intestinales fueron procesadas por inmunohistoquímica usando el anticuerpo monoclonal antiGLP-1. Las células positivas fueron contadas en 15 ejes cripta-vellosidad de cada porción intestinal en cada animal. Los resultados evidencian, respecto de los grupos etáreos, que en el dia 0, el yeyuno es la porción que contiene mayor número de células L (productoras de GLP-1); mientras que, en los otros grupos son yeyuno e íleon. Respecto a la ubicación, se determina en duodeno un aumento significativo (p<0.05) de células L desde los 8 días en adelante; en yeyuno el mayor número de células se encuentra a los 0 días; en íleon el mayor número celular se encuentra desde los 8 a 45 días; y en el colon el mayor número lo encontramos en los adultos. Se concluye que las células L en alpacas se encuentran presentes desde el nacimiento mayoritariamente en yeyuno e íleon.

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado de Doctora en Ciencias Farmacéuticas / No autorizada por el autor para ser publicada a texto completo en el Portal de Tesis Electrónicas / Para probar este concepto, se sintetizaron en fase sólida tres nuevos análogos del GLP-1, los cuales fueron caracterizados por cromatografía líquida y espectrometría de masas. Adicionalmente, a los péptidos se les evaluó su estructura secundaria por dicroísmo circular y su actividad insulinotrópica in vitro en la línea celular de páncreas Beta-TC-6. Posteriormente se prepararon y caracterizaron fisicoquímicamente los conjugados obtenidos; para ello se utilizaron técnicas de espectrofotometría UV-visible, microscopía electrónica de transmisión, potencial zeta y dispersión dinámica de la luz. Finalmente se evaluó la estabilidad de los conjugados, se estudió su permeabilidad intestinal, utilizando un sistema in vitro basado en un cocultivo de células de adenocarcinoma de colon humano y mucosecretoras (Caco-2/goblet), y además se determinó la actividad hipoglicemiante in vivo de uno de los péptidos y su respectivo conjugado a AuNP, después de una administración intraperitoneal en ratas. Los resultados obtenidos revelaron que los tres péptidos sintetizados: GLP-1(7- 37)-Lys(Acet), GLP-1(7-37)-Lys(Cys) y GLP-1(7-37)-Lys(PegCys), tienen una conformación de tipo α hélice en disolución acuosa y presentan una actividad insulinotrópica similar a la de la incretina endógena GLP-1. Sin embargo, generan conjugados que difieren en estabilidad y capacidad de penetrar el epitelio intestinal, probablemente debido al tipo de interacción que generan con las AuNP. De esta forma, los conjugados de los péptidos que contienen cisteína (péptidos tiolados) resultaron ser más estables que el del péptido sin cisteína, frente al pH gástrico e intestinal, pues generan una interacción de tipo Au-S que le otorga una mayor estabilidad estérica al sistema coloidal. Por otra parte, el conjugado de AuNP al péptido GLP-1(7-37)-Lys(PegCys) fue el que penetró en mayor medida la monocapa de células, encontrándose aproximadamente un 0.016 % de oro después de 4 h de incubación, mientras que con los otros conjugados el nivel de oro no superó el 0.008 %. Además los péptidos y sus conjugados a AuNP no presentaron toxicidad en los sistemas celulares empleados (Beta-TC-6 y Caco-2/goblet, respectivamente). Finalmente, de la evaluación de la actividad hipoglicemiante in vivo se obtuvo que la eficacia hipoglicémica para el análogo GLP-1(7-37)-Lys(PegCys) y su conjugado a AuNP fue similar a la de la incretina endógena (18.7 ± 6.67 %, 27.6 ± 6.33 % y 22.1 ± 8.26 %, respectivamente), revelando que tanto la modificación realizada en el extremo C- terminal de GLP-1, como la presencia de la AuNP, no afectan su bioactividad. De esta forma, el sistema de entrega desarrollado en esta Tesis demostró penetrar las células intestinales en diferentes grados, y disminuir los niveles de glicemia in vivo de una manera similar al péptido endógeno después de su administración intraperitoenal, revelando que este tipo de sistemas es capaz de atravesar barreras biológicas y que la conjugación al nanomaterial no afecta la actividad de la biomolécula, por lo que podría convertirse en una estrategia para la entrega de biomacromoléculas con aplicación en diabetes / Generally, the therapeutic potential of