INTRODUÇÃO: O adenocarcinoma de pâncreas apresenta um mau prognóstico. A utilização de modelos experimentais é necessária para a compreensão do comportamento biológico tumoral, principalmente das lesões precoces (neoplasias intra-epiteliais pancreáticas - NIPan) e para o desenvolvimento de opções terapêuticas. OBJETIVO: Avaliar a carcinogênese pancreática induzida por 7,12-dimetilbenzantraceno (DMBA), em camundongos, aplicando a classificação das neoplasias intra-epiteliais pancreáticas. MÉTODOS: 90 camundongos machos, mus musculus, da cepa CF1, foram submetidos à laparotomia mediana e 1 mg de DMBA foi implantado na porção cefálica do pâncreas. Os animais foram divididos em dois grupos, com eutanásia em 30 e 60 dias. Em seguida, o pâncreas foi retirado, fixado em formalina e foram confeccionadas lâminas coradas com hematoxilina eosina. Os cortes histológicos foram avaliados por dois patologistas de acordo com os seguintes critérios: pâncreas normal, hiperplasia reacional, NIPan 1A, NIPan 1B, NIPan 2, NIPan 3 e carcinoma. As alterações inflamatórias também foram analisadas. RESULTADOS: A avaliação patológica evidenciou, no grupo de 30 dias: 4 (16,7%) animais com hiperplasia reativa, 16 (66,6%) com NIPan e 4 (16,7%) com adenocarcinoma. No grupo de 60 dias: 10 (27,1%) animais com hiperplasia reativa, 13 (35,1%) com NIPan e 14 (37,8%) com adenocarcinoma. A diferença entre os grupos apresentou significância estatistística (P < 0,05 – teste exato de Fisher). A prevalência de alterações inflamatórias em 30 dias foi: pancreatite aguda (n=11), pancreatite crônica (n=5) e inflamação dependente da bolsa (n=8). No grupo de 60 dias 11 espécimes apresentavam pancreatite aguda e 26 pancreatite crônica. CONCLUSÕES: O modelo experimental com DMBA em camundongos, induz neoplasia intra-epitelial pancreática e adenocarcinoma ductal histologicamente semelhantes ao carcinoma pancreático em humanos. Este modelo pode ser utilizado na investigação da carcinogênese com enfoque na progressão molecular das lesões precursoras até o adenocarcinoma. / BACKGROUND: Pancreatic adenocarcinoma has a dismal long-term prognosis. Experimental models are necessary to understand its biological behavior mainly the early pancreatic lesions termed pancreatic intraepithelial neoplasia (PanIN) and to develop new treatments. OBJECTIVE: The aim of this study is to evaluate pancreatic carcinogenesis induced by DMBA implantation in mice according to PanIN classification system. METHODS: 90 male, mus musculus, CF1 mice were submitted to a median laparotomy and 1 mg of DMBA was implanted in the head of the pancreas holded with a purse-string suture. Euthanasia was done after 30 and 60 days. After, the excised pancreata were fixed in formalin, embedded in paraffin and stained with haematoxylin and eosin for histology. The specimens were evaluated by two pathologists according to the following criteria: normal ducts, reactive hyperplasia, PanIN 1A, PanIN 1B, PanIN 2, PanIN 3 and carcinoma. The inflammatory changes were also analyzed. RESULTS: The pathologic evaluation showed for 30 days group 4 (16.7%) reactive hyperplasia, 16 (66.6%) PanIN and 4 (16.7%) adenocarcinomas. In the 60 days group there were 10 (27.1%) specimens with reactive hyperplasia, 13 (35.1%) with PanIN lesions and 14 (37.8%) with adenocarcinomas. The difference between groups was statistically significant (P < 0,05; Fisher exact test). The prevalence of inflammatory changes in 30 days groups were: acute pancreatitis (n=11), chronic pancreatitis (n=5) and DMBA pocket dependent (n=8). In the 60 days groups, 11 had acute pancreatitis and 26 had chronic pancreatitis. CONCLUSIONS: DMBA experimental model in mice induces characteristic pancreatic intraepithelial neoplasia and ductal adenocarcinoma histologically similar to human pancreatic cancer. This model is useful for the study of pancreatic carcinogenesis emphasizing the molecular progression of early pancreatic lesions.

A suplementação dietética com AGCM induz resistência à insulina, redução de peso ponderal e aumento da adiposidade em ratos Wistar. Adipócitos isolados apresentam reduzidas captação de glicose estimulada por insulina e atividade/fosforilação da proteína AMPK. A expressão protéica do IR no tecido hepático está aumentada em animais tratados com AGCM com redução do grau de fosforilação, enquanto que o grau de fosforilação da proteína AKT permaneceu semelhante entre os grupos. Ilhotas pancreáticas isoladas apresentam redução na secreção de insulina quando incubadas com altas concentrações de glicose, diminuição do conteúdo total de insulina, hipersensibilidade a leucina e/ou arginina e aumento do percentual de morte celular com diminuída expressão da proteína AKT_1 . Desta forma, utilização em longo prazo dessa estratégia nutricional pode interferir no crescimento normal do indivíduo, na sensibilidade à insulina e possívelmente, desenvolvimento e instalação do diabetes. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT: The introduction of MCFA into diet induces insulin resistance, reduced body weight gain, and increased adiposity in Wistar rats. Isolated adipocytes have reduced insulin induced glucose uptake and phosphorylation/activation of AMPK protein. The insulin receptor protein expression is increased in liver of MCFA fed rats accompanied by reduced tyrosine phosphorylation, with similar AKT serine phosphorylation. Isolated pancreatic islets had reduced glucose stimulated insulin secretion due to high glucose exposure and reduced insulin content; higher insulin secretion induced by leucine and arginine, and increased apoptosis with reduced AKT protein level. In these regard, the chronic ingestion of MCFA may interfere with normal body growth, with the insulin sensitivity and may participate with the development of diabetes.

