Orientador: Antonio Carlos Boschiero / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-27T05:10:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ferreira_SandraMara_D.pdf: 2032504 bytes, checksum: da4ca0c7e913b98f9a0ec91b1a14ba82 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: A ARHGAP21 é uma proteína da família das RhoGAPs (Proteínas ativadoras de GTPases Rho) que, em diferentes tipos de células, controla múltiplas funções tais como: migração, proliferação, diferenciação e tráfego intracelular de vesículas. Em ilhotas de camundongo Swiss neonato o knockdown da ARHGAP21 aumentou a secreção de insulina estimulada por glicose (GSIS), por mecanismos ainda desconhecidos. Contudo, não se conhece os efeitos da ARHGAP21 sobre a secreção de insulina e sobre a homeostase glicêmica em camundongos adultos. Assim, o objetivo do trabalho foi avaliar: a) em ilhotas pancreáticas de camundongo Swiss neonato knockdown para ARHGAP21, a expressão de genes envolvidos com a proliferação, maturação e extrusão de grânulos de insulina, bem como o rearranjo do citoesqueleto de actina; b) em camundongos C57BL/6 adultos, o efeito do knockdown da ARHGAP21 sobre GSIS e sobre alguns genes que codificam proteínas envolvidas na função secretória (maturação e extrusão) e sobre a homeostase glicêmica. Os neonatos foram tratados (i.p.) com 1 nmol de antisense anti-ARHGAP21 (neonato AS) ou mismatch (CTL) por dois dias (redução da expressão de 60%). Os adultos foram tratados (i.p.) com 1,5 nmol/g de antisense (adulto AS) ou mismatch (adulto CTL) por 3 dias consecutivos (redução de 50%). A secreção de insulina foi avaliada na presença de concentrações crescentes de glicose (2,8 - 22,2 mM). A F-actina (polímero) foi medida através da marcação com faloidina. A expressão gênica foi avaliada por PCR em tempo real. Tolerância à glicose e ao Piruvato foi medida através de ipGTT e ipPTT, respectivamente, e a sensibilidade à insulina através do ipITT, clamp hiperinsulinêmico-euglicêmico e, AKT fosforilada. Como já descrito, ilhotas de neonatos AS apresentaram maior secreção basal de insulina (2,8 mM) bem como menor presença de F-actina. Observamos também maior expressão dos genes da VAMP2 e SNAP25. Ilhotas de adultos AS apresentaram maior secreção de insulina apenas na presença de 22,2 mM. Contudo, o aumento do [Ca2+]i, induzido por glicose, foi similar ao CTL. Observou-se também aumento da expressão dos genes da SYT VII (SYNAPTOTAGMINA VII) e CX 36 (CONEXINA 36). Adultos AS apresentaram intolerância à glicose e aumento da insulinemia durante o ipGTT, acompanhado de resistência à insulina específica no músculo, além de menor produção de glicose pelo fígado. Concluímos que a ARHGAP21 modula negativamente a secreção de insulina em neonato provavelmente através do rearranjo da actina e da redução da expressão de VAMP2 e SNAP25. Em ilhotas isoladas de camundongos adultos, a ARHGAP21 modula negativamente a expressão de genes envolvidos na sensibilidade ao cálcio e resposta secretória (SYT VII e CX 36). Apesar da melhora na secreção de insulina, os adultos AS apresentaram intolerância à glicose com discreta resistência à insulina no músculo que parece ser compensada pela menor liberação de glicose pelo fígado / Abstract: ARHGAP21 is a protein of the RhoGAPs (Rho GTPases activating proteins) family that exerts several functions such as: migration, proliferation, differentiation and intracellular traffic of vesicles, in multiple cell types. In islets from Swiss mice knockdown for ARHGAP21 the glucose-induced insulin secretion (GSIS) was significantly increased, by mechanisms not yet elucidated. Although, it is still unknown the effects of ARHGAP21 knockdown on the insulin secretion and glucose homeostasis in adult mice. Here, we evaluated: a) in islets from ARHGAP21 knockdown mice the expression of genes involved in proliferation, maturation, and extrusion of the insulin containing granules, as well as on the rearrangement of the actin cytoskeleton, and b) the effect of ARHGAP21 knockdown on GSIS and on the expression of genes that encode proteins involved with the secretory function (maturation and extrusion), as well as on the glucose homeostasis in adult C57BL/6 mice. Neonatal Swiss mice received (i.p.) 1 nmol of anti-ARHGAP21 anti-sense (neonate AS) (reduction of 60%) or mismatch (neonate CTL), subcutaneously, for two days. Adult C57BL/6 mice received (i.p.) 1.5 nmol/g of anti-ARHGAP21 anti-sense (adult AS) (50% reduction) or mismatch (adult CTL) for three consecutive days. Insulin secretion was measured in the presence of increasing concentrations of glucose (2.8 ¿ 22.2 mM). F-actin (polymer) was measured using phalloidin. Gene expression was assessed by Real Time PCR. Glucose and Piruvate tolerance were measured by ipGTT and ipPTT, respectively, and insulin sensitivity by ipITT, hyperinsulinemic-euglycemic clamp, and AKT phosphorylation. Islets from neonate AS displayed higher insulin secretion at 2.8 mM glucose, and lower expression of F-actin. Higher expression of VAMP2 and SNAP25 genes was also observed. Islets from adult AS showed higher insulin secretion at 22.2 mM glucose. However, glucose-induced increase in [Ca2+]i was not different from CTL. The expression of SYT VII and CX 36 genes was also increased. Adult AS mice displayed glucose intolerance and higher insulinemia during ipGTT, accompanied by insulin resistance specifically in skeletal muscle, and a lower hepatic glucose production. In conclusion, ARHGAP21 negatively modulates insulin secretion in neonatal mice through the rearrangement of the actin cytoskeleton and reduction of the expression of VAMP2 e SNAP25 genes. ARHGAP21 also may negatively modulate the expression of genes involved in the Ca2+ sensitivity and secretory response (SYT VII and CX 36, respectively) in adult mice. Despite the higher insulin secretion, adult AS mice showed glucose intolerance associated with a mild insulin resistance in the skeletal muscle, which may be compensated by a lower glucose production in the liver / Doutorado / Fisiologia / Doutora em Biologia Funcional e Molecular