peptides and proteins is hampered by their physicochemical characteristics, which prevent their successful delivery. In this regard, GLP-1 is a peptide incretin that has great therapeutic usefulness due to their interesting action on glucose metabolism, so it is currently an excellent candidate option for the treatment of the type 2 Diabetes Mellitus. However, as a peptidic macromolecule, GLP- 1 has a poor permeability across the intestinal epithelium and is very susceptible to the enzymatic degradation. To overcome these drawbacks some efforts have been made to improve its therapeutic efficacy, such as development of metabolically stable analogs, but very few studies have been focused on the study of the delivery systems to prolong their action and improve its bioavailability. In this Thesis the study of a potential delivery system based on the use of gold nanoparticles (AuNP) for biomacromolecules, such as GLP-1, is presented. This system searches for to increase the permeability of peptides across the intestinal epithelium and enhance its bioavailability while retaining the biological activity of the biomolecules. Thus, a nanoscale delivery system was developed, wherein GLP-1 analogues were conjugated to the surface of AuNP. To probe this concept, three new analogs of GLP-1 on solid phase were synthesized; the peptides were characterized by liquid chromatography and mass spectrometry and additionally their secondary structure and in vitro insulinotropic activity, using Beta-TC-6 pancreatic cells, were evaluated. Subsequently, the conjugates were physicochemically characterized by UVvisible spectrophotometry, transmission electron microscopy, zeta potential and dynamic light scattering. Finally, the stability of the conjugates and their intestinal permeability, using a mucosecretory in vitro system based on human colon adenocarcinoma cells (Caco-2) and goblet cells were studied. Additionally, the in vivo hypoglycemic activity after intraperitoneal administration en rats of one of the peptides and its conjugate was also determinate. The results revealed that all three peptides synthesized: GLP-1(7-37)-Lys(Acet), GLP-1(7-37)-Lys(Cys) and GLP-1(7-37)-Lys(PegCys), have an α helix conformation in solution, and equal insulinotropic activity than the endogenous incretin GLP-1. However, their conjugates differ in stability and ability to penetrate the intestinal epithelium, probably due to the difference in the interaction with the AuNP. In this way, the conjugates of the peptides containing cysteine (thiolated peptides) were more stable, to the gastric and intestinal pH, than the peptide without cysteine because generate an interaction of Au-S that gives a greater steric stability to the colloidal system. Moreover, the conjugate of GLP-1(7-37)-Lys (PegCys) to AuNP penetrated the cell monolayer in a greater extent than the others, being found about 0.016 % gold after 4 h of incubation, while with the other conjugated the gold level did not exceed 0.008 %. In addition, peptides and their conjugates to AuNP did not show toxicity at cell systems used (Beta-TC-6 and Caco-2/goblet, respectively). Finally, the evaluation of the in vivo hypoglycemic activity showed that the hypoglycemic efficacy for the GLP-1(7-37)-Lys (PegCys) analogue and its AuNP conjugate were similar to the endogenous incretin (18.7 ± 6.67 %, 27.6 ± 6.33 % and 22.1 ± 8.26 %, respectively), revealing that the modification in the C-terminal of the GLP-1 molecule and the presence of the AuNP, do not affect its bioactivity. Thereby, the delivery system developed in this Thesis showed penetrate the intestinal cells in different degrees, and decrease blood glucose levels in vivo in a similar way to the endogenous peptide after intraperitoenal administration, revealing that this type of system is capable of cross biological barriers and that the conjugation to the nanomaterial does not affect the activity of the biomolecule, so it could become a strategy for the delivery of biomacromolecules with application in diabetes

