L'hétérogénéité de l'adénocarcinome canalaire pancréatique (ADCP) est l'obstacle majeur au traitement efficace des patients. En effet, les caractéristiques cliniques et la sensibilité aux traitements sont associés à un phénotype donné et sont plutôt régis à un niveau transcriptomique. Nous avons donc analysé le transcriptome de xénogreffes provenant des patients (Patients Derived Xenografts : PDX) lors des biopsies de tumeurs ou de pièces chirurgicales. Après extraction d’ARN, nous avons trouvé une signature moléculaire capable de diviser les patients en deux groupes, en fonction de leur survie. Nous avons également montré que la réponse autraitement pouvait être prédite par l‘analyse transcriptomique. Nous avons ensuite analysé les tumeurs et leurs stromas, et mis en évidence deux soustypesde stromas et deux sous-types de tumeurs, définis par la transcriptomique basée sur l'ARN, ou la méthylation de l'ADN. Nous avons étudié la réponse aux traitements administrés seuls ou en combinaison avec des chimiothérapies de routine. Nous avons mis en évidence des sous-groupes de patients plus chimiosensibles à certains traitements. Tous ces résultats sont encourageants,mais pas encore applicables en pratique clinique. Nous développons maintenant les organoïdes, véritable représentation de la tumeur en 3dimensions. Contrairement aux PDX, les organoïdes nous permettent d'obtenir des résultats rapidement exploitables. Nous pensons que dans un avenir proche, le traitement des cancers du pancréas sera précédé d'une caractérisation moléculaire étendue afin de sélectionner les traitements les plus appropriés et de pouvoir enfin proposer une médecine personnalisée. / Heterogeneity of Pancreatic Ductal AdenoCarcinoma (PDAC) has become the majorimpediment to the effective treatment of patients. Clinical outcome and sensitivity to treatments are associated with a given phenotype and associated at a transcriptomic level. Recent data indicate that studying the expressionof a selected gene set could inform selection of the most appropriate treatments.We areoptimizing this approach by analysing transcriptome of Patient-Derived Xenografts (PDX)from surgical as well as endoscopic ultrasound-guided fine needle aspiration (EUS-FNA)biopsies of tumors, as a source of RNA. We have found a molecularsignature capable of dividing patients into two groups, function of theirsurvival.Independently, we have shown that treatment response pattern can also be foundat a transcriptomic level. We thenanalysed tumors and their stromas, and have found two sub-types of stromas and two sub-types of tumors. These wereindinstinctly defined by RNAseq-based transcriptomics, or DNA methylation. We also studied response to treatments administered alone or incombination to routine chemotherapies. All these results are encouraging, but not yetapplicable in clinical pratice. We are now developing the PDAC Biopsy DerivedPancreatic Cancer Organoids (BDPCO): BDPCO culture represents an excellent source of “exvivo” material. Unlike PDX, which take many months to grow, BDPCO allow us to obtainexploitable material rapidly useful for clinical application. We are convinced that in the near future, the treatment ofpancreatic cancers will be preceded by an extensive molecular characterization of cancercells in order to select the most appropriate treatments.