Introdução: O acesso biliar ecoguiado é um método de drenagem alternativo à drenagem percutânea transhepática (DPTH) e à cirurgia em pacientes com obstrução biliar distal incurável que falharam drenagem por Colangiopancreatografia Endoscópica Retrógrada (CPRE). Nos casos em que a drenagem ecoguiada anterógrada transpapilar (ou transanastomótica) e o rendez-vous ecoguiado não podem ser realizados como primeira opção, a coledocoduodenostomia (CDT) e a hepaticogastrostomia (HPG) ainda podem ser realizadas em pacientes selecionados. Estas duas vias de drenagem não anatômicas criam uma fístula entra a via biliar e o estômago ou duodeno. Não há dados na literatura que determinem superioridade de uma ou outra técnica. Objetivo: Comparar o sucesso técnico, sucesso clínico e fatores associados entre as duas vias de drenagem em pacientes com obstrução da via biliar distal maligna incurável que não lograram sucesso na drenagem por CPRE ou rendez-vous ecoguiado. Métodos: Entre abril de 2010 e dezembro de 2013, 49 pacientes com obstrução biliar distal maligna incurável que falharam CPRE e rendez-vous ecoguiado foram randomizados para CDT ou HPG. Dados referentes ao sucesso técnico, sucesso clínico, tempo de procedimento, complicações, qualidade de vida e sobrevida foram coletados até três meses após o procedimento. Todos os procedimentos foram realizados em um centro terciário de endoscopia pelo mesmo endoscopista. Próteses biliares parcialmente recobertas (Boston Scientific, Wallflex, 10 mm, 8 cm ou 6 cm) foram utilizadas em todos os pacientes com sucesso técnico. Nos casos de HPG a punção ecoguiada foi intra-hepática no ducto hepático esquerdo. Nos casos de CDT a punção foi extra-hepática no segmento distal não obstruído do colédoco. Após a punção foi realizada colangiografia com introdução de um fio guia hidrofílico de 0,035 polegada. Dilatação com cateter e um dispositivo de needle knife foi realizada para permitir introdução do sistema de disparo da prótese biliar com 8,5 Fr. Resultados: Quarenta e nove procedimentos foram realizados (25 HPG e 24 CDT). Todos os pacientes tinham dilatação da via biliar intra e extra-hepática. A taxa de sucesso técnico foi de 96 % para HPG e de 91% para CDT (p = 0,609). A taxa de sucesso clínico foi de 91% para o grupo HPG e de 77% para o grupo CDT (p = 0,234). No grupo da HPG 5 pacientes (20%) tiveram complicações (3 sangramentos, 2 biliomas e uma bacteremia). No grupo da CDT 3 pacientes (12,5%) tiveram complicações (1 bilioma, 1 sangramento e 1 perfuração). Somente o caso da perfuração necessitou tratamento cirúrgico. As outras complicações foram tratadas clinicamente. O tempo de procedimento médio foi de 47,83 min para a HPG e de 48,88 min para a CDT (p = 0,843). Conclusão: O presente estudo não demonstrou diferença estatisticamente significante em relação ao sucesso técnico, sucesso clínico, complicações e tempo de procedimento entre os dois grupos estudados. Mais estudos são necessários para elucidar o papel de cada via de drenagem / Background: EUS-guided biliary access is an alternative for percutaneous access or surgery in patients with malignant unresectable distal biliary obstruction and failed ERCP. When rendezvous or anterograde transpapillary/transanastomotic intervention fails as primary drainage options, a Choledochoduodenostomy (CDT) or a Hepaticogastrostomy (HGT) can still be performed in selected patients. This procedure creates a new \" \" y I w one route or the other should be recommended. Aim: To compare technical and clinical success and possible associated factors between the two different drainage routes CDT and HGT in patients with distal unresectable malignant biliary obstruction that failed standard ERCP and EUS-guided rendez vouz (RV) maneuver. Methods: Between April/2010 and December/2013 49 consecutive jaundiced patients with distal unresectable malignant biliary obstruction that failed previous ERCP and EUS-guided RV maneuver were elected randomly to undergo either EUS-guided CDT or HGT. Data including indications, clinical and technical success, procedural times and complications with a three-month follow-up were prospectively collected in a database. All procedures were performed in a tertiary center by the same endoscopist. A partially covered SEMS (Boston Scientific, Wallflex, 10 mm, 8 cm or 6 cm) was used in all technically successful procedures. After puncture of left hepatic duct in case of HGT or the distal unobstructed segment of common bile duct in case of CDT a cholangiogram was obtained followed by advancement of a 0,035-inch guide wire into the biliary system. Bougies and wire-guided needle-knife were used to perform track dilation to allow passage of an 8.5 Fr stent delivery system. Results: Forty-nine cases (25 HGT and 24 CDT) were performed. All patients had intra and extra hepatic biliary dilation. Technical success rate was 96 % for HGT and 91% for CDT (p = 0.609). Clinical success rate was 91% for HPG and 77% for CDT (p = 0.234). In the HGT group five patients (20%) had complications (3 bleeding, 2 bilomas and 1 bacteremia). In the CDT group 3 patients (12.5%) had complications (1 biloma, 1 bleeding and 1 perforation). Only the perforation patient required surgery. All other complications were managed clinically. The median procedural time was 47.83 min for HGT and 48.88 min for CDT (p = 0.843). Conclusion: No significant difference was found in regards to technical or clinical success, complications and procedure time between the two drainage routes. More studies are needed to clarify situations in which the CDT or the HGT should be advocated