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario. / La hipertensión pulmonar en los recién nacidos es una patología causada por múltiples factores. Uno de ellos es la hipoxia aguda y/o crónica que altera los mecanismos que ocurren normalmente en la transición cardiovascular y respiratoria de feto a recién nacido, fenómeno que ocurre en gestaciones a grandes alturas o en gestaciones en tierras bajas que cursan con insuficiencia placentaria. Esta genera una importante vasoconstricción e hipertensión arterial en la circulación pulmonar, remodelamiento de los vasos pulmonares, reducción del lumen vascular y aumento de la resistencia vascular pulmonar, lo que puede llevar a hipertrofia ventricular derecha, eventualmente falla cardiaca y muerte. Además, la eficacia y disponibilidad de los tratamientos actuales es limitada. El péptido natriurétuco auricular (ANP) es un vasodilatador dependiente de cGMP, por lo que el objetivo de este estudio fue plantear una terapia basada en este péptido para reducir la presión pulmonar arterial pulmonar (mPAP) y la resistencia vascular pulmonar (RVP). Para ello, se cateterizaron 14 corderos gestados y nacidos en tierras altas (3.600 m) de 3 o 4 días de edad, bajo anestesia, que presentan la mPAP elevada a causa de la altura. 2 corderos fueron utilizados para prueba de dosis. A 6 se les administró NaCl 0,9% (controles) y a otros 6 se les administró ANP durante 7 días, período en el cual se evaluaron las variables cardiopulmonares diariamente. Al final de este período, los neonatos se sometieron a un episodio de hipoxia aguda sobreimpuesta evaluando la respuesta del fármaco a una crisis hipóxica. Los animales tratados diariamente con ANP presentaron una disminución aguda de la mPAP que se mantuvo luego de la administración durante los 2 primeros días de tratamiento. Desde el tercer día en adelante esta disminución solo fue significativa durante la infusión del péptido. Además, el tratamiento crónico con el fármaco produjo una ausencia de la vasoconstricción pulmonar durante el episodio de hipoxia aguda sobreimpuesta. Se concluye que el ANP podría ser considerado como un fármaco para ser utilizado en las crisis hipertensivas pulmonares que ocurren en la patología estudiada. Sin embargo, se debe buscar una opción de tratamiento que perdure con el pasar de los días. / Pulmonary hypertension in newborns is a pathology caused by multiple factors. One of which is acute and / or chronic hypoxia that alters the mechanisms that normally occur in the cardiovascular and respiratory transition from fetus to newborn, phenomenon that occurs in gestations at great geographical altitudes or in lowland gestations with placental insufficiency. This generates an important vasoconstriction and arterial hypertension in the pulmonary circulation, remodeling of the pulmonary vessels, reduction of the vascular lumen and increasing the pulmonary vascular resistance, which can lead to right ventricular hypertrophy, and eventually heart failure and death. In addition, the efficacy and availability of current treatments is markedly limited. Atrial natriuretic peptide (ANP) is a cGMP-dependent vasodilator, so the aim of this study was to propose a therapy based on this peptide to reduce pulmonary arterial pulmonary pressure (mPAP) and pulmonary vascular resistance (PVR). For that, 14 lambs gestated and born in the highlands (3,600 m) of 3 or 4 days of age were catheterized under anesthesia, presenting high mPAP due to height. 2 lambs were used for dose testing. 6 patients were given 0.9% NaCl (controls) and another 6 were given ANP for 7 days, during which time the cardiopulmonary variables were evaluated daily. At the end of this period, the neonates underwent an episode of overhyped acute hypoxia assessing the drug's response to a hypoxic crisis. Animals treated daily with ANP showed an acute decrease in mPAP that remained after the infusion during the first 2 days of treatment. From the third day onwards the decrease was only significant during infusion period. In addition, chronic treatment with the drug produced an absence of pulmonary vasoconstriction during the episode of superimposed acute hypoxia. It is concluded that the ANP could be considered as a drug to be used in pulmonary hypertensive crises that occur in the pathology studied. However, a treatment option that will last as days go by should be looked for. / Financiamiento: Proyecto Fondecyt No. 1 1140647.