Dans ce travail, nous démontrons que l’expression ectopique de Pax4 dans les cellules glucagon+ adultes induit, indépendamment de l’âge, leur néogenèse et transformation en cellules «bêta-like», ce qui entraîne une hypertrophie des îlots et une néogenèse inattendue des îlots. Par l’utilisation de plusieurs approches de traçage, nous démontrons que la conversion des cellules alpha en cellules «bêta-like» médiée par l’expression de Pax4, induit également la mobilisation de précurseurs situés dans ou à proximité des canaux pancréatiques. Ces cellules ré-expriment le gène développemental Ngn3 et adoptent successivement une identité de cellules glucagon+ puis de cellules «bêta-like», suggérant le réveil des mécanismes embryonnaires. Il et à noter que ces processus sont capables de régénérer la totalité de la masse de cellules bêta après plusieurs séries d’induction chimique du diabète. Ces résultats offrent ainsi des perspectives prometteuses pour concevoir de nouvelles stratégies thérapeutiques et régénératrices dans le contexte du diabète du type I. Dans un deuxième chapitre, ce travail décrit nos résultats d'analyse par puce à ADN de pancréas transgénique d’animaux exprimant conditionnellement le gène Pax4 dans les cellules alpha adultes. Cette approche nous permis d'identifier de potentiels gènes cibles de Pax4, qui pourraient jouer un rôle important dans les processus de régénération de la masse de cellules bêta. L’analyse de la fonction de l’un de ces gènes, le facteur de croissance indépendante 1 (Gfi1) est décrite. / In this work we demonstrate that the inducible misexpression of Pax4 in glucagon+ cells age-independently provokes their conversion into beta-like cells and their glucagon shortage-mediated replacement, this process resulting in islet hypertrophy and in an unexpected islet neogenesis. Taking advantage of several lineage-tracing approaches, we show that, upon Pax4-mediated alpha-to-beta-like cell conversion, pancreatic duct-lining precursor cells are mobilized, re-express the developmental gene Ngn3, and successively adopt a glucagon+ and a beta-like cell identity through a mechanism involving the reawakening of the epithelial-to-mesenchymal transition (EMT). It is worth mentioning, that these processes can repeatedly regenerate the entire beta-cell mass, and thereby reverse several rounds of streptozotocin-mediated chemically-induced Type I diabetes. This approach thereby provides promising perspectives to design novel therapeutic regenerative strategies. Aiming to gain further insight into the molecular mechanisms underlying these regeneration and reprogramming processes, and thereby identify new putative targets of interest, a thorough micro array analysis was performed using pancreata from transgenic mice conditionally misexpressing Pax4 in adult alpha-cells. We thereby identified several promising candidate genes, whose gene expression was significantly altered in induces animals. Among these was Growth factor independent 1 (Gfi1): its expression pattern and putative function in the murine pancreas will be described in this work.

L'adénocarcinome canalaire pancréatique (PDAC) est une maladie agressive à pronostic sombre et à forte mortalité. Il est donc crucial de rechercher de nouvelles cibles thérapeutiques et de nouveaux traitements. Une option intéressante pourrait être le ciblage du métabolisme du Fer. En effet, la transformation cellulaire s'accompagne généralement d'un accroissement des besoins en fer et de l'augmentation du récepteur de la transferrine de type 1, TfR1, le récepteur majeur impliqué dans l'approvisionnement des cellules en Fer par l'internalisation de la transferrine plasmatique chargée en fer. Nous avons utilisé un anticorps monoclonal humain IgG1 anti-TfR1 (H7) pour cibler le TfR1 dans le PDAC. Le traitement in vitro de 3 lignées de PDAC, établies à partir de tumeurs primaires de patients (BxPC3 et HPAC) ou d'une métastase hépatique (CFPAC) par H7 inhibe la viabilité cellulaire en réduisant la prolifération et induisant l'apoptose. H7 bloque efficacement l'internalisation de la transferrine chargée en Fer avec pour conséquence une baisse du Fer libre intracellulaire, une augmentation du TfR1 et une diminution de la ferritine, protéine de stockage du fer. Le traitement par H7 induit également l'expression du suppresseur de tumeur NDRG1 (N-myc downstream regulated gene 1), une cible prometteuse dans le cancer du pancréas, et la formation de sphères par la lignée HPAC in vitro, montrant que la déprivation en fer inhibe aussi les cellules initiatrices de tumeur dans ce modèle. Enfin, H7 recrute les cellules Natural Killer in vitro et induit efficacement l’ADCC (cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps). In vivo, dans 2 modèles de PDAC chez la souris (greffe de la lignée BxPC3 ou d’une tumeur dérivée d’un patient (PDX)), H7 diminue la croissance tumorale et augmente l'activité anti-tumorale du traitement chimiothérapeutique standard (gemcitabine). Ces résultats suggèrent que le ciblage du TfR1 par l'anticorps H7, seul ou en combinaison avec le traitement chimiothérapeutique standard est une stratégie prometteuse pour le traitement du PDAC. / Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is a highly aggressive disease associated with poor diagnosis and high mortality. It is therefore necessary to search for new therapeutic targets and treatments. One of the interesting options would be targeting iron metabolism. Indeed, cell transformation is generally accompanied with increased needs for iron together with increased expression of the transferrin receptor 1, TfR1, the major receptor involved in cellular iron supply via the internalization of plasma transferrin loaded with iron.We have used a fully human internalizing anti-TfR1 antibody (IgG1), namely H7, to target TfR1 in PDAC. On three PDAC cell lines, BxPC3, HPAC (established from primary tumor), and CFPAC (established from hepatic metastasis), H7 treatment decreased cellular viability in vitro as a result of combined proliferation inhibition and apoptosis induction. H7 blocked efficiently transferrin internalization, and, likely due to a decrease in the labile iron pool, induced the upregulation of TfR1 and the downregulation of the iron storage protein ferritin. Interestingly, H7 treatment also induced the expression of the metastasis suppressor N-myc downstream regulated gene 1 (NDRG1), a promising therapeutic target in pancreatic cancer. H7 also decreased the ability of HPAC cell line to form tumor sphere in vitro indicating its inhibitory effect tumor initiating cells. Finally, H7 was able to recruit Natural killer cells and mediate antibody-dependent cell cytotoxicity on PDAC cell lines in vitro. In vivo, both in a PDAC cell line (BxPC3) and a patient derived xenograft (PDX) mouse model, H7 treatment decreases tumor growth and increases the anti-tumor activity of the Gemcitabine standard treatment. These data provide evidence that targeting pancreatic cancer with the iron depriving anti-TfR1 antibody, alone or in combination with gemcitabine might be a promising strategy in PDAC.