A manutenção da célula de ilhotas in vitro aparece como uma estratégia atraente para aumentar o resultado do transplante de ilhotas pancreáticas. Entretanto, o destino das ilhotas em cultura é determinado pelo equilíbrio entre mediadores pró e antiapoptóticos. Nós mostramos anteriormente que os níveis de HSPB1 são aumentados pela prolactina (PRL) tanto nas células beta pancreáticas humanas quanto nas células de insulinoma murino MIN6. Além disso, mostramos que os efeitos pró- sobrevivência induzidos pela prolactina nas células beta pancreáticas são mediados pela HSPB1. Uma vez que o papel da HSPB1 nas células beta não foi estudado diretamente, procuramos explorar os mecanismos moleculares pelos quais a HSPB1 medeia a citoproteção da célula beta induzida pela PRL. Para isso, células MIN6 derivadas de um insulinoma de camundongo e cultura primária de ilhotas pancreáticas murinas (I), silenciadas ou superexpressando HSPB1 foram submetidas à privação de soro e então pré- tratadas na presença ou na ausência de PRL (300 ng / mL) e expostos a ou citocinas (IL-1β (0,8 ng / mL), IFN-γ (4 ng / mL) e TNF-α (8 ng / mL) por 16 ou 24 h. Após esses períodos de tempo foi avaliada a viabilidade celular. De fato, as células silenciadas para HSPB1 tiveram maiores porcentagens de morte celular em comparação aos controles. No entanto, a superexpressão de HSPB1 sozinha imita os efeitos citoprotectores da Prolactina em ambas as células MIN6 e nas culturas primárias das ilhotas. Estes resultados mostram o papel fundamental da HSPB1 no efeito citoprotetor inibindo a apoptose inducida pelo tratamento com citocinas pró-inflamatórias. Além disso, os lisados de células Min6 tratadas com citocinas na presença ou na ausência de PRL durante 6 h foram sujeitos a imunoprecipitação de HSPB1. Proteínas coimmunoprecipitadas separadaspor SDS-PAGE e posteriormente identificadas por nano-HPLC acoplado à espectrometria de massas. Células pré-tratadas com PRL apresentaram um enriquecimento de proteínas que coprescipitaram com HSPB1 relacionadas em processos de resistência ao estresse oxidativo, degradação proteica e metabolismo de carboidratos. Células MIN6, silenciadas ou superexpressando HSPB1 foram expostas á menadiona e peróxido de hidrogênio e parâmetros oxidativos foram analisados. O silenciamento de HSPB1 promoveu células mais sensíveis ao estresse oxidativo e levou a uma redução da capacidade antioxidante, enquanto que prolactina induziu citoproteção mediada por HSPB1 contra o estresse oxidativo. A superexpressão de HSPB1, no entanto, levou a efeitos opostos. O tratamento com PRL, o silenciamento ou superexpressão de HSPB1 não mudou a expressão de enzimas antioxidantes, mas os níveis proteicos de HSPB1 estão relacionados com a modulação da razão GSH/GSSG e a atividade de G6PD. Dado de estudos recentes reportam que o perfil respiratório das ilhotas prévias ao transplante pode predizer seu desempenho e que não se sabe nada sobre se a PRL poderia modular a função mitocondrial nas células beta; no presente projeto foi investigado se o tratamento hormonal poderia aumentar a eficiência mitocondrial das células beta. Observamos que o tratamento com citocinas pró-inflamatórias produziu uma diminuição na eficiência do consumo de oxigênio mitocondrial estar relacionado à síntese de ATP. Esses resultados foram significativamente revertidos a valores similares ao obtidos nas células submetidas Às condições de máxima viabilidade após o tratamento com PRL. Além disso, os resultados mostraram que os níveis elevados de HSPB1 medeiam este efeito, uma vez que a falta desta proteína anulou significativamente a recuperação da função mitocondrial induzida pelo tratamento hormonal. Visto que as taxas de síntese de ATP mitocondrial são as responsáveis pela elevação na sua concentração intracelular e que esse evento está diretamente relacionado com a secreção de insulina nas células beta, analisamos se diferentes níveis proteicos de HSPB1 poderia modificar a função secretora de células beta. Para isso foram calculados os índices de estímulo da secreção de insulina em resposta ao aumento da concentraçãode glicose no meio de cultura tanto em células parentais MIN6 como em culturas primárias de ilhotas pancreáticas murinas que foram submetidas ou não ao silenciamento ou superexpressão de HSPB1. Nossos resultados mostraram que nem a presença de citocinas, Prolactina, ou a ausência ou superexpressão de HSPB1 nas culturas celulares analisadas apresentaram diferença significativa em relação aos índices de estímulo da secreção e conteúdo de insulina. Esses resultados sugerem que nem a falta, nem a superexpressão de HSPB1 poderia alterar a função de célula beta. Nós mostramos a relevância da HSPB1 em ambos os efeitos pró- sobrevivência da PRL contra a morte da célula beta induzida tanto por citocinas quanto por indução de estresse oxidativo. Este último efeito poderia também estar relacionado com a participação da HSPB1 na recuperação da função mitocondrial observada após o tratamento hormonal corroborando assim parte dos resultados obtidos nos experimentos de immunoprecipitação. Finalmente, nossos resultados destacam a importância de mais estudos visando um entendimento mais profundo das funções da HSPB1 nas células beta, uma vez que elas poderiam levar à mitigação da morte da célula beta através da regulação positiva de uma via de proteção endógena, que não é dependente da modulação do sistema imunológico. / The success of islet transplantation has improved lately. Unfortunately, it is still compromised by cell loss. Maintaining islet cell in vitro appears as an attractive strategy to increase the outcome of pancreatic islet transplantation. However, islet fate in culture is determined by the balance between pro- and anti- apoptotic mediators. We have previously shown that Heat Shock Protein B1 (HSPB1) levels are increased by prolactin (PRL) on both human pancreatic beta cells and MIN6 murine insulinoma cells. Furthermore, we have demonstrated the prolactin-induced pro-survival effects on pancreatic beta-cells are mediated by HSPB1. Since HSPB1 role in beta cells has not been directly studied, we set out to explore the molecular mechanisms by which HSPB1 mediates PRL-induced beta cell cytoprotection. For this purpose, MIN6 insulinoma mouse cells and primary culture of murine pancreatic islets (I) wild type, HSPB1 silenced or overexpressing the chaperone were subjected to serum starvation and then pre-treated in the presence or in the absence of PRL (300 ng/mL) and exposed to or cytokines (IL-1β (0,8 ng/mL), IFN-γ (4 ng/mL) and TNF-α (8 ng/mL)) for 16 or 24h. Then, we analyse cell viability. HSPB1silenced cells presented higher percentages of cell death compared to controls. However, the overexpression of HSPB1, independently of hormonal