En esta Tesis Doctoral se ha estudiado en modelos experimentales el potencial antihipertensivo de dos tipos de péptidos bioactivos: péptidos derivados de distintas zonas de la secuencia de la lactoferrina bovina (LF), incluido su dominio antimicrobiano lactoferricina (LfcinB), y heptapéptidos obtenidos mediante diseño racional a partir de hexapéptidos parentales. Se han realizado tres tipos de ensayos: ensayos in vitro para determinar los efectos inhibitorios sobre la actividad de la enzima conversora de la angiotensina I (ECA); ensayos funcionales ex vivo, usando segmentos arteriales aislados de conejo, para analizar los efectos inhibitorios de los péptidos sobre la vasoconstricción ECA-dependiente producida por angiotensina I (Ang I); y ensayos in vivo mediante la administración de los péptidos a ratas espontáneamente hipertensas (SHR) para estudiar los efectos antihipertensivos. En algunos casos, también se han realizado ensayos in vitro para determinar el potencial efecto tóxico de los péptidos no naturales y de digestión gastrointestinal simulada para analizar la biodisponibilidad de los péptidos. Se obtuvieron péptidos derivados de LfcinB mediante elongaciones tanto del extremo C-t como del N-t del péptido LfcinB20-25 (RRWQWR). Estos péptidos mostraron diferentes potencias de inhibición de la actividad ECA in vitro, e inhibieron la vasoconstricción ECA-dependiente ex vivo. No se encontró una clara correlación entre los resultados in vitro y ex vivo. Solamente LfcinB20-25 y un fragmento derivado (WQ) producido mediante digestión gastrointestinal simulada mostraron efectos antihipertensivos in vivo. Sin embargo, el fragmento no mostró efecto inhibidor de la vasoconstricción ECA-dependiente en contraste con LfcinB20-25. Por otro lado, se preparó un hidrolizado de lactoferrina bovina con pepsina y se ultrafiltró para enriquecerlo en péptidos con peso molecular menor de 3 kDa (LFH<3kDa). Este hidrolizado mostró efectos antihipertensivos mantenidos hasta 24 h tras la administración oral. LFH<3kDa se fraccionó y se identificaron 38 péptidos de los cuales se sintetizaron los 11 péptidos más abundantes. Tres de estos péptidos (LIWKL, RPYL y LNNSRAP) mostraron diferentes grados de inhibición de la actividad ECA in vitro y efectos antihipertensivos in vivo, aunque solamente dos de ellos, LIWKL y RPYL, mostraron efectos inhibidores de la vasoconstricción ECA-dependiente ex vivo. Por último, seis heptapéptidos mostraron diferentes grados de inhibición de la actividad ECA in vitro y de la vasoconstricción ECA-dependiente, pero no de la vasoconstricción ECA-independiente producida por angiotensina II. Los heptapétidos PACEI50L (RKWHFLW) y PACEI52L (RKWLFHW), y el hexapéptido parental PACEI32L (RKWHFW), mostraron efectos antihipertensivos in vivo, sin afectar a la presión arterial en ratas normotensas. Los péptidos sintetizados con D-aminoácidos mostraron mucho menos efecto inhibidor de la actividad ECA in vitro, no tuvieron efecto ex vivo, y mostraron efectos antihipertensivos in vivo tras administración intravenosa pero no oral. La toxicidad de estos péptidos no naturales para reducir la viabilidad celular in vitro se mostró a concentraciones milimolares, mucho más altas que las concentraciones micromolares con efecto inhibidor de la actividad ECA. En conclusión, se ha demostrado el potencial antihipertensivo de un péptido derivado de la lactoferricina (LfcinB20-25), de un hidrolizado con pepsina de la lactoferrina enriquecido en péptidos de bajo peso molecular (LFH<3kDa), de péptidos contenidos en dicho hidrolizado procedentes de otras zonas de la lactoferrina diferentes de LfcinB (LIWKL, RPYL y LNNSRAP), y de hexa- y heptapéptidos obtenidos mediante diseño racional (PACEI32L, PACEI50L y PACEI52L). En la mayor parte de ellos, el efecto antihipertensivo se asocia a su efecto vasoactivo por su capacidad para inhibir la actividad ECA / Ruiz Giménez, P. (2013). Efecto antihipertensivo, mediante inhibición de la enzima conversora de angiotensina I, de péptidos derivados de lactoferrina bovina y péptidos diseñados racionalmente [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/31123