Doctorat en Sciences médicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Le cycle cellulaire est un processus finement régulé à différents niveaux. p27 est un inhibiteur des complexes cyclines/CDK et cette fonction lui confère un rôle antiprolifératif lorsqu'il est localisé dans le noyau. De nombreuses études ont montré que p27 se comporte comme un suppresseur de tumeur lorsqu'il est localisé dans le noyau des cellules via l'inhibition des cyclines/CDK. De manière surprenante, p27 a également des fonctions oncogéniques dans certaines situations, notamment lorsqu'il est présent dans le cytoplasme. Il s'avère qu'en plus de ses fonctions de régulateur du cycle cellulaire, p27 est également impliqué dans la régulation d'autres processus cellulaires, comme la migration, la cytocinèse, la transcription ou encore l'autophagie et la différenciation. Durant ma thèse, j'ai caractérisé deux de ces nouvelles fonctions en mettant en lumière un rôle de p27 dans la régula.on des invadopodes ainsi que dans l'oncogenèse pancréatique.Mon premier objectif a été de comprendre la fonction de l'interaction de p27 avec la protéine Cortactine, un nouveau partenaire de p27.Cette protéine joue un rôle important dans la régulation de l'invasion cellulaire. J'ai confirmé cette interaction dans différents types cellulaires et observé une colocalisation au niveau des invadopodes. J'ai également cartographié leurs domaines d'interaction respectifs et montré que l'interaction de p27 avec Cortactine était induite par une stimulation avec du sérum. L'interaction p27/Cortactine permet le recrutement de PAK1, une sérine/thréonine kinase impliqué dans l'invasion cellulaire et favorisant notamment le renouvellement des invadopodes, sur Cortactine. J'ai également observé que les cellules invalidées pour p27 présentent de nombreux invadopodes et dégradent la matrice extracellulaire de manière très importante par rapport aux cellules exprimant p27. Par des approches d'inhibiteurs et de siARN j'ai mis en évidence que ce phénotype implique la voie Rac1/PAK1/phospho-Ser113-Cortactine qui est sous-activée en l'absence de p27 à cause du défaut de recrutement de PAK1 sur Cortactine, stabilisant ainsi les invadopodes. Mon second objectif a été d'étudier les mécanismes par lesquels p27 régule l'oncogenèse pancréatique. En effet, différentes études cliniques ou chez la souris ont montré que la localisation nucléaire de p27 était requise pour son rôle de suppresseur de tumeur dans le pancréas. Or nous avons constaté dans un modèle murin génétique d'oncogenèse pancréatique induite par l'activation de K-Ras que p27 était exclu du noyau avant l'apparition des premières lésions, suggérant un rôle précoce dans l'oncogenèse de ce tissu. De manière surprenante, l'étude comparative par immunomarquage de pancréas de souris p27+/+, p27-/- et p27CK-/CK-, un modèle de souris knock-in où p27 n'est plus capable d'inhiber les cyclines/CDK, n'a pas montré d'effet de p27 sur la prolifération dans le pancréas exocrine. Par contre, ces études ont montré une localisation anormale de plusieurs marqueurs de polarité acinaire ainsi qu'une réexpression des facteurs de transcription Sox9 et Pdx1, impliqués dans le processus de transdifférenciation cellulaire à l'origine de l'oncogenèse pancréatique appelée métaplasie acino-canalaire. Nous avons montré que p27 régulait de manière directe la transcription de Sox9 en interagissant avec son promoteur, suggérant que p27 participe normalement à la répression transcriptionnelle de Sox9 dans le noyau, réprimant ainsi la métaplasie acino-canalaire.Ainsi, mes travaux de thèse ont permis l'identification de deux nouvelles