treatment, was able mimic the cytoprotective effects of Prolactin. These results point at the key role of HSPB1 in the cytoprotective effect against proinflammatory cytokines-induced beta cell death. In addition, lysates from Min6 cells incubated for 6 hours in the presence of a cocktail of cytokines and/or PRL were subjected to HSPB1 immunoprecipitation. Co-precipitated proteins were identified by SDS-PAGE coupled to mass spectrometry. We found an enrichment of proteins relatedto signaling pathways involved in a response against oxidative and endoplasmic reticulum stress induction. Moreover, we also identified antiapoptotic effects and carbohydrate metabolism related proteins. Indeed, HSPB1 knockdown rendered cells more sensitive to oxidative stress and led to a reduced antioxidant capacity, while prolactin induced an HSPB1- mediated cytoprotection against ROS induced beta-cell apoptosis. One again, HSPB1 overexpression mimic PRL- induced cytoprotection. While hormonal treatment, HSPB1 silencing or overexpression did not change the expression of antioxidant enzymes; this conditions influenced reduced glutathione cell content and G6DP activity. Since recent studies have pointed that islets respiratory profile prior to transplantation may predict their performance; we also investigated whether PRL treatment could increase beta-cell mitochondrial efficiency. We observed a cytokine-induced increase of mitochondrial oxygen consumption rate not related to ATP synthesis, which was significantly decreased upon PRL treatment. HSPB1 was a key mediator of this effect since the lack of this protein significantly abrogated PRL-induced mitochondrial function recovery. The secretory function was then analysed in wild type MIN6 cells as well as in primary cultures of pancreatic islets either HSPB1 silenced or overexpressing the chaperone. Cells were subjected to serum starvation and then pre-treated in the presence or in the absence of PRL and exposed to cytokines for 16 or 24h. We didn´t found significant differences in both glucose induced-insulin secretion and insulin content between the hormonal treatment, HSPB1 silencing or overexpression. These results suggest that neither lack, nor overexpression of HSPB1 could alter beta cell function. Altogether our results have shown the importance of HSPB1 on PRL prosurvival effects as well as on maintenance of mitochondrial efficiency against both cytokine treatment and oxidative-stress-induced beta cell damage. These results are in accordance with the PRL-induced enrichment of HSPB1 interacting proteins displaying functions related to protein degradation, oxidative stress protection or mitochondrial carbohydrate metabolism.Finally, our results outline the importance of further studies aiming at a deeper understanding of HSPB1 functions on beta cells, since they could lead to the mitigation of beta cell death through the up-regulation of an endogenous protective pathway, which is not dependent on the modulation of the immune system.

O transplante de ilhotas microencapsuladas constitui uma alternativa terapêutica interessante para o Diabetes Mellitus tipo 1, permitindo um melhor controle glicêmico e eliminando a necessidade de imunossupressão. Entretanto, a manutenção a longo prazo da viabilidade das células-&#946; ainda é um desafio. No isolamento, a perda da matriz extracelular e as condições hipóxicas subsequentes afetam decisivamente a sobrevivência e funcionalidade das ilhotas. Objetivo Para diminuir o estresse sobre o enxerto, levando a um sucesso prolongado do transplante, propôs-se a adição de perfluorocarbono (PFC) ou laminina (LN), moléculas associadas respectivamente à oxigenação e interações célula-célula, ao biomaterial baseado em alginato, Biodritina, adequado ao encapsulamento celular. Metodologia Para testar a estabilidade das formulações PFC-Biodritina e LN-Biodritina, microcápsulas foram submetidas a diferentes estresses (rotacional, osmótico, temperatura e cultura) por 7 e 30 dias. A pureza do biomaterial foi avaliada pela coincubação com macrófagos murinos RAW264.7, por 3, 9 e 24h, quando a ativação dos macrófagos foi observada pela expressão gênica de IL- 1&#946; e TNF&#945;. Microcápsulas implantadas i.p. em camundongos foram recuperadas após 7 ou 30 dias, para análises de biocompatibilidade. A expressão de níveis de mRNA (bax, bad, bcl-2, bcl-XL, xiap, caspase 3, mcp1/ccl2, hsp70, ldh, insulina 1 e 2), proteínas (Bax, Bcl-XL e Xiap) e a atividade de Caspase3 foram avaliadas em ilhotas microencapsuladas com PFC- e LN-Biodritina, após cultura de 48h em condições de normóxia e hipóxia (<2% O2). Camundongos diabéticos foram transplantados com ilhotas encapsuladas nas diferentes formulações e os animais foram monitorados pelas variações de massa corporal, glicêmicas e pela funcionalidade do enxerto (TOTGs). As ilhotas foram recuperadas de animais normo ou hiperglicêmicos e uma análise de biocompatibilidade das cápsulas foi realizada, assim como a avaliação funcional das células-&#946;. Após o explante, a glicemia dos animais normoglicêmicos foi monitorada para se atestar a eficiência das ilhotas transplantadas. Resultados Microcápsulas de PFC- e LN-Biodritina são tão estáveis e biocompatíveis quanto as de Biodritina. Para ilhotas encapsuladas em ambos os materiais, em normóxia ou hipóxia, observou-se uma modulação gênica que sugere proteção contra apoptose. Adicionalmente, encontrou-se uma diminuição na expressão de genes indicadores de estresse (mcp1, hsp70). Uma diminuição nos níveis de mRNA de ldh foi vista para PFC-Biodritina, mas o oposto foi encontrado para LN-Biodritina. As diferenças encontradas na expressão proteica sugerem o mesmo padrão anti-apoptótico. Caspase3 não foi modulada por nenhum biomaterial. Nos experimentos de transplante, apenas LN-Biodritina levou reversão prolongada do diabetes, com 60% dos animais normoglicêmicos, 198 dias pós-cirurgia, comparado a 9% do grupo Biodritina. O TOTG demonstrou que camundongos transplantados com ilhotas encapsuladas secretaram mais insulina do que controles, 60 (LN-Biodritina) ou 100 (PFC- e LN-Biodritina) dias pós-cirurgia. O explante restabeleceu a hiperglicemia