Orientador: Everardo Magalhães Carneiro / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-06T11:23:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Filiputti_Eliane_D.pdf: 3662221 bytes, checksum: e40ea0446558f8556a8352fd8c98a5fc (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Suspeita-se que a desnutrição intra-uterina e pós-natal produzam mudanças morfológicas e funcionais no pâncreas endócrino e em tecidos periféricos, que se traduzem em insulinopenia e resistência à insulina. Baseado nessas complicações avaliou-se neste trabalho a regulação da secreção de insulina em ilhotas de Langerhans de ratos e camundongos submetidos à restrição protéica e suplementados com leucina. A suplementação com leucina não modificou hábitos alimentares, ingestão hídrica e o peso corpóreo dos animais em estudo, mas alterou parâmetros bioquímicos importantes como glicose (G), ácidos graxos (AGL) em animais desnutridos. A fosforilação do receptor de insulina (IR) e de seu substrato (IRS-l) foi modificada em fígado e músculo levando a uma melhoria na homeostasia glicêmica em ratos desnutridos, a metabolismo de glicose em ilhotas de ratos controle e desnutridos teve redução após suplementação, a potencial de membrana das células B foi restaurado, o movimento de cálcio citoplasmático e a secreção de insulina estimulada por G e leucina apresentaram aumentados em ilhotas de ratos e camundongos desnutridos. Alterações ocorreram também no perfil eletroforético de proteínas citoplasmáticas após suplementação com leucina em ilhotas de ratos. Expressão gênica e protéica de proteínas chaves na cascata de sinalização de insulina como IR, IRS-l, PI3K, mTaR e S6K-l se alteraram em resposta à suplementação com leucina em ilhotas de ratos desnutridos, favorecendo vias de crescimento, em especial o aumento da PI3K a qual resultou em aumento de sua atividade em ilhotas de ratos controle e desnutridos. Por fim, podemos concluir que a suplementação com leucina promoveu modulação da sensibilidade periférica em fígado e músculo de maneira tecido específica. Isto confere uma regulação da homeostase glicêmica de maneira distinta entre animais controle e desnutridos suplementados. Além disso, direcionam para que os sinais metabólicos produzidos pela leucina devam promover seus efeitos, em ilhotas de Langerhans, via dois sensores: a GDH que controla a glutaminólise, e por outro lado está a PI3K que deve exercer seu papel, ativando vis envolvidas com a síntese protéica através da mTOR. Estes dois sensores devem atuar sinergicamente participando do rearranjo da concentração citosólica dos íons cálcio, principalmente em ilhotas de animais desnutridos que foram suplementados com leucina / Abstract: We think that intra-uterine mal nutrition and after birth produce morphological and changes in endocrine pancreas and in peripheric tissue that translate insulinopenia and insulin resistance. Based on these complications we have evaluated in this work the insulin secretion regulation in Langerhans islets from rats and mice fed a low protein diet and supplemented with leucine. The leucine supplementation hasn't changed the diet in the hybrid ingest and body weight but has changed important biochemistry standards as glucose (G) and FFA in malnutrition animals. The insulin receptor phosphorilation and its substract have been changed in liver and musc1e leading to an increase in glicemic homeostase in malnutrition rats. The glucose metabolism in control and malnutrition rats' islets had one reduction after supplementation. B cells potential membranes were restored; the citoplasmatic ca1cium movement and insulin secretion were stimulated by glucose and leucine. They have showed an increased in islets of control and malnourished rats and mice islets. Some alterations have also occurred in the citoplasmatic protein eletrophoretic profile after leucine supplementation in rats islets. The genetic and protein expression from key enzymes in the insulin cascade signalization as: IR; IRS-l; PI3K; mTOR and S6K-l have altered in leucine supplementation answer in malnutrition islets rats favoring growth pathways specially PI3K increase which resulted in an increasement of control and malnutrition rats islets activity. In the end we can conc1ude that the leucine supplementation has promoted peripheric sensibilization in liver and muscle in specific tissue manner. This confirms one glicemic homeostase regulation in distinct manner among control and malnutrition both supplemented animals. Furthermore they lead the metabolic signals produced by leucine should promote their effects in Langerhans islets throw sensor ways: GDH which controls glutaminolisis and on the otherhand is PI3K that should do its role activating growth pathways throw mTOR. These two sensors should work in synergism participating in citosolic concentration changes of ca1cium ions mainly in malnutrition animals' islets, which were supplemented. / Doutorado / Fisiologia / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Jose Roberto Bosqueiro / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-06T10:10:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Roma_LeticiaPrates_M.pdf: 861159 bytes, checksum: 232359e1de6e654ce6bb13758ca58bd2 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: As células B pancreáticas possuem controle multifatorial que permite a secreção de insulina em quantidade e tempo adequados. Os glicocorticóides modulam a secreção de insulina dependendo do tempo e dose em que forem utilzados. Assim,o presente trabalho teve por objetivo analisar as alterações na expressão gênica e protéica de ilhotas de ratos tratados com dexametasona (1mg/kg, 5dias). Utilizando a técnica de cDNA Macroarray observamos que dos 1176 genes presentes na membrana, 66 tiveram sua expressão aumentada e 38 genes tiveram sua expressão