fonctions de p27. Une fonction oncogénique, indépendante de son activité d'inhibiteur des CDK/cyclines, par laquelle p27 régule la protéine Cortactine, et par ce biais les invadopodes et l'invasion ainsi qu'une fonction de suppresseur de tumeur dépendante des cyclines/CDK via la répression de la transcription de Sox9 dans les cellules acinaires du pancréas. / Cell cycle is a tightly regulated process. One level of regulation is provided by p27, a cyclin/ CDK inhibitor and as such, p27 has an antiproliferative function. Several studies have shown that p27 is a tumor suppressor when it is located in the nucleus via the inhibition of cyclins/ CDKs. Surprisingly, p27 may also play oncogenic roles depending on the cellular context, especially when it is excluded from the nucleus. In fact, several lines of evidence indicate that p27 functions extend beyond cell cycle regulation and that p27 also regulates cell migration, cytokinesis, transcription, autophagy and stemness/differenciation. During my PhD, I have characterized two novel p27 functions, one in the regulation of invadopodia, and the second in pancreatic oncogenesis.My first aim was to investigate the function of the interaction between p27 and Cortactin, a new p27-interacting protein which is an important regulator of cell invasion. I confirmed this interaction in different cell lines and found that p27 and Cortactin colocalized in invadopodia. I have mapped the domains mediating the interaction in both proteins and found that this interaction is induced after serum stimulation. p27 allows the recruitment of PAK1, a serine/ threonine kinase involved in cell invasion which promotes invadopodia turnover, on Cortactin. I also found that p27 knock-out cells have an increased number of invadopodia and degrade extracellular matrix more efficiently than wild-type cells. Using inhibitors and siRNAs I have shown that this phenotype involves the Rac1/PAK1/phospho-Ser113-Cortac.n pathway, which is underactivated in absence of p27 due to the PAK1/Cortactin interaction defect, causing a stabilization of invadopodia.My second aim was to study the mechanism by which p27 regulates pancreatic oncogenesis. Severals studies in the clinic or in animal models have shown that nuclear localization of p27 is required for its tumor suppressor function in the pancreas. In a genetic mouse model of K- Ras driven pancreatic oncogenesis, I found that p27 was excluded from the nucleus before the apparition of lesions, suggesting an early function in oncogenesis in this tissue. Surprisingly, comparative studies of pancreas from p27+/+, p27-/- and p27CK-/CK- (a knock- in mouse model where p27 no longer binds cyclins/CDKs) mice by immunostaining did not show any difference in proliferation in the exocrine pancreas. However, these studies have shown the mislocalization of different acinar polarity markers and the re-expression of two transcription factors, Sox9 and Pdx1, which are involved in acinar-to-ductal metaplasia, a cell transdifferenciation process thought to be the underlying cause of pancreatic oncogenesis. I have found that p27 regulates Sox9 transcription and directly interacts with its promoter, suggesting that p27 participates in the transcriptionnal repression of Sox9 in normal conditions to prevent acinar-to-ductal metaplasia. Overall, my PhD work has allowed the identification of two novel roles of p27. An oncogenic function, independent of its cyclin/CDK inhibitory activity, by which p27 regulates Cortac.n, invadopodia and cell invasion and a tumor suppressor function dependent of cyclin/CDK via the repression of Sox9 transcription in pancreas acinar cells.