nos camundongos. Microcápsulas recuperadas de animais hiperglicêmicos apresentavam uma extensa adesão celular. Testes de secreção de insulina in vitro demonstraram que somente ilhotas do grupo normoglicêmico responderam às variações da concentração de glicose. Conclusão A adição de moléculas bioativas à Biodritina é capaz de diminuir o estresse em ilhotas isoladas e tem o potencial de melhorar a terapia pelo transplante de ilhotas. / Transplantation of microencapsulated islets represents an attractive therapeutical approach to treat type 1 Diabetes Mellitus, accounting for an improved glycemic control and the abolishment of immunosuppressive therapies. However, maintenance of long-term &#946;-cell viability remains a major problem. During islet isolation, the loss of extracellular matrix interactions and the hypoxic conditions thereafter dramatically affect &#946;-cell survival and function. Objective To lessen the burden of islet stress and achieve a better outcome in islet transplantation we tested the addition of perfluorocarbon (PFC) or laminin (LN), molecules associated respectively with oxygenation and cell-cell interaction, to Biodritin, an alginate-based material suitable for cell microencapsulation. Methodology To test the stability of PFC-Biodritin and LN-Biodritin composites, microcapsules were subjected to different stresses (rotational, osmotic, temperature and culture) for 7 and 30 days. To assess biomaterial purity microcapsules were co-incubated with RAW264.7 murine macrophage cell line for 3, 9 and 24h and macrophage activation was detected through mRNA levels of IL-1&#946; and TNF&#945;. Microcapsules were implanted i.p. in mice and retrieved after 7 or 30 days, for biocompatibility analyses. Gene expression at mRNA (bax, bad, bcl-2, bcl-XL, xiap, caspase 3, mcp1/ccl2, hsp70, ldh, insulin 1 and 2) and protein (Bax, Bcl-XL and Xiap) levels, together with Caspase3 activity, were evaluated in islets microencapsulated in PFC- or LN-Biodritin, upon culturing for 48h in normoxic or hypoxic (<2% O2) conditions. Diabetic mice were transplanted with PFC- or LN-Biodritin microencapsulated islets, followed by assessments of body weight, glycemia and graft function by oral glucose tolerance tests (OGTTs). Microencapsulated islets were retrieved from normoglycemic or hyperglycemic mice and biocompatibility analyses of the beads together with a functional assessment of the graft followed. After graft removal, normoglycemic animals had their glycemias monitored to attest the efficacy of the transplanted islets. Results PFC- and LN-Biodritin microcapsules were as stable and biocompatible as Biodritin. For both biomaterials in normoxia and hypoxia a modulation in gene expression was observed in islets associated with a protection against apoptosis. Also, a decreased expression of stress-related genes (mcp1, hsp70) was evidenced. ldh mRNA levels were down-regulated in PFC-Biodritin microencapsulated islets but upregulated in the presence of LN. Increased levels of insulin mRNA were observed. The differences seen in protein expression indicated the same anti-apoptotic pattern. Caspase3 activity was not different between groups. Concerning diabetes reversal experiments, only mice transplanted with LN-Biodritin microencapsulated islets presented a better outcome, with 60% remaining euglycemic at 198 days post-surgery, compared with 9% for the Biodritin group. OGTT showed that mice transplanted with encapsulated islets secreted more insulin than normal mice, 60 (LN-Biodritin) or 100 days (PFC- and LN-Biodritina) posttransplant. Hyperglycemia was achieved after the retrieval of microcapsules showing graft efficacy. Retrieved microcapsules revealed an extensive overgrowth in most beads from hyperglycemic mice. A static glucose stimulated insulin secretion test revealed that only islets from normoglycemic subjects were able to secrete insulin according to glucose concentration. Conclusion- The addition of bioactive molecules to Biodritin may lessen the stress of isolated islets and have the potential to improve islet transplantation therapy.

O receptor ativado do peroxissomo &#947; (PPAR-&#947;) é regulador do metabolismo e diferenciação do tecido adiposo, sendo um alvo conhecido das tiazolidinedionas (TZD), utilizadas para o tratamento do diabetes tipo 2 (DM2). As TZD agem como um agente sensibilizador da ação da insulina nos tecidos periféricos e tem sido especulado que as TZDs podem ter um papel na função da célula , prevenindo perda de massa e melhorando a sua viabilidade a longo prazo. Este efeito seria supostamente mediado pela transcrição de genes que favoreceriam a lipólise, diminuindo o conteúdo intracelular de triglicérides e, portanto, diminuindo a lipotoxicidade. Entretanto, alguns estudos também mostraram efeito nulo ou mesmo deletério das TZDs sobre as ilhotas pancreáticas. Na realidade, o papel de genes-alvo para o PPAR- nas ilhotas pancreáticas é ainda pouco conhecido. Estudamos o perfil de expressão gênica induzido pelo tratamento com Pioglitazona (Pio), uma TZD aprovada e disponível para uso clínico no tratamento do DM2, em ilhotas pancreáticas murídeas em cultura primária, com concentrações normal e suprafisiológica de glicose no meio de cultura. As ilhotas foram obtidas de ratos wistar machos de dois meses de idade e isoladas pelo método do gradiente de Ficoll e então cultivadas em 5,6 mM ou 23 mM de glicose por 24h, sendo tratadas com Pio 10 M ou DMSO 0,1% (veículo). A Pioglitazona foi cedida pela Takeda Farmacêutica, Osaka, Japão. O RNA foi extraído com Trizol e purificado com o kit RNeasy (Qiagen). As amostras foram marcadas e hibridizadas no microarranjo de cDNA Mouse Panchip 13k, usando-se cinco replicatas biológicas diferentes para cada condição. A análise estatística dos dados do microarranjo foi feita com o uso do programa significance analysis of microarrays (SAM) com uso de taxa de descobrimento falso (FDR) de 20%. A análise das vias acometidas foi feita com o Ingenuity Pathway Analysis (www.ingenuity.com). Os resultados de expressão gênica foram confirmados por RT-qPCR. Em concentração de 5,6 mM de glicose no meio de cultura, 101 genes