diminuída. Os genes com expressão aumentada pertencem às vias de estresse celular (JNK1), inibidores do ciclo celular (p21) e vias de apoptose (Baxa e Fas). Os genes com expressão diminuída pertencem ao ciclo celular (ciclinas D1 e D2, CDK4) e vias de sinalização PI3K, AKT1 e P70. Demonstramos também aumento na expressão protéica da Bax a, redução na expressão da proteína anti-apoptótica Bcl-2, PI3K e P70. Animais tratados com dexametasona por 5 dias possuem níveis plasmáticos aumentados de insulina, triglicérides e ácidos graxos livres. Ilhotas isoladas de animais tratados com dexametasona por 5 e 10 dias apresentaram maior secreção de insulina em relação aos controles, em concentrações basais e estimulatórias de glicose e 40mM de potássio. Porém, o tratamento por 10 dias com dexametasona induziu diminuição na secreção de insulina quando comparado aos animais tratados por 5 dias. Nossos dados sugerem o tratamento com dexametasona pode modular (direta ou indiretamente) a expressão de diversos genes e proteínas envolvidas na apoptose e sobrevivência de células na ilhota pancreática. Essa modulação pode, em longo prazo, se refletir na secreção de insulina como visto nos animais tratados por 10 dias / Abstract: Insulin secretion from pancreatic B-cells is regulated by nutrients like glucose and amino acids and by neurotransmitters, and hormones. Since glucocorticoids modulate insulin secretion we investigated the effects of dexamethasone on gene and protein expression in pancreatic islets from rats treated with the glucocorticoid for 5 days (mg/kg/day). Using cDNA array analysis we found that, out of 1176 genes presented in the array, 66 were up-regulated and 38 down-regulated after dexamethasone treatment. RT-PCR confirmed the macroarray results for 4 genes whereas the expression of these transcripts was confirmed by Western blotting for the corresponding proteins. Many of the up-regulated genes are implicated in apoptosis (Bax a, Fas), cell cycle regulation (p21) and stress response (JNK1) whereas many of the down-regulated were involved in cell cycle progression (cyclins D1 and D2, and CDK4), and survival and proliferations pathways (PI3K, AKT, P70). The protein expression of Bax a was increased whereas Bcl-2, PI3K and P70 repressed. The rats treated with dexamethasone for 5 days showed higher insulin, triglicerides and free fatty acids plasma levels than controls. The insulin secretion, in response to glucose and high concentrations of K+, in islets isolated from dexamethasone-treated rats for 5 and 10 days was higher than control rats. However, after 10 days of treatment with dexamethasone the insulin secretion was lower than after 5 days, but still higher than controls. In conclusion, these data indicate that dexamethasone-treatment (directly or indirectly) modulates the expression of several genes and proteins involved in apoptosis and survival of pancreatic islet-cells, and could, thereafter, modulates the insulin secretion in rats treated for 10 days / Mestrado / Fisiologia / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Antonio Carlos Boschero / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-13T00:36:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rezende_LuizFernandode_D.pdf: 9509933 bytes, checksum: fc8e235ac3d4242d8e48c28911285e25 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Introdução: O CNTF pertence à família da IL-6, e sendo assim, sinaliza pelo complexo receptor gp130, ativando diversas vias de sinalização dependendo do tipo celular, principalmente as vias STAT3, MAPK e PI3K. Seus efeitos incluem diferenciação e/ou sobrevivência neuronal, e é diferencialmente expresso ao longo da vida do animal. As ilhotas pancreáticas, por sua vez, são ricamente enervadas e expressam receptores para NGFs, podem apresentar respostas neurotípicas e expressam o CNTF. O objetivo desse estudo foi investigar os possíveis efeitos do CNTF sobre a diferenciação e/ou sobrevivência de ilhotas pancreáticas de ratos neonatos, qual(is) via(s) de sinalização ele ativa nessas ilhotas e como é expresso nelas ao longo da vida dos animais. Material e Métodos: Ilhotas pancreáticas de ratos neonatos (1-2 dias) foram isoladas pelo método de colagenase e cultivadas por 3 dias em meio RPMI com (CNTF) ou sem (CTL) 1nM de CNTF. Após isso, foram analisados a secreção de insulina estimulada por glicose (RIE), metabolismo (MTS, produção de NADPH), metabolismo de glicose (produção de 14CO2), expressão gênica (RTPCR), protéica (Western-Blot), atividade de caspase-3 (DEVD) e apoptose (fragmentação de DNA). Resultados: O CNTF reduziu a secreção de insulina estimulada por glicose e o metabolismo de ilhotas pancreáticas, não alterando o metabolismo de glicose e expressão de proteínas cruciais para a função das ilhotas. Por outro lado, o CNTF aumentou a expressão de proteínas relacionadas à sobrevivência das ilhotas pancreáticas, como Cx36, PAX4, e BCL-2, reduziu a atividade da caspase-3 e a apoptose das ilhotas. O CNTF também aumentou a fosforilação de STAT3, sua translocação ao núcleo e expressão de genes-alvo, como a SOCS-3, levando à redução da GSIS e sobrevivências observadas, apesar de não ativar as vias da MAPK e PI3K. Mais ainda, a expressão do CNTF é aumentada em ilhotas pancreáticas de ratos de 2 meses de idade, e assim permanecendo até os 20 meses de idade. Conclusão: O CNTF não promove a maturação de ilhotas pancreáticas, mas sim sua sobrevivência, e esses efeitos são mediados através da via JAK/STAT3, sem ativar as vias MAPK ou PI3K. Finalmente, o CNTF possui expressão diferenciada ao longo da vida do animal / Abstract: Introduction: CNTF belongs to the IL-6 cytokine family and as such, it signals through gp130 receptor complex, activating many pathways depending on the cell-type, mainly STAT3, MAPK and PI3K. Its effects include