Le cancer du pancréas est un cancer très agressif et de pronostic très sombre. Il est diagnostiqué tardivement et se montre résistant aux traitements. Dans ce contexte, il est nécessaire de mettre en évidence de nouveaux marqueurs spécifiques de cette pathologie dévastatrice. Le but de notre étude était de rechercher un marqueur « génétique » de ce cancer au sein du gène de la lipase sels biliaires-dépendante (BSDL) localisé en position 9q34.3 et plus particulièrement au niveau de l'exon 11 de ce gène codant pour le domaine C-terminal de la protéine et constitué de séquences répétées (séquences VNTR). L’analyse des électrophérogrammes obtenues après séquençage de Sanger à partir des amplicons de PCR réalisées sur l’ADNg extraits de tissus de patients atteints de cancer du pancréas, a permis d’identifier deux altérations génétiques : (i) la présence d’un SNP (Single Nucleotide Polymorphism) synonyme référencé rs488087, impliquant la transition c.1719C>T ; qui semble être associée au développement d’un cancer du pancréas sporadique et pourrait être un potentiel facteur prédictif de ce cancer permettant de cibler des populations à risque, (ii) la présence d’une insertion d’un nucléotide C induisant l'apparition d'une protéine BSDL tronquée présentant une séquence C-terminale modifiée contre laquelle ont été développé des anticorps polyclonaux. Cette nouvelle séquence pourrait constituer un potentiel marqueur diagnostique et/ou thérapeutique du cancer du pancréas. Ces deux altérations génétiques constituent ainsi de potentiels marqueurs du cancer du pancréas. / Pancreatic cancer is a devastating disease progressing asymptomatically until death within months after diagnosis. In this context, it is necessary to identify new specific markers to develop diagnostic tools and to target an at risk population. The aim of our study was to find a "genetic" marker in the bile salt-dependant lipase gene (BSDL). The human BSDL gene is located on the long arm of chromosome 9 in 9q34.3 with a variable number of tandem repeats (VNTR) in the coding region of exon 11. The electropherograms obtained after Sanger sequencing analysis of gDNA amplified from pancreatic cancer tissue samples allowed us to highlight: (i) the presence of a SNP (Single Nucleotide Polymorphism) involved in c.1719C>T transition which is referenced rs488087. rs488087 seems to be associated with the sporadic pancreatic cancer development and may be a predictive factor of pancreatic cancer for targeting an at risk population, (ii) the presence of a C nucleotide insertion leading to a premature stop codon with truncated protein and to the modification of the C-terminal sequence end. This new C-terminal sequence, alteration could be used as a potential diagnostic and/or therapeutic marker. Finally, these two genetic alterations identified in BSDL gene could constitute potential markers of pancreatic cancer.

La sécrétion d'insuline est un phénomène physiologique majeur déclenché par l'entrée du glucose dans la cellule β-pancréatique. Elle est naturellement modulée par de nombreux facteurs comme des métabolites, des neurotransmetteurs et des hormones. Parmi les modulateurs hormonaux, les incrétines, dont le chef de file est le Glucagon Like Peptide (GLP-1), sont des amplificateurs gluco-dépendants de la sécrétion d'insuline. Ils activent la voie AMPc-PKA et leurs effets sur la glycémie sont à la base de stratégies pharmacologiques antidiabétiques. Cependant, si les actions physiologiques des incrétines sont bien connues, la compréhension des mécanismes moléculaires mis en jeu demeure incomplète. Pour ce travail, nous sommes partis de l'hypothèse suivant laquelle la PKA pourrait potentialiser la sécrétion d'insuline, par phosphorylation de cibles moléculaires spécifiques, grâce à son adressage par les A Kinase Anchoring Proteins (AKAPs) au niveau de la machinerie de l'exocytose. Cette étude s'appuie sur des techniques moléculaires d'invalidation génique (RNAi), de peptides inhibiteurs et de fractionnement subcellulaire, ainsi que sur des analyses en microscopie électronique et confocale. Durant ce travail, nous avons mis en évidence la distribution de la sous-unité RIIα de la PKA à la surface des granules d'insuline matures. Nous avons également montré que la suppression de l'expression de la sous-unité RIIα de la PKA, comme la dissociation des complexes de type PKARII-AKAPs provoquent une réduction importante de l'effet amplificateur du GLP-1 sur la sécrétion d'insuline. Ainsi, cette étude nous a permis d'identifier la sous-unité RIIα de la PKA comme l'isoforme indispensable à la potentialisation AMPc-dépendante de la sécrétion d'insuline induite par le GLP-1, et surtout de placer le granule d'insuline mature au centre des mécanismes liés à l'effet « incrétine ». Ce travail constitue une première étape vers l'identification des différents partenaires du complexe protéique impliqué dans la potentialisation de l'exocytose d'insuline par la voie AMPc-PKA. / Insulin secretion is a major physiological function triggered in the body upon glucose entry into pancreatic β cells. This process is naturally subject to modulation by numerous metabolites, neurotransmitters or hormones. Among the modulatory hormones, incretins, mainly Glucagon Like Peptide (GLP1), act on β cells as physiological amplifiers of glucose-dependent insulin secretion. Incretins are known to recruit the cAMP signaling transduction pathway and their effects on glucose homeostasis represent a current basis for promising anti-diabetic approaches. However, while physiological actions of incretins are well known, the molecular mechanisms underlying these actions are not fully understood.In this thesis, we based our work on the hypothesis that the PKA (cAMP-dependent protein kinase) might potentiate glucose-induced insulin secretion via direct phosphorylation of PKA targets at the level of the exocytosis components, through specific anchoring of the kinase to this microdomain by A-Kinase Anchoring Proteins (AKAPs).The present work involving specific molecular approaches, such as siRNA, cell-permeable peptide competitors, subcellular fractionations as well as confocal and ultrastructural analysis of β cells, culminated to provide compelling evidence that the RIIα PKA isotype is physically associated to mature insulin granules. We demonstrate that in pancreatic β cells, either suppression of RIIαPKA expression or endogenous disruption of RIIαPKA from AKAPs results in almost complete loss of GLP1-induced amplification of insulin secretion.In conclusion, the present work allowed the identification of RIIα as a crucial effector of the cAMP/PKA axis for the amplification by incretins of insulin secretion. This finding represents a first and important step towards the identification of the molecular partners involved in the GLP1-induced PKA-dependent potentiation of insulin exocytosis.

Le taux de mortalité dû au cancer est en hausse d’année en année. Le cancer du pancréas est l’un des plus mortels. Avec un taux de survie inférieur à 20% un an suivant le diagnostic, il y a une urgence pour développer de nouvelles molécules pour cibler cette maladie. La metformine, un biguanide utilisé cliniquement en tant qu’agent antidiabétique, s’est avérée à avoir des propriétés anticancéreuses. Les patients souffrant de diabète de type 2 prenant la metformine comme traitement sont moins à risque de développer plusieurs cancers dont celui du pancréas. Cependant, la metformine n’étant pas biodisponible, les doses à administrer seraient trop élevées pour la considérer comme thérapie anticancéreuse. Le groupe de recherche Schmitzer a synthétisé de nouveaux analogues de type biguanide plus lipophiles dans le but d’améliorer leur biodisponibilité. Le phényléthynylbenzyle biguanide (PEBB) est un des analogues présentant des propriétés antiprolifératives environ 800 fois plus puissantes que la metformine contre des cellules du cancer du pancréas. L’hexylbiguanide s’est aussi démarqué par sa spécificité pour les cellules cancéreuses et sa faible toxicité pour les cellules saines. Étant de bons candidats, des études in vivo ont été faites sur des souris en leur administrant le PEBB et l’hexylbiguanide afin d’obtenir des informations sur l’absorption et la distribution des composés. Pour ce faire, une méthode par LC-MS en mode multiple reaction monitoring (MRM) a été développée afin de quantifier différents analogues de biguanides dans le plasma de souris. De plus, une méthode par MALDI-TOF a été développée afin de localiser et quantifier les analogues dans les tissus par imagerie couplée à la spectrométrie de masse (IMS). Les expériences réalisées ont permis de suivre les composés dans le plasma et d’établir une cinétique d’absorption révélant que le PEBB atteint sa concentration plasmatique maximale environ à 1h après l’administration et que le composé est éliminé de la circulation sanguine à 80% au bout de 4h. Dans le cas de l’hexylbiguanide, la concentration plasmatique maximale est atteinte environ 30 minutes après l’administration pour être éliminé à plus de 90% après 4h. De plus, les études d’IMS ont révélé que le PEBB se distribue principalement dans le foie et légèrement dans les tumeurs. Aucune accumulation à long terme dans le foie n’a été observée, ce qui signifie que les risques de dommages hépatiques sont faibles. Les deux méthodes développées sont des méthodes puissantes IV et reproductibles afin de quantifier les différents types de biguanides dans les liquides biologiques ainsi que dans les tissus. / The death