foram modulados pela Pio, sendo 49 regulados para cima, com aumento de sua expressão na presença da droga e 52 genes regulados para baixo. Em 23 mM de glicose, 1.235 genes foram afetados, sendo 621 para cima e 623 para baixo. A comparação entre as duas condições revelou 74 genes que foram modulados em ambas as concentrações de glicose. A análise das vias biológicas alteradas mostrou que genes relacionados ao metabolismo de lípides foram modulados em ambas as concentrações de glicose. Em 23 mM foi ainda significativo o grupo de genes relacionados a ciclo celular e morte celular que tiveram sua expressão modificada pela presença da droga na cultura. Este dado demonstrou que além de seus efeitos conhecidos nos adipócitos, o sensibilizador de insulina Pioglitazona modula a expressão de genes nas ilhotas pancreáticas, especialmente na presença de concentrações suprafisiológicas de glicose, afetando notadamente genes relacionados ao metabolismo lipídico, sendo vários deles ligados a lipogênese, como Srebf1, Scd2 e Fabp4 cujas expressões aumentaram em ambas as concentrações de glicose. Além disso foi observado aumento na expressão de genes com atividade pró-apoptótica como Tnf, Bad, Bax, Caspase4, Fadd e Myc. A Pioglitazona parece induzir um perfil gênico desfavorável em ilhotas pancreáticas mantidas em cultura em concentrações suprafisiológicas de glicose. / Peroxisome proliferator-activator receptor-&#947; (PPAR-&#947;) is a target for thiazolidinedione (TZD) antidiabetic drugs and a regulator of adipose tissue differentiation and metabolism. TZD act as an insulin sensitizing agent on peripheral tissues. It has been speculated that TZD could play a role on beta-cell function, preventing loss and improving viability in the long-term. This effect is supposed to be mediated through a potential benefit against lipotoxicity, favouring lypolisis and decreasing intracellular tryglicerides content. Nevertheless some studies also showed a lack or even a potential deleterious effect of TZD on islets. The role of PPAR-&#947; target genes in pancreatic islets is actually still largely unclear. We studied the gene expression profile induced by the treatment with Pioglitazone (Pio), an approved TZD for T2DM therapy, on rat pancreatic islets primary culture both at normal and supraphysiological glucose medium concentrations. Islets were obtained from 2 month-old, male, wistar rats and isolated through the Ficoll gradient method and then cultured with 5.6 mM or 23 mM of glucose concentration for 24h, being treated with Pio 10 µM or DMSO 0.1% (vehicle). Pioglitazone was provided by Takeda Pharmaceuticals, Osaka, Japan. RNA was extracted with Trizol (Sigma) and purified with RNeasy kit (Qiagen). Samples were labeled and then hybridized on the Mouse PanChip 13k cDNA microarray, using 5 different biological replicates for each test condition. Statistical Analysis of the microarray data was performed using significance analysis of microarrays (SAM) with a false discovery rate of 20%. Pathways assessment was performed through Ingenuity Pathway Analysis (www.ingenuity.com). Gene expression results were confirmed through RT-qPCR. At 5.6 mM glucose 101 genes were modulated by Pio, 49 upregulated and 52 downregulated. At 23 mM, 1,235 genes were affected, 612 upregulated and 623 downregulated. Comparison between both conditions revealed 74 genes that were similarly modulated at both glucose concentrations. Pathway analysis of perturbed genes revealed biologically relevant networks related to lipid metabolism at both glucose medium concentrations. At 23 mM, cell cycle and cell death pathways were significant modulated as well. These data demonstrates that in addition to known effect in adipocytes, the insulin sensitizing agent Pioglitazone modulates gene expression in pancreatic islets, especially in the presence of supraphysiological glucose concentrations, affecting especially lipid metabolism and mechanisms of cell death and cell cycle. Considering the ontology of modulated genes it seems to be a trend towards lypogenesis (increased Srebf1, Scd2 and Fabp4 RNA expressions) with Pio treatment also enhancing the abundance of some genes considered to be pro apoptotic like Tnf, Bad, Bax, Caspase4, Fadd and Myc. Pioglitazone seems to induce a negative gene expression profile in islets cultured at high glucose concentrations.

A suplementação dietética com AGCM induz resistência à insulina, redução de peso ponderal e aumento da adiposidade em ratos Wistar. Adipócitos isolados apresentam reduzidas captação de glicose estimulada por insulina e atividade/fosforilação da proteína AMPK. A expressão protéica do IR no tecido hepático está aumentada em animais tratados com AGCM com redução do grau de fosforilação, enquanto que o grau de fosforilação da proteína AKT permaneceu semelhante entre os grupos. Ilhotas pancreáticas isoladas apresentam redução na secreção de insulina quando incubadas com altas concentrações de glicose, diminuição do conteúdo total de insulina, hipersensibilidade a leucina e/ou arginina e aumento do percentual de morte celular com diminuída expressão da proteína AKT_1 . Desta forma, utilização em longo prazo dessa estratégia nutricional pode interferir no crescimento normal do indivíduo, na sensibilidade à insulina e possívelmente, desenvolvimento e instalação do diabetes. / The introduction of MCFA into diet induces insulin resistance, reduced body weight gain, and increased adiposity in Wistar rats. Isolated adipocytes have reduced insulin induced glucose uptake and phosphorylation/activation of AMPK protein. The insulin receptor protein expression is increased in liver of MCFA fed rats accompanied by reduced tyrosine phosphorylation, with similar AKT serine phosphorylation. Isolated pancreatic islets had reduced glucose stimulated insulin secretion due to high glucose exposure and reduced insulin content; higher insulin secretion induced by leucine and arginine, and increased apoptosis with reduced AKT protein level. In these regard, the chronic ingestion of MCFA may interfere with normal body growth, with the insulin sensitivity and may participate with the development of diabetes.