[ES] La abscisión es un proceso de separación celular activo, organizado y altamente coordinado que permite el desprendimiento de órganos vegetativos y reproductivos completos, mediante la modificación de la adhesión celular y la desintegración de las paredes celulares en lugares específicos del cuerpo de la planta conocidos como zonas de abscisión. En Arabidopsis thaliana (Arabidopsis), la abscisión de órganos florales y hojas caulinares está regulada por la interacción entre el péptido hormonal (IDA), un par de proteínas quinasas de tipo receptor redundantes, (HAE y HSL2), y correceptores de la familia SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR-LIKE KINASE. El conocimiento sobre la maquinaria molecular que regula la abscisión en especies de plantas de importancia económica de la familia de las solanáceas es en la actualidad escaso. En esta investigación de doctorado, se realizó un análisis funcional de los componentes del módulo de señalización de abscisión IDA-HAE en N. benthamiana. En la primera sección de este trabajo, se estudió el grado de conservación y la filogenia de las familias de genes IDA-like y HAE-like en especies relevantes del género Solanum, Capsicum y Nicotiana. Se analizó la expresión de estos genes en el alopoliploide N. benthamiana, con el fin de identificar miembros implicados en la abscisión y en la respuesta a condiciones de estrés abiótico como la sequía. En la segunda sección, se evaluó el efecto del silenciamiento y la sobreexpresión de NbenIDA1A y NbenIDA1B, dos homeólogos IDA-like de N. benthamiana que se asociaron con la abscisión de la corola en la sección anterior. Además, también se determinó el efecto sobre la abscisión de la corola del silenciamiento de NbenHAE.1. Las relaciones filogenéticas entre los miembros IDA-like de las solanáceas estudiadas, agruparon los dos pares de homeólogos de proteínas NbenIDA1 y NbenIDA2 con los prepropéptidos de Arabidopsis relacionados con la abscisión. El análisis de las regiones promotoras en busca de elementos reguladores reveló que estos dos pares de homeólogos contenían elementos de respuesta tanto hormonales como de respuesta a la sequía, aunque NbenIDA2A carecía de los elementos reguladores hormonales. Los análisis de expresión génica también indican que el par de homeólogos NbenIDA1 se regulan positivamente durante la abscisión de la corola. Los pares NbenIDA1 y NbenIDA2 mostraron una expresión diferencial tisular en condiciones de estrés hídrico, ya que los homeólogos NbenIDA1 se indujeron en hojas estresadas, mientras que los homeólogos NbenIDA2, especialmente NbenIDA2B, se indujeron en raíces estresadas. En las plantas con crecimiento activo no estresadas, los nudos y los entrenudos fueron los tejidos con los niveles de expresión más altos de todos los miembros de la familia IDA-like y sus receptores HAE-like putativos. El silenciamiento basado en VIGS del par de homeólogos NibenIDA1 y NbenHAE.1 suprimió la abscisión de la corola en flores de N. benthamiana, lo que fue causado por un bloqueo en la desintegración de la pared celular en la base de la corola, probablemente debido a la falta de inducción de las enzimas hidrolíticas relacionadas con la abscisión. La sobreexpresión ectópica del homeólogo NbenIDA1A adelantó la senescencia y la abscisión de la corola y afectó negativamente al crecimiento de las plantas de N. benthamiana. Los resultados obtenidos utilizando la aproximación VIGS mostraron que el par de homeólogos NbenIDA1 y el receptor NbenHAE.1, posiblemente actuando como un módulo de señalización similar al descrito en Arabidopsis, regulan la abscisión de la corola en las flores de N. benthamiana. Este es, por tanto, el primer ejemplo en una especie vegetal distinta de Arabidopsis thaliana que indica que el módulo de señalización de abscisión IDA-HAE/HSL2 se conserva en las angiospermas. / [CA] L'abscisió és un procés de separació cel·lular actiu, organitzat i altament coordinat que permet el despreniment d'òrgans vegetatius i reproductius complets, mitjançant la modificació de l'adhesió cel·lular i la desintegració de les parets cel·lulars en llocs específics del cos de la planta coneguts com a zones d'abscisió. En Arabidopsis thaliana (Arabidopsis), l'abscisió d'òrgans florals i fulles caulinars està regulada per la interacció entre el pèptid hormonal (IDA), un parell de proteïnes cinases de tipus receptor redundants, (HAE i HSL2), i coreceptors de la família SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR-LIKE KINASE. El coneixement sobre la maquinària molecular que regula l'abscisió en espècies de plantes d'importància econòmica de la família de