rate of cancer is increasing every year. Pancreatic cancer is one of the deadliest. With a survival rate of less than 20% one year post diagnosis, there is an emergency to develop new molecules to target this disease. Metformin, a biguanide clinically used as an antidiabetic agent, has been shown to have anticancer properties as well. Patients with type 2 diabetes taking metformin are less likely to develop several cancers including pancreatic cancer. However, due to the poor bioavailability of metformin, the doses would be too high to consider it as an anticancer treatment. The Schmitzer group has synthesized new biguanide analogues that are more lipophilic and thus more bioavailable. Phenylethynylbenzyl biguanide (PEBB) is one of the analogues with about 800 times more effective antiproliferative properties than metformin against pancreatic cancer cells. Hexylbiguanide also stood out for its specificity for cancer cells and its low toxicity for normal cells. In vivo studies were performed on mice by administering PEBB and hexylbiguanide to study the absorption and distribution of the compounds. For this aim, a LC-MS method was developed using Multiple Reaction Monitoring (MRM) mode to quantify different biguanide analogues in mice plasma. Complementarily, a MALDI-TOF method was developed to localize and quantify the analogues in tissues by imaging coupled to mass spectrometry (IMS). The experiments performed allowed to follow the compounds in plasma to establish absorption kinetics. These experiments revealed that PEBB reaches its maximum plasma concentration at 1h after administration and the compound is eliminated from the bloodstream at 80% after 6h. For hexylbiguanide, the maximum plasma concentration is reached about 30 minutes after administration and more than 90% is eliminated after 4 hours. In addition, IMS studies have shown that PEBB is distributed mainly in the liver and slightly in tumors. No accumulation in the liver was observed, which suggests that the risk of liver damage is low. These two methods are powerful and reproducible methods to quantify the different types of biguanides in biological fluids and tissues.

Résumé Le cancer du pancréas est un type de cancer mortel au Canada avec de faibles taux de survie. Lorsqu'il se propage, on parle de cancer du pancréas métastatique, qui est généralement détecté tardivement et dont le taux de mortalité est élevé. La chirurgie est souvent inefficace en raison d'un manque d'indications cliniques, de complications lors de la chirurgie et de la réapparition de métastases. Les mécanismes moléculaires responsables de la propagation ne sont toujours pas compris et la résistance aux thérapies anti-tumorales aggrave le pronostic. L'adénosine est un nucléoside présent naturellement dans le corps, et il a été découvert qu'il a à la fois des effets pro-tumorigènes et anti-tumorigènes. Son effet dépend des récepteurs engagés par les différents types de cellules. L'adénosine est produite dans le microenvironnement tumoral par divers mécanismes, notamment la biosynthèse de novo des purines et la dégradation de l'ATP extracellulaire par les ectonucléotidases CD39 et CD73. L'adénosine est une substance clé dans le métabolisme énergétique de nombreuses cellules, y compris les cellules cancéreuses. L'effet immunosuppresseur des récepteurs de l'adénosine, A2BR, sur différents types de cellules immunitaires dans le microenvironnement tumoral (TME) est bien connu, mais des recherches supplémentaires sont nécessaires pour comprendre ses effets sur les cellules cancéreuses. Dans certains types de cancers, tels que les cancers gastriques, les cancers du sein et les cancers de la prostate, une expression ou une activation élevée du récepteur A2B a été associée à davantage de métastases et à un mauvais pronostic. Cependant, l'effet de l'A2BR sur le cancer du pancréas n'a pas été étudié. Dans cette étude, nous avons testé les effets potentiels de l'A2BR dans le PDAC en examinant les effets in vitro et in vivo des cellules PDAC déficientes en A2BR et l'inhibition pharmacologique de ce récepteur sur la prolifération et les métastases des cellules cancéreuses pancréatiques. Mon travail a démontré que l’inhibition de l’A2BR peut affecter la prolifération, le caractère invasif et les métastases des cellules cancéreuses PDAC (PANC-1). Et nous pouvons conclure que les antagonistes A2BR qui sont en phase clinique peuvent potentiellement être considérés comme des traitements contre le cancer PDAC, seuls ou en combinaison avec d’autres options de traitement. / Abstract Pancreatic cancer is a deadly type of cancer in Canada with low survival rates. When it spreads, it's called metastatic pancreatic cancer, which is usually detected late and has a high fatality rate. Surgery