O transplante de ilhotas pancreáticas humanas é considerado uma estratégia promissora para curar pacientes portadores de Diabetes Mellitus tipo 1. Entretanto, sua eficiência é dramaticamente afetada pelo rendimento das ilhotas no processo de isolamento/purificação e pela viabilidade das células após o transplante. As ilhotas pancreáticas isoladas são obtidas através da perfusão do pâncreas com colagenase e purificação em gradiente de densidade. As espécies reativas de oxigênio (ERO) exercem um papel importante durante a obtenção e o transplante de ilhotas pancreáticas humanas, contribuindo significativamente para diminuir a viabilidade dessas células. Nesse trabalho foram avaliadas as respostas oxidativas de ilhotas pancreáticas humanas durante os processos de isolamento/purificação e cultivo. As atividades da superóxido dismutase (SOD), da catalase, bem como os níveis de oxidação em proteínas mostraram-se, na maioria dos casos, aumentados, principalmente durante a etapa de purificação das ilhotas em gradiente de Ficoll e no período de cultura das ilhotas. Esses resultados indicam que a purificação em gradiente de Ficoll parece ser uma etapa crítica de geração das ERO, assim como longos períodos de cultivo. Porém, verificou-se que influências advindas dos diferentes doadores (idade, causa- mortis, estilo de vida, etc.) e condições de preservação do órgão (tempo de isquemia, solução de conservação, etc.) poderiam estar relacionadas à discrepância de alguns resultados encontrados. Com o intuito de minimizar tais variáveis, optou-se por estudar os efeitos relacionados ao Ficoll em células de insulinoma INS-1E, um modelo celular fisiologicamente semelhante. Para tanto, as atividades das enzimas antioxidantes SOD, catalase, glutationa peroxidase (GPx) e glutationa redutase (GR), assim como os danos oxidativos em proteínas e lipídeos, os níveis de glutationa reduzida (GSH) e de glutationa oxidada (GSSG), a viabilidade celular e os níveis de algumas enzimas envolvidas no processo apoptótico como p38, JNK-1, ERK 1-2 e PI3-K expostas a polissacarose (1100 mg/mL), um genérico do Ficoll, foram determinadas. De acordo com os resultados, as atividades da SOD, catalase e GPx presentes em amostras expostas a polissacarose mostraram-se aumentadas. Em cultura, a atividade de isoforma mitocondrial da SOD (Mn-SOD) de células INS-1E correspondeu a 50% da atividade total da SOD. Na presença da polissacarose, a atividade da Mn-SOD aumentou para 80% do total. Além disso, a oxidação de lipídios e de proteínas aumentou e os níveis de GSH e GR diminuíram discretamente. Estes resultados mostraram que a exposição dessas células a polissacarose está associada com o estresse oxidativo. Entretanto, tal exposição não foi responsável pela diminuição da viabilidade celular embora os níveis protéicos de JNK-1, ERK1-2 e PI3-K tenham se mostrado consideravelmente aumentados e os níveis de p38, diminuídos. Os níveis de expressão e a atividade de enzimas antioxidantes são conhecidamente baixos em ilhotas pancreáticas. A N-acetilcisteína (NAC) foi adicionada em cultura de células para prevenir o estresse oxidativo. Nessas condições, a NAC foi capaz de proteger as células INS-1E do estresse oxidativo induzido. Esses resultados sugerem que a exposição à polissacarose está associdada ao estresse oxidativo em células INS-1E e que a NAC foi capaz de prevenir a morte celular de células INS-1E expostas a ERO através do aumento intracelular de GSH. / Human pancreatic islet transplantation is considered a promising strategy to cure the cure Diabetes Mellitus type I. However, transplantation efficiency is dramatically affected by sub-optimum islet recovery in the isolation/purification procedure and islet viability after transplantation. Isolated pancreatic islets are obtained through collagenase perfusion and cell purification in a Ficoll gradient. Reactive oxygen species (ROS) play an important role during human pancreatic islet isolation and may contribute to the decrease in cell viability. The aim of this study was evaluated the response of human pancreatic islets during its isolation/purification and culture time. Activities of superoxide dismutase (SOD) and catalase as well as protein oxidation levels increased in most of analyzed samples, mainly during the Ficoll gradient islet purification step and further culture. Ficoll seems to be the critical step for ROS generation. Nevertheless, it was observed that donors characteristics (aging, cause of death, habits, etc.) and organ preservation conditions (ischemic time, preservation solution, etc.) may be related to our results. To minimize these variations, a physiological cellular model based on INS-1E cells was chosen. The antioxidant enzymes SOD, catalase, glutathione peroxidase (GPx) and glutathione reductase (GR) activities as well the oxidative damage to proteins and lipids, reduced glutathione (GSH) and oxidized glutathione (GSSG) levels, cellular viability and the protein levels of some enzymes responsible for apoptotic signaling like p38, JNK-1, ERK 1-2 and PI3-K upon exposure to polysucrose (1100 mg/mL), a similar of Ficoll, were determined. The SOD, catalase and GPx in samples exposed to polysucrose displayed hight activities. In all cultures, the activity of mitochondrial isoform of SOD (Mn-SOD) corresponds to 50% of total SOD activity. In the presence of polysucrose, the activity of Mn-SOD increased up to 80%. Lipids and protein oxidation levels were also increased and the GSH levels with the GR activity decreased. These results indicated that the exposure of INS-1E cells to polysucrose is associated with oxidative stress. However, the polysucrose exposure was not responsible for cell death although JNK-1, ERK1-2 and PI3-K levels showed hight levels but not p38, upon polysucrose exposure. The expression and activities of antioxidants enzymes are known to be very low in pancreatic islets. N-acetylcysteine (NAC) was added to the INS-1E cultures to prevent oxidative stress. Under these conditions, NAC was able to protect INS- 1E cells from induced oxidative damage by increasing intracellular GSH levels. Taken together, these results suggest that the exposure to polysucrose is related to the oxidative stress in INS-1E cells and NAC seems to be able to maintain cell viability.

Neste projeto, demonstramos a modulação da enzima NAD(P)H oxidase pela glicose, palmitato e interleucina - 1? através da análise da expressão protéica do componente p47PHOX e pela atividade dessa enzima via produção de superóxido e peróxido de hidrogênio. Demonstramos também a participação da enzima NAD(P)H oxidase no processo de secreção de insulina induzido pela glicose pois a inibição da enzima pelo DPI e oligonucleotídeo anti p47PHOX promoveu uma diminuição da secreção do hormônio. A partir desse dado passamos a avaliar o mecanismo de ação da enzima no processo secretório e demonstramos que a inibição dessa enzima promove uma inibição de genes essenciais no processo de secreção de insulina como GLUT-2 e glicocinase.Assim podemos concluir que a enzima NAD(P)H oxidase é modulada pela glicose, palmitato e interleucina 1? e que essa enzima participa do processo de secreção insulina modulando genes essenciais para o processo secretório como GLUT-2 e glicocinase. / The expression and activity of the componenents of NAD(P)H oxidase in pancreatic islets were described for the first time in our laboratory (OLIVEIRA, HR et ai, 2003). It was shown the gene and protein expression of the components of this enzyme in Seta cells and that enzyme activation is mediated by glucose. Glucose induced insulin secretion was followed by increase in EROS generation and this increase was in part mediated by NAD(P)H oxidase activation (the same mechanism observed in phagocytes). In this study, the modulation of NAD(P)H oxidase activity by glucose, palmitate and interleukin 1ß as investigated through protein expression of p47phox vity of this enzyme through superoxide and hydrogen peroxide production. To determinate the role of NAD(P)H oxidase in the process of glucoseinduced insulin secretion the enzyme was inhibited by DPI and oligonucleotide anti p47phox, in the both cases the enzyme inhibition produced a decrease on insulin secretion. In order to investigated NAD(P)H oxidase mechanism of action in insulin secretion, we shown that the inhibition enzyme by DPI reduced the GLUT-2 and glucokinase gene expression. We can concluded hat NAD(P)H oxidase was modulated by glucose, palmitate and interleukin 1ß and that enzyme participed in process of glucoseinduced insulin secretion through modulation of GLUT-2 and glucokinase gene expression.