increased neuron differentiation and/or survival, and are differentially expressed throughout the animal life. Meanwhile, pancreatic islets are richly innervated and express receptors for NGFs, may undergo neurotypic responses, and express CNTF. The aim of this study was to investigate possible effects of CNTF on neonatal rat pancreatic islet differentiation and/or survival, which signalling pathway (s) it activates on pancreatic islets and how it is expressed in the pancreatic islets throughout the animal life. Methods: Pancreatic islets from neonatal rats (1-2 d old) were isolated by the collagenase method and cultured for 3 days in RPMI medium with (CNTF) or without (CTL) 1nM of CNTF. Thereafter, glucose-stimulated insulin secretion (RIA), general metabolism by (NAD(P)H production) (MTS), glucose metabolism (14CO2 production), gene (RT-PCR), protein expression (Western-Blot), caspase-3 activity (DEVD), and apoptosis (DNA fragmentation) were analysed. Results: CNTF reduced pancreatic islets GSIS and metabolism, whereas not affecting glucose metabolism and the expression of proteins crucial for the islets function. Conversely, CNTF significantly expression of proteins related pancreatic islets survival, such as Cx36, PAX4, and BCL-2, reduced caspase-3 activity and islet-cells apoptosis. CNTF also increases STAT3 fosforilation, translocation to the nuclei and expression of target genes, resulting in the reduced GSIS and survival observed, although not affecting MAPK and PI3K pathways. Moreover, CNTF expression is increased in rats pancreatic islets after 2 months of age, and it remains so until 20 months of age. Conclusion: CNTF has no effect over maturation of pancreatic islets function, whereas it improves pancreatic islets survival, and also that these effects are mediated through JAK/STAT3 but not through MAPK or PI3K pathways. Finally, CNTF is differentially expressed in rat pancreatic islets throughout the animal life / Doutorado / Fisiologia / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Everardo Magalhães Carneiro / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-13T09:09:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ribeiro_RosaneAparecida_D.pdf: 2339564 bytes, checksum: 146ea5a2123d76628db5f4758417e020 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Neste estudo, investigamos os efeitos da suplementação com taurina (TAU; 2% adicionada à água de beber) sobre a tolerância à glicose e a secreção de insulina frente a diferentes secretagogos em camundongos adultos. Camundongos suplementados apresentaram aumento da tolerância à glicose e da sensibilidade à insulina. Ilhotas isoladas destes animais secretaram mais insulina em resposta à glicose e L-leucina. A oxidação da L-leucina foi maior no grupo TAU, não havendo diferenças quanto ao consumo de glicose, concentrações de ATP e expressão do transportador da glicose (GLUT) 2 e da glicoquinase (GCK). A captação de Ca2+, na presença de glicose, e a expressão protéica da subunidade ß2 do canal de Ca2+ sensível à voltagem foi maior no grupo TAU comparado ao controle (CTL). Ainda, a expressão protéica da PL (fosfolipase) C ß 2 e da PK (proteína quinase) Aa, bem como a secreção de insulina em resposta a agentes potencializadores tais como carbacol (Cch) e IBMX, foi maior nas ilhotas TAU. A mobilização intracelular de Ca2+ induzida por Cch foi também maior em ilhotas deste grupo, e observamos que a inibição da PKA reduziu a captação de Ca2+ em resposta à glicose no grupo suplementado. Além disso, ilhotas TAU secretaram mais glucagon em relação a ilhotas CTL, quando em presença de baixa concentração de glicose. Concluindo, a suplementação com TAU melhora a homeostase glicêmica e aumenta a secreção de insulina de ilhotas isoladas e incubadas na presença de nutrientes e agentes potencializadores da secreção. Os efeitos sobre a secreção estão relacionados ao melhor manejo dos íons Ca2+ pelas células insulares provenientes dos animais suplementados com TAU. / Abstract: In this study, we investigated the effects of taurine (TAU)-supplementation (2% in the drinking water) on glucose tolerance and insulin secretion stimulated by different secretagogues in adult mice. TAU-supplemented mice showed enhanced glucose tolerance and insulin sensitivity when compared to controls (CTL). In addition, their islets secreted more insulin in response to high concentrations of glucose and L-leucine. L-[U-14C]leucine oxidation was higher in TAU islets compared with CTL islets, whereas D-[U-14C]glucose oxidation, ATP levels, and the protein expression of the glucose transporter (GLUT) 2 and of glucokinase (GCK) were similar. 45Ca uptake induced by high glucose concentrations was increased in TAU islets as well as the expression of the ß2 subunit of the L-type Ca2+ channel. In addition, the insulin secretion induced by carbachol (Cch) and IBMX, but not, by forskolin and PMA was higher in TAU-supplemented compared with CTL islets. The higher insulin secretion in the presence of Cch is accompanied by an increase in the expression of PL (phospholipase) C ß 2 protein and a higher intracellular Ca2+ mobilization. Besides, TAU-supplemented islets showed increased PK (protein kinase) Aa expression. Since the increase in Ca2+ uptake induced by glucose in TAU islets was minimized by the presence of the PKA inhibitor, H89, this kinase seems to be important for the better Ca2+ handling in these islets. TAUsupplementation also turns the a-cells more sensitivity since these cells secreted more glucagons compared with CTL islets. In conclusion, TAU supplementation enhances glucose tolerance and insulin sensitivity in mice and turns the islets more sensitive to nutrients and to potentiators of secretion. The effect on insulin secretion seems to be linked to a better Ca2+ handling by ß-cells. / Doutorado / Fisiologia / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Antonio Carlos Boschero / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-08T03:25:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cunha_DanielAndradeda_D.pdf: 2004407 bytes, checksum: 40e252218ab6f8007c9bfb5afde02a52 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Prolactina induz a maturação da resposta secretória das células B pancreáticas em ilhotas de ratos neonatos in vitro. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar se a maturação na resposta a glicose, induzida pela prolactina, está associada a alterações na expressão, associação e fosforilação de proteínas envolvidas na mobilização e extrusão dos grânulos de insulina. Para isso, ilhotas pancreáticas de ratos neonatos foram cultivadas por cinco dias em presença de prolactina e após extração do RNA e proteína total foram realizados RT-PCR e western blot. Observamos aumento na expressão gênica e protéica da MAP-2 e cinesina em ilhotas cultivadas com prolactina. Analisamos também a associação e fosforilação através de imunoprecipitação seguido de western blot de proteínas SNARE e MAP-2/cinesina em ilhotas estimuladas agudamente (20 min) com prolactina. Prolactina aumentou a associação entre proteínas SNARE e MAP-2/cinesina e reduziu a ligação entre sintaxina IA/munc-I8. Fosforilação em resíduos serina das proteínas SNAP-25, sintaxina IA, munc-I8 e MAP-2 encontravam-se aumentadas enquanto que da cinesina foi diminuída, em ilhotas estimuladas com prolactina. Ainda, foi observado aumento na formação do complexo SNARE em ilhotas agudamente estimuladas com prolactina, 22 mM de glicose, 40 de mM K+, 200 J.lMde carbacol e I J.lMde PMA (ativador da PKC). A inibição da via da MAP cinase, por PD098059, bloqueou a formação do complexo SNARE e fosforilação da sintaxina induzida por prolactina. Desta forma, podemos concluir que prolactina auxilia na maturação das células B por aumentar a expressão, fosforilação e associação de proteínas que compõem a maquinaria de extrusão dos grânulos de insulina, provavelmente via MAP cinase/PKC / Abstract: Prolactin induces maturation of insulin secretion in cultured neonatal rat islets. In this study, we investigated whether the improved secretory response to glucose caused by prolactin involves alteration in the expression, association and phosphorylation of several proteins that participate in these processes. Messenger RNA was extracted from neonatal rat islets cultured for five days in the presence of prolactin and reverse transcribed. Gene expression was analyzed by semi-quantitative RT-PCR and by western blotting for proteins. The gene transcription and protein expression of kinesin and MAP-2 were increased in prolactin-treated islets compared to the controls. The association and phosphorylation of proteins was analyzed by immunoprecipitation followed by western blotting, after acute exposure to prolactin. Prolactin increased the association between SNARE proteins and kinesin/MAP-2 while the association of munc-I8/syntaxin IA was decreased. Serine phosphorylation of SNAP-25, syntaxin IA, munc-18, MAP-2 was significantly higher whereas kinesin phosphorylation was decreased in prolactintreated islets. There was an increase in SNARE complex formation in islets stimulated with prolactin, 22 mM glucose, 40 mM K+, 200 f.lMcarbachol and 1 f.lMPMA (pKC activator). The prolactin-induced increase in the formation of SNARE complex and syntaxin IA phosphorylation was inhibited by PD098059, a blocker of the MAPK pathway. These findings indicate that prolactin primes pancreatic B-cells to release insulin by increasing the expression and phosphorylation/association of proteins implicated in the secretory machinery, probably via the MAPKlPKC pathway / Doutorado / Fisiologia / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Antonio Carlos Boschiero / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-09T03:49:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_KellyElizeuda_M.pdf: 1866524 bytes, checksum: 87ae185f2da61d551d322f4375943e54 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: O INGAP-PP é um pentadecapeptídeo constituído pela seqüência de aminoácidos do resíduo 104 ao 118 do INGAP (Islet Neogenesis Associated Protein), o qual é expresso no pâncreas exócrino e também nas células ductais durante a neogênese de células ßpancreáticas. Nesse trabalho, analisamos o efeito do tratamento crônico (4 dias) com INGAP-PP sobre a secreção de insulina, expressão gênica e protéica das subunidades Kir6.2 e SUR1 que formam o canal de K+ATP e do fator de transcrição Foxa2 (regulador da expressão das subunidades desse canal), em ilhotas isoladas de ratos adultos. As ilhotas tratadas com INGAP-PP (10 µg/mL) secretaram significativamente mais insulina quando incubadas por 1 h em concentrações entre 2.8 e 22.2 mM de glicose em comparação às ilhotas controles. Resultados de RT-PCR mostram que ilhotas tratadas com INGAP-PP tiveram expressão gênica do Foxa2 e das subunidades SUR1 e Kir6.2 aumentada. A expressão das proteínas SUR1 e Foxa2, analisada por Western Blotting, também foi maior nas ilhotas tratadas com INGAP-PP. Quando perfundidas na presença de 22,2 mM de glicose o aumento da secreção de insulina pelas ilhotas tratadas se manifestou com um primeiro pico secretor significativamente maior do que as ilhotas controles. Em presença de 2,8 mM de glicose, ilhotas tratadas com INGAP-PP secretaram mais insulina frente à concentrações despolarizantes de KCl ou tolbutamida (100 µM). Entretanto, a secreção de insulina estimulada por tolbutamida não diferiu entre os grupos em presença de 22,2 mM de glicose. A análise do efluxo de 86Rb mostrou que as ilhotas cultivadas com INGAP-PP apresentam menor efluxo do isótopo em relação às controle. Portanto, a maior secreção de