les solanàcies és en l'actualitat escàs. En aquesta recerca de doctorat, es va realitzar una anàlisi funcional dels components del mòdul de senyalització d'abscisió IDA-HAE en N. benthamiana. A la primera secció d'aquest treball, es va estudiar el grau de conservació i la filogènia de les famílies de gens IDA-like i HAE-like en espècies rellevants de l'gènere Solanum, Capsicum i Nicotiana. Es va analitzar l'expressió d'aquests gens en l'al·lopoliploide N. benthamiana, per tal d'identificar membres implicats en l'abscisió i en la resposta a condicions d'estrès abiòtic, com la sequera. A la segona secció, es va avaluar l'efecte del silenciament i la sobreexpressió de NbenIDA1A i NbenIDA1B, dos homeòlegs IDA-like de N. benthamiana, que es van associar amb l'abscisió de la corol·la en la secció anterior. A més, també es va determinar l'efecte sobre l'abscisió de la corol·la del silenciament de NbenHAE.1. Les relacions filogenètiques entre els membres IDA-like de les solanàcies estudiades, van agrupar els dos parells d'homeòlegs de proteïnes NbenIDA1 i NbenIDA2 amb els prepropèptids d'Arabidopsis relacionats amb l'abscisió. L'anàlisi de les regions promotores a la recerca d'elements reguladors va revelar que aquests dos parells d'homeòlegs contenien elements de resposta tant hormonals com de resposta a la sequera, encara que NbenIDA2A mancava dels elements reguladors hormonals. Les anàlisis d'expressió gènica també indiquen que el parell d'homeòlegs NbenIDA1 es regulen positivament durant l'abscisió de la corol·la. Els parells NbenIDA1 i NbenIDA2 van mostrar una expressió diferencial tissular en condicions d'estrès hídric, ja que els homeòlegs NbenIDA1 es van induir en fulls estressades, mentre que els homeòlegs NbenIDA2, especialment NbenIDA2B, es van induir en arrels estressades. A les plantes amb creixement actiu no estressades, els nusos i els entrenusos van ser els teixits amb els nivells d'expressió més alts de tots els membres de la família IDA-like i els seus receptors HAE-like putatius. El silenciament basat en VIGS del parell d'homeòlegs NibenIDA1 i NbenHAE.1 va suprimir l'abscisió de la corol·la en flors de N. benthamiana, lo qual va ser causat per un bloqueig en la desintegració de la paret cel·lular a la base de la corol·la, probablement degut a la manca d'inducció dels enzims hidrolítics relacionades amb l'abscisió. La sobreexpressió ectòpica de l'homeòleg NbenIDA1A va avançar la senescència i l'abscisió de la corol·la i va afectar negativament el creixement de les plantes de N. benthamiana. Els resultats obtinguts utilitzant l'aproximació VIGS van mostrar que el parell d'homeòlegs NbenIDA1 i el receptor NbenHAE.1, possiblement actuant com un mòdul de senyalització similar al descrit en Arabidopsis, regulen l'abscisió de la corol·la en les flors de N. benthamiana. Aquest és, per tant, el primer exemple en una espècie vegetal diferent d'Arabidopsis thaliana que indica que el mòdul de senyalització d'abscisió IDA-HAE/HSL2 es conserva en les angiospermes. / [EN] Abscission is an active, organized and highly coordinated cell separation process that enables the detachment of entire vegetative and reproductive organs, through the modification of cell-to-cell adhesion and breakdown of cell walls at specific sites on the plant body, known as abscission zones. In Arabidopsis thaliana (Arabidopsis), abscission of floral organs and cauline leaves is regulated by the interaction of the hormonal peptide (IDA), a pair of redundant receptorlike protein kinases, (HAE and HSL2), and SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR-LIKE KINASE co-receptors. Knowledge about the molecular machinery regulating abscission in economically important plant species of the Solanaceae family is currently scarce. In this PhD research, a functional analysis of the components of the abscission signaling module IDA-HAE in N. benthamiana was carried out. In the first section of this work, the degree of conservation and the phylogeny of the IDA-like and HAE-like gene families in relevant species of the genus Solanum, Capsicumand Nicotiana were determined. The expression of these genes in the allopolyploid N. benthamiana was analyzed, in order to identify members involved in abscission and in the response to abiotic stress conditions, such as drought. In the second section, the effect of the silencing and overexpression of NbenIDA1A and