Pancreatic acinar cells display plasticity to acquire distinct differentiation programs, being involved in diseases as chronic pancreatitis and pancreatic ductal adenocarcinoma. This work shows that acinar cells cultured in suspension undergo dedifferentiation, acquiring a pancreatic embryonic progenitor phenotype. Dedifferentiated cells turn on a senescent program, associated with activation of p53 and Ras pathways. A similar progenitor‐like phenotype with activation of senescence is present in experimental chronic pancreatitis. Acinar cultures lacking p53 overcome growth arrest and lose the pancreatic phenotype, undergoing an epithelial‐mesenchymal transition, while maintaining the expression of pre‐pancreatic endoderm and stem cell markers. In experimental acute pancreatitis, absence of p53 results in increased acinar cell proliferation and delayed regeneration. Our findings support a role for acinar cell dedifferentiation in the initiation of pancreatic diseases. A p53‐ dependent control of cell growth and epithelial differentiation constitutes a tumor suppressive mechanism that may limit PDAC development. / Las células pancreáticas acinares poseen plasticidad que les permite adquirir distintos programas de diferenciación, estando implicadas en enfermedades como la pancreatitis crónica y el adenocarcinoma ductal pancreático. En este trabajo hemos demostrado que las células acinares cultivadas en suspensión se desdiferencian, adquiriendo un fenotipo de progenitores pancreáticos embrionarios. En estas células se induce un programa de senescencia asociado con la activación de las vías de p53 y Ras. Un fenotipo similar se evidencia en modelos de pancreatitis crónica experimental. Cultivos acinares en los que se ha inactivado p53 sobrepasan el bloqueo de crecimiento y pierden el fenotipo pancreático, presentando una transición epitelio‐mesenquimal y manteniendo la expresión de marcadores de endodermo pre‐pancreático y de células madre. Durante la inducción de una pancreatitis aguda experimental, la ausencia de p53 resulta en un incremento de la proliferación acinar y en un retraso en la regeneración. Nuestros resultados demuestran que la desdiferenciación de las células acinares participa en el desarrollo de enfermedades pancreáticas. El control del crecimiento celular y de la diferenciación pancreática epitelial dependiente de p53 constituye un mecanismo de supresión tumoral que puede limitar el desarrollo del PDAC.

Objetivo: Avaliar os efeitos da obesidade materna sobre a estrutura do pâncreas e metabolismo de carboidratos no início da vida adulta, com foco na prole da primeira geração (F1) e segunda geração (F2) de progenitoras F0 alimentadas com dieta rica em gordura nos períodos pré-gestacional, durante a gestação e lactação. Métodos: Camundongos C57BL/6 do gênero feminino (F0) foram alimentadas com dieta padrão (SC) ou dieta rica em gordura (HF) durante as oito semanas que antecederam o acasalamento, durante a gestação e lactação para gerar a F1 (F1-SC e F1-HF). As proles geradas receberam dieta SC até o terceiro mês de vida. Aos três meses de idade, fêmeas F1 foram acasaladas para gerar a F2 (F2-SC e F2-HF). Apenas os machos das geração F1 e F2 foram avaliados aos 3 meses de idade. As características metabólicas foram avaliadas pela massa corporal (MC), glicemia de jejum, área sob a curva no teste oral de tolerância a glicose; análise plasmática de insulina, leptina e adiponectina; distribuição e análise morfológica do pâncreas através da imunohistoquímica e imunofluorescência. Resultados: A prole F1-HF teve aumento significativo na massa corporal e glicemia quando comparado à F1-SC. Por outro lado, as proles F2-HF e F2-SC tiveram massas corporais semelhantes. A prole F1-HF e F2-HF mostrou aumento da ingestão de energia, intolerância à glicose, hiperinsulinemia, hiperleptinemia, hipoadiponectinemia, resistência à insulina, aumento da massa pancreática, o aumento da densidade de volume de ilhotas com elevada massa de células alfa e beta, ilhotas hipertrofiadas caracterizadas por uma distribuição alterada de células alfa e beta, e fraca imunoreatividade do pâncreas homeobox duodeno-1 (PDx1). Conclusões: Uma dieta HF materna consumida durante o período pré-concepção e durante toda a gestação e lactação em camundongos promoveu programação metabólica do pâncreas endócrino com pré-disposição ao diabetes mellitus tipo 2 precoce nas proles F1 e F2 do gênero masculino, sugerindo que essas mudanças são intergeracionais. / To evaluate the effects of maternal obesity upon pancreas structure and carbohydrate metabolism in early adult life, focusing on F1 and F2 generations of F0 dams fed high-fat diet during the pre-pregnancy, gestation, and lactation periods. Methods: C57BL/6 female mice (F0) were fed standard chow (SC) or HF diet for 8 weeks prior to mating and during gestation and lactation to provide F1 generation (F1-SC and F1-HF). At 3 months of age, F1 females were mated to produce F2 generation (F2-SC and F2-HF). Male offspring from all groups were evaluated at 3 months of age. Results: F1-HF offspring had significantly higher body mass and glycemia than F1-SC offspring. Conversely, F2-HF and F2-SC offspring had similar body masses. F1-HF and F2-HF offspring showed increased energy intake, glucose intolerance, hyperinsulinemia, hyperleptinemia, hypoadiponectinemia, insulin resistance, increased pancreatic mass, increased islet volume density with elevated alpha and beta cell mass, hypertrophied islets characterized by an altered distribution of alpha and beta cells, and weak pancreatic-duodenal homeobox (Pdx1) immunoreactivity. Conclusions: A maternal HF diet consumed during the preconception period and throughout the gestation and lactation in mice promotes metabolic and pancreatic programming in F1 and F2 male offspring, suggesting that these changes are intergenerational.