insulina frente à glicose e concentrações despolarizantes de K+ indica que o tratamento com INGAP-PP induziu alterações que tornaram as células ßmais sensíveis a agentes despolarizantes. Quando associamos estes resultados ao aumento da expressão das proteínas formadoras do canal K+ATP e à redução do efluxo de 86Rb pelas ilhotas tratadas com INGAP-PP, podemos sugerir que o aumento no número de canais KATP pode ser um dos responsáveis pelo aumento na secreção de insulina nas ilhotas tratadas com o peptídeo / Abstract: Cultured adult rat islets were used to study the effect of INGAP-PP upon: a) gene expression of Kir6.2 and SUR1 of K+ATP channels and of their transcription factor Foxa2 (RT-PCR), b) protein levels (Western blotting) of SUR1 and Foxa2, c) static and dynamic insulin secretion elicited by metabolic and non metabolic stimuli and d) 86Rb efflux from perifused islets. INGAP-PP increased significantly the expression of Kir6.2, SUR1 and Foxa2 and the protein levels of SUR1 and Foxa2. Islets cultured with INGAPPP and further incubated for 1 h with 2.8 mM glucose, significantly enhanced the release of insulin in response to 40 mM KCl, and 100 µM tolbutamide. The dose-response curve of insulin secretion to increasing glucose concentrations (2.8 to 22.2 mM) shifted to the left in INGAP-PP-cultured islets with an EC50 of 10.0 ± 0.4 vs. 13.7 ± 1.5 mM glucose of the controls (P < 0,05). In dynamic studies INGAP-PP increased significantly the first-phase of insulin secretion elicited by either 22.2 mM glucose or 100 µM tolbutamide and promotes a higher glucose-induced reduction of 86Rb efflux from perifused islets. These results confirm the enhancing effect of INGAP-PP upon insulin release induced by different secretagogues and provide new evidence that such effect is due, at least partly, to an enhanced expression of the SUR1 and Kir6.2 genes of K+ATP channels and of the Foxa2 gene that controls their expression. They would also suggest that INGAP-PP could potentially be used to maintain the capacity of cultured islets to release insulin in response to glucose and maybe for the treatment of diabetes / Mestrado / Fisiologia / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Antonio Carlos Boschero / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-11T18:52:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Barbosa_HelenaCristinadeLima_D.pdf: 1532159 bytes, checksum: fe4c9ebe74242b72b674f100ed50b427 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Islet Neogenesis Associated Protein (INGAP) aumenta a massa das células ß e potencializa a secreção de insulina induzida por glicose. Neste projeto, estudamos os efeitos de um pentadecapeptídeo contendo a seqüência 104 a 118 de aminoácidos do INGAP (INGAP-PP) sobre a expressão de genes das células insulares, expressão e fosforilação de componentes das vias PI3K e MAPK, sinalização colinérgica, bem como secreções dinâmica e estática de insulina, em ilhotas isoladas de ratos neonatos. Ilhotas cultivadas com INGAP-PP por 4 dias secretaram significativamente mais insulina em resposta a glicose, comparado às ilhotas controle. Análise do padrão da expressão, por macroarray, de ilhotas cultivadas com INGAP-PP, mostrou que de 2.352 genes fixados na membrana de nylon 210 apresentaram expressão aumentada e apenas 4 diminuída. Dentre os genes modulados positivamente pelo INGAP-PP vários estão relacionados com o metabolismo das células insulares, mecanismo de secreção de insulina, crescimento, maturação, manutenção da massa celular e exocitose. Exposição aguda de ilhotas neonatais ao INGAP-PP aumentou significativamente a fosforilação de Akt-Ser473 e ERK1/2-Thr202/Tyr204 bem como a secreção dinâmica de insulina frente a 2 e 20 mM de glicose. Ilhotas tratadas durante 4 dias com INGAP-PP também apresentaram aumento da expressão do receptor muscarínico M3 e da PLC-ß2. Essas ilhotas, quando expostas agudamente ao Cch tiveram fosforilação de P70S6K-Thr389 e ERK1/2 aumentada. Ainda, essas ilhotas secretaram mais insulina frente a estímulo colinérgico, comparado às ilhotas controle. Nossos resultados mostram que o INGAP-PP aumenta a secreção de insulina, a transcrição de vários genes importantes para a funcionalidade do pâncreas endócrino e a fosforilação de proteínas envolvidas nas vias PI3K e MAPK. O aumento da secreção de insulina bem como fosforilação de P70S6K e ERK1/2 pelo Cch sugere participação também da via colinérgica nos efeitos mediados pelo INGAP-PP. / Abstract: The Islet Neogenesis Associated Protein (INGAP) increases pancreatic ß-cell mass and potentiates glucose-induced insulin secretion. Here, we have studied the effects of the pentadecapeptide having the 104-118 amino acid sequence of INGAP (INGAP-PP) on the expression of genes related to the pancreatic islets, the expression and phosphorylation of components of the PI3K and MAPK pathways, the cholinergic signaling, and static and dynamic insulin secretion in neonatal rat islet. Islets cultured with INGAP-PP released significantly more insulin in response to glucose than controls. The macroarray analysis showed that 210 out of 2,352 genes, spotted in the nylon membranes, were up- ,regulated while only 4 were down-regulated by INGAP-PP-treatment. The main categories of genes modulated by INGAP-PP 4-days cultured islet include several genes related with islet metabolism, insulin secretion mechanism, growth, maturation, maintenance of islet-cell mass, and exocytosis. Shortterm exposure of neonatal islets to INGAP-PP significantly increased Akt-Ser473 and ERK1/2-Thr202/Tyr204 phosphorylation as well as insulin secretion from islets perifused with 2 and 20 mM glucose. Four-days cultured islets with INGAP-PP also showed increased expression of M3 receptor subtype and PLC-ß2 proteins. In addition, brief exposure of INGAP-PP-treated islets