NbenIDA1B, two N. benthamiana IDA-like homeologs, which were associated with corolla abscission in the previous section, was evaluated. Furthermore, the effect on corolla abscission of the silencing of NbenHAE.1 was also determined. The phylogenetic relationships among the IDA-like members of the Solanaceae studied, grouped the two pairs of NbenIDA1 and NbenIDA2 protein homeologs with the Arabidopsis prepropeptides related to abscission. Analysis of promoter regions searching for regulatory elements showed that these two pairs of homeologs contained both hormonal and drought response elements, although NbenIDA2A lacked the hormonal regulatory elements. Gene expression analyses also indicate that the pair of NbenIDA1 homeologs are upregulated during corolla abscission. NbenIDA1 and NbenIDA2 pairs showed tissue differential expression under water stress conditions, since NbenIDA1 homeologs were highly expressed in stressed leaves, while NbenIDA2 homeologs, especially NbenIDA2B, were highly expressed in stressed roots. In non-stressed active growing plants, nodes and internodes were the tissues with the highest expression levels of all members of the IDA-like family and their putative HAE-like receptors. VIGS-based silencing of the pair of NibenIDA1 homeologs and NbenHAE.1 suppressed corolla abscission in flowers of N. benthamiana, which was supported by a blockage in cell wall disassembly at the corolla base, probably due to the lack of upregulation of abscission-related hydrolytic enzymes. Ectopic over-expression of the homeolog NbenIDA1A advanced the timing of both corolla senescence and abscission and negatively affected the growth of N. benthamiana plants. The results obtained using the VIGS approach showed that the pair of NbenIDA1 homeologs and the NbenHAE.1 receptor, possibly acting as a signaling module similar to that described in Arabidopsis, regulate corolla abscission in N. benthamiana flowers. This is therefore the first example in a plant species other than Arabidopsis thaliana that indicates that the IDA-HAE/HSL2 abscission signaling module is conserved in angiosperms. / Ventimilla Llora, D. (2021). The abscission regulatory module INFLORESCENCE DEFICIENT IN ABSCISSION (IDA) / HAESA (HAE)-like receptor kinases in Solanaceae species: Functional analysis in Nicotiana benthamiana [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/167777

Las hormonas recombinantes eritropoyetina (EPO) y hormona de crecimiento (GH), prácticamente iguales a las endógenas y de corta vida media en circulación, son de difícil detección directa en el control antidopaje. Se determinaron los valores poblacionales de los biomarcadores indirectos EPO, receptor soluble de la transferrina, insulin-like growth factor-I (IGF-I) y procolágeno tipo III péptido (P-III-P), en poblaciones seleccionadas de deportistas, y el efecto del ejercicio y los distintos tipos de entrenamiento sobre su concentración sérica. La comparación de resultados obtenidos mediante distintos ensayos demostró la necesidad de una validación exhaustiva previa a su utilización. A excepción del P-III-P, los biomarcadores séricos propuestos para la detección de rhEPO y rhGH no se encuentran directamente afectados por el nivel atlético, el ejercicio o la distinta carga de entrenamiento realizada a lo largo de la temporada deportiva. La edad es la principal influencia sobre las concentraciones séricas de IGF-I y P-III-P. / Direct detection of recombinant peptidic hormones erythropoietin (EPO) and growth hormone (GH), very similar to endogen molecules and with a short half life in blood, is difficult in antidoping control. The main objective of this work is to determine indirect biomarkers' values of EPO, soluble transferrin receptor, insulin-like growth factor-I (IGF-I) and procollagen type III peptide (P-III-P), in selected populations of athletes, and the effect of exercise and different types of training on their concentration in serum. The comparison of results obtained by the different assays showed the need of extensive validation of the analytical techniques before their use in the antidoping field. Excepting P-III-P, proposed biomarkers for the detection of rhEPO and rhGH abuse are not directly influenced by the athletic level, exercise or different training workload along the sport season. Age is the main factor affecting IGF-I and P-III-P concentrations in serum.