is often ineffective due to a lack of clinical indications, complications during surgery, and reappearance of metastases. The molecular mechanisms that cause spread are still not understood, and resistance to anti-tumour therapies worsens the prognosis. Adenosine is a nucleoside found naturally in the body, and it has been discovered to have both pro-tumorigenic and anti-tumorigenic effects. Its effect is determined by the engaged receptors, A1, A2A, A2B, and A3, and the involved cell types. Adenosine is produced from the ATP released by cancer cells that are dying. In the tumor environment, which is a complex ecosystem surrounding a tumor, composed of cancer cells, stromal tissue and the extracellular matrix, CD39/CD73 enzyme axis breaks down adenosine. This process is associated with the development of an immunosuppressed environment that supports the growth of cancer cells (1). Adenosine is a key substance in energy metabolism in many cells, including cancer cells. The immune-suppressing effect of adenosine receptor A2B on different types of immune cells in the tumor microenvironment (TME) is well-known, but further research is needed to understand its effects on cancer cells. In some types of cancers, such as gastric cancers, breast cancers, and prostate cancers, high expression, or activation of the A2B receptor has been linked to more metastasis and poor prognosis. However, the effect of A2BR on pancreatic cancer has not been investigated. In this study, we examined the role of A2BR in Pancreatic Ductal Adenocarcinoma (PDAC), which is a highly aggressive lethal malignancy, by examining the in-vitro and in-vivo effects of the gene-targeted and pharmacological inhibition of the A2B receptor on the proliferation and metastasis of pancreatic cancer cells. My work demonstrated that A2BR inhibition can affect the proliferation, invasiveness, and metastasis of PDAC (PANC-1) cancer cells. Regarding the results of cell invasion (scratch wound cell migration and invasion assay and Boyden Chamber invasion assay) and cell proliferation tests (Incucyte) on PANC-1 cells and in-vivo (tumor growth and lung metastasis tests), We can conclude that A2BR antagonists which are in the clinical phase can potentially be considered as PDAC cancer treatments alone or in combination with other treatment options.

Le diabète de type 1 est un dysfonctionnement du système immunitaire qui provoque l’attaque des cellules insulino-sécrétrices du pancréas. Cette affection du système immunitaire fait l’objet de nombreuses recherches scientifiques en raison de son important impact négatif sur la santé de la population mondiale. Les groupes de recherche des professeurs Bégin-Drolet, Ruel et Hoesli utilisent la technologie d’impression tridimensionnelle d’encres fugitives pour vasculariser des matrices d’hydrogel ensemencées de cellules insulino-sécrétrices. L’encapsulation de ces cellules dans l’hydrogel permet de les isoler du système immunitaire et leur fournit une structure de support semblable à celle de la matrice extracellulaire naturelle. La vascularisation de l’hydrogel par le moulage d’encres sacrificielles est en mesure d’apporter, via la perfusion, les nutriments aux cellules réparties dans le gel. Elle permet aussi de retirer les déchets métaboliques et l’insuline produits par les cellules. Le projet présenté dans ce mémoire consiste en la conception d’un dispositif pour la mise à l’essai de cette approche par des expérimentations ex vivo et in vitro. Le dispositif constitue une preuve de concept quant à l’efficacité de la méthode pour l’obtention d’un pancréas bioartificiel vascularisé et actif. / Type 1 diabetes, an immune system dysfunction that causes the attack of insulin secretory cells, is the subject of many scientific researches because of its significant negative impact on the world’s population health. Bégin- Drolet, Ruel and Hoesli research groups use the 3D printing technology of sugar fugitive ink to build embedded vascular networks in hydrogel scaffolds seeded with insulin secretory cells. Cells encapsulation in hydrogel allows them to be isolated from the immune system and provides a tridimensional support structure that mimic the natural extracellular matrix. Vascular channels resulting from the rapid casting of fugitive inks, allows adequate perfusion of nutrients supply to encapsulated cells, and transportation of metabolic wastes and secreted insulin they produce. The aim of this project, presented in this thesis, consists in designing a device to test this approach by ex vivo and in vitro experiments. The device is the proof of concept that the method of sacrificial ink molding of cell seeded hydrogel scaffolds is effective and promising for the construction of a vascularized bioartificial pancreas.