to Cch significantly increased P70S6KThr389 and ERK1/2 phosphorylation and these islets released more insulin when challenged with Cch. In conclusion, these data show that INGAP-PP enhances insulin secretion and transcription of several islet genes, and also increases the expression and phosphorylation of proteins involved in PI3K and MAPK pathways. The increased insulin secretion in response to Cch as well as P70S6K and ERK1/2 proteins phosphorylation, also suggest the participation of the cholinergic pathway in INGAP-PP mediated effects. / Doutorado / Fisiologia / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Introdução: O câncer da confluência biliopancreática tem alta letalidade e prognóstico reservado, atribuído à associação da agressividade biológica e ao quadro clínico silencioso. A inflamação tem papel fundamental no desenvolvimento e na progressão da caquexia, induzida pela expressão de citocinas produzidas pelo tumor e/ou liberadas pelo sistema imunológico. Nos últimos anos, tem sido documentada a variabilidade na expressão gênica de citocinas que regulam os mecanismos envolvidos na caquexia neoplásica. Objetivos: Em amostras de sangue periférico de pacientes com neoplasia da confluência biliopancreática, avaliar a concentração da interleucina 6 (IL-6), fator de necrose tumoral alfa (TNF-?), interferon-gama (INF- ?) e interleucina 10 (IL-10), além da expressão gênica dessas citocinas, do receptor tipo 1 do fator de necrose tumoral (TNFR1), do receptor tipo 2 do fator de necrose tumoral (TNFR2), da zinco-alfa2-glicoproteina (ZAG) e do receptor ativado por proliferador de peroxissoma gama (PPAR-?). Além disso, o estudo visou identificar possíveis diferenças nos dados avaliados entre os pacientes classificados de acordo com a presença ou não de caquexia neoplásica. Casuística: O estudo transversal foi conduzido com 17 pacientes adultos de ambos os gêneros em pré-operatório imediato de neoplasia da confluência biliopancreática (Grupo Câncer), além de 15 indivíduos controles em pré-operatório de herniorrafia (Grupo Controle). Os pacientes com neoplasia foram classificados de acordo com a presença de caquexia (Subgrupo Caquexia, n=8) e aqueles sem diagnóstico de caquexia (Subgrupo Semcaquexia, n=9). Métodos: A ingestão alimentar e a composição corporal foram avaliadas em todos os voluntários. O questionário de fadiga foi aplicado nos indivíduos com neoplasia. O diagnóstico de caquexia foi feito a partir de critérios pré-estabelecidos. As citocinas inflamatórias IL-6, TNF-?, INF-? e IL-10 foram dosadas no sangue periférico. A expressão gênica dessas citocinas inflamatórias, dos receptores de TNF-?, da ZAG e do PPAR-? foi feita em sangue total. A análise estatística foi realizada com o auxílio de software Statistica, versão 8.0®. Resultados: Não houve diferença na ingestão energética [1827 (1489-2166) vs 1691 (1380-2003) kcal, p=0,56] e proteica [91,6 (74-109) vs 101 (89-114) g, p=0,30] dos indivíduos com câncer ou controles, exceto pela maior ingestão de lipídeos [69,0 (53,5-84,5) vs 42,7 (33,4-52,1) g, p=0,01] e menor consumo de vitamina A [382 (152-612) vs 1346 (1032-1659) ?g, p=0,001] no Grupo Câncer em relação ao Grupo Controle, respectivamente. Houve perda de peso em relação ao habitual em 15 dos 17 pacientes (13,1 ? 11,0%) antes do procedimento cirúrgico, embora as variáveis de composição corporal estivessem semelhantes entre os dois grupos de estudo. Os pacientes com neoplasia apresentavam menores concentrações plasmáticas de albumina [3,8 (3,5-4,0) vs 4,4 (4,3-4,5) g/dL, p<0,001], transferrina [166 (140-192) vs 241 (212-270) mg, p=0,001], ferro [80,8 (67,7-93,9) vs 107 (82-131) ?g/dL, p=0,003], zinco [79,9 (66-93,7) vs 97,4 (88-107) ?g%, p=0,001] e vitamina A [0,7 (0,6-0,8) vs 1,3 (1,0-1,5) umol/L, p<0,001], além de maiores níveis de glicemia [115 (118-193) vs 98,6 (82-115) mg/dL, p=0,003], proteína C reativa [2,7 (0,9-4,5) vs 0,2 (0,2-3,3) mg/dL, p<0,001], ferritina [985 (347-1623) vs 170 (85-255) ng/dL, p=0,003] e cobre [147 (122-177) vs 107 (92-121) ?g%, p=0,03] em relação aos controles, respectivamente. A concentração sérica das citocinas IL-6 [7,2 (4,2-10,1) vs 2,0 (1,4-2,5) pg/mL, p<0,001], TNF- ? [24,6 (18,7-30,5) vs 15,2 (11,3-19,1) pg/mL, p=0,02] e IL-10 [13,3 (8,5-18,2) vs 4,4 (2,8- 6,1) pg/mL, p<0,001] foram maiores no Grupo Câncer. O RNAm do INF-? (p=0,008), 8 TNFR1 (p=0,003), IL-10 (p=0,002) e PPAR-? (p=0,002) foram mais expressos nos pacientes com neoplasia. O Subgrupo Caquexia apresentou menor ingestão energética (p=0,03) e proteica (p=0,04), maior intensidade de fadiga (p=0,003), maior perda de peso (p=0,02) e menores níveis séricos de zinco (p=0,05). Dentre as citocinas, apenas a concentração de IL-6 (p=0,04) foi maior no Subgrupo Caquexia, enquanto que a expressão gênica do INF-? (p=0,04) foi maior nos pacientes com caquexia. Conclusões: Apesar da perda de peso, os marcadores de ingestão alimentar e composição corporal foram pouco alterados nos pacientes com neoplasia da confluência biliopancreática. As alterações laboratoriais foram evidentes nos pacientes com neoplasia, mostrando uma resposta inflamatória sistêmica. O aumento da expressão gênica da IL-10 sugere que as células do sangue periférico estão envolvidas no aumento sérico desta citocina. Apesar do aumento da concentração sérica do IL-6 e TNF-? nos pacientes com neoplasia, não houve aumento da expressão gênica dessas citocinas em sangue periférico. Tais dados sugerem que a IL-6 e o TNF-? são produzidos por outras células do sistema imune, distintas dos macrófagos circulantes. O aumento da expressão gênica de INF-? no sangue periféricos dos pacientes com neoplasia não foi acompanhado por maior concentração sérica dessa citocina, por possíveis mecanismos epigenéticos. Os genes do PPAR-? e do TNFR1 foram mais expressos nos pacientes com neoplasia. A caquexia foi definida em 8 pacientes, que apresentaram maior perda ponderal e menor ingestão nutricional. A concentração sérica de IL-6 foi maior no Subgrupo Caquexia, indicando a relação entre essa citocina e o estado caquético. Embora a concentração sérica de INF-? fosse semelhante entre sujeitos com ou sem caquexia, a expressão gênica dessa citocina foi maior nos pacientes caquéticos. / Introduction: Biliopancreatic confluence cancer has a high lethality and a reserved prognosis, attributed to the association of biological aggressiveness and the silent clinical picture. Inflammation plays a key role in the development and progression of cachexia, induced by the expression of cytokines produced by the tumor and/or released by the immune system. In recent years, it has been documented the variability in the genetics of cytokines regulating the mechanisms involved in neoplastic cachexia. Objectives: To evaluate the concentration of interleukin-6 (IL-6), tumor necrosis factor alpha (TNF-?), interferon-gamma (IFF-?) and interleukin 10 (IL-10) in samples of peripheral blood from patients with biliopancreatic confluence neoplasia, in addition to the gene expression of these cytokines, tumor necrosis factor receptor 1 (TNFR1), type 2 receptor tumor necrosis factor (TNFR2), zinc receptor alpha2-glycoprotein (ZAG) and peroxisome proliferator-activated gamma (PEAR-?). Besides, this study aimed to identify possible differences in the data among patients who were classified according to the presence or absence of neoplastic cachexia. Casuistic: The cross-sectional study was carried out with 17 patients of both genders in the immediate preoperative period of neoplasia of the biliopancreatic confluence (Cancer Group), in addition to 15 individual control in the preoperative period of hernia removal surgery (Control Group). Patients with neoplasia were classified according to the presence of cachexia (Subgroup Cachexia, n=8) and those without it (Subgroup Without-cachexia, n=9). Methods: Food intake and body composition were evaluated in all volunteers. The fatigue questionnaire was applied in individuals with neoplasia. The diagnosis of cachexia was based on pre-established criteria. Inflammatory cytokines IL-6, TNF-?, INF-? and IL-10 were measured in peripheral blood. The gene expression of inflammatory cytokines, TNF-?\' receptors, ZAG and PPAR were made in whole blood. Statistical analysis was performed using Statistica software, version 8.0®. Results: There was no difference in energy intake [1827 (1489-2166) vs 1691 (1380-2003) kcal, p=0.56] and protein [91.6 (74-109) vs 101 (89-114) g, p=0.30] of individuals with cancer or controls, except for the higher lipid intake [69.0 (53.5-84.5) vs 42.7 (33.4-52.1) g, p=0,01] and lower intake of vitamin A [382 (152-612) vs 1346 (1032-1659) ,µg, p=0.001] in the Cancer Group related to Control Group, respectively. There was weight loss from the usual in 15 of the 17 patients (13.1 + 11.0%) prior to the surgical procedure, although body composition variables were similar between the two study groups. Patients with neoplasia had lower plasma albumin concentrations [3.8 (3.5-4.0) vs 4.4 (4.3-4.5) g/dL, p <0.001], transferrin [166 (140-192) vs 241 (212-270) mg/dL, p=0,001], iron [80.8 (67.793.9) vs 107 (82-131) ,µg/dL, p=0.003], zinc [79.9 (66-93.7) vs 97.4 (88-107) µg%, p=0.001] and vitamin A [0.7 (0.6-0.8) vs 1.3 (1, 0-1.5) umol/L, p <0.001], as well as higher glycemia levels [115 (118-193) vs 98.6 (82-115) mg/dL, p=0.003], C-reactive protein 2.7 (0.9-4.5) vs 0.2 (0.2-3.3) mg/dL, p <0.001], ferritin [985 (347-1623) vs 170 (85-255) ng/dL, p=0.003] and copper ~147 (122-177) vs 107 (92-121) µg%, p=0.03] relative to the controls, respectively. The serum concentration of IL-6 cytokines [7.2 (4.2-10.1) vs. 2.0 (1.4-2.5) pg/mL, p <0.001], TNF-? [24.6 (18.7-30.5) vs 15.2 (11.3-19.1) pg/mL, p=0.02] and IL-10 [13.3 (8.5-18.2) vs 4.4 (2.8-6.1) pg/mL, p=0.008) were higher in the Cancer Group. The mRNA of INF-? (p=0.008), TNFR1 (p=0.003), IL-10 (p=0.002) and PPAR-? (p=0.002) were more expressed in patients with neoplasia. The Caquexy Subgroup had lower energetic (p=0.03) and protein intake (p=0.04), higher fatigue intensity (p=0.003), greater weight loss (p=0.02) and lower serum levels of zinc (p=0.05). Among the cytokines, only a concentration of IL-6 (p=0.04) was higher than the Cachexia Subgroup, whereas the gene expression of INF-? (p=0.04) was higher in patients with cachexia. Conclusions: Despite the weight loss, dietary intake markers and body composition were slightly altered in patients with biliopancreatic confluence neoplasia. In patients with neoplasia, laboratory findings were evident showing a systemic inflammatory response. The increasing gene expression of IL-10 suggests that peripheral blood cells are involved in the serum increase of this cytokine. Despite the increased concentration of IL-6 and TNF-? in neoplasia patients, there was no increase in gene expression in peripheral blood cytokines. These data suggest that IL-6 and TNF-? are produced by other cells of the immune system, other than circulating macrophages. The increasing gene expression of INF-? in the peripheral blood of patients with neoplasia was not accompanied by a higher serum concentration of this cytokine, due to possible epigenetic mechanisms. The PPAR-? and TNFR1 genes were more expressed in patients with neoplasia. Cachexia was defined in 8 patients, who presented greater weight loss and lower nutritional intake. The serum concentration of IL-6 was higher in the Cachexia Subgroup, indicating the relation between this cytokine and the cachectic state. Although the serum INF-? concentration was similar between individuals with or without cachexia, the gene expression of this cytokine was higher in cachectic patients