Orientador: Fábio Rogério / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-16T07:22:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Assis_CarlosViniciusAlmeidade_M.pdf: 1210366 bytes, checksum: f2d46d6b8c16b1647290224d152e20d8 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: A busca por estratégias para o tratamento de doenças neurodegenerativas e neurotraumas tem sido realizada mediante o emprego de moléculas que possam atuar impedindo a morte de células nervosas e/ou estimulando a regeneração axonal e dendrítica. Dentre elas se encontram os fatores neurotróficos e, em especial, o fator neurotrófico ciliar (CNTF), membro da família das neurocinas que promove a sobrevivência de uma variedade de populações de neurônios, além de desempenhar papel importante na resposta do tecido nervoso à lesão. Seu mecanismo de ação se dá através da via Janus Quinase/Proteína Transdutora de Sinal e Ativadora de Transcrição (JAK/STAT), conhecidamente envolvida na expressão de diversos genes implicados na neuroproteção através da fosforilação da STAT3. Outra via de sinalização intracelular também relacionada com mecanismos de neuroproteção e regeneração axonal é aquela dependente da concentração citoplasmática do monofosfato de adenosina cíclico (cAMP), cuja concentração intracelular também pode ser modificada farmacologicamente através da interferência nos seus processos de síntese e degradação. O cAMP está envolvido em diversos eventos fisiológicos envolvendo o sistema nervoso e sua proteção. Seu principal alvo é a Proteína Quinase A, a qual exerce funções, dentre elas, a de estimular vias de sinalização intracelulares comprometidas com a sobrevivência neuronal e regeneração axonal. A estratégia aplicada no presente estudo consistiu na inibição da degradação de cAMP através de um inibidor de fosfodiesterase tipo IV, Rolipram. Diversas evidências sugerem que existam importantes interações entre a atividade do cAMP e a ação de neurocinas que potencializam os efeitos protetores destas últimas. Tendo isso em vista, investigamos os efeitos da associação do Rolipram e CNTF na proteção de neurônios da medula espinal de ratos neonatos após secção do nervo isquiático. Foi estudado um lote de ratos para investigação a curto prazo (tratamento e sacrifício no mesmo dia) para a investigação das vias de sinalização envolvidas e outro a longo prazo (tratamento por cinco dias) para a investigação morfológica com os grupos CNTF (0,3ug/g), Rolipram (2,0ug/g), CNTF + Rolipram (C+R) (0,3ug/g e 2,0ug/g, respectivamente), PBS e DMSO. Os dois últimos foram agrupados em um grupo denominado CONTROLE para análise proteica. As conseqüências no crescimento dos animais (evolução ponderal) foram mais proeminentes, visto que o grupo C+R cresceu menos que os outros grupos, denotando um efeito deletério já a partir do segundo dia de intervenção (P3) no desenvolvimento dos animais. Os tratamentos rápidos desencadearam um padrão diversificado de resultados. O tratamento com CNTF aumentou a fosforilação de STAT3 (pSTAT3) e a STAT3 total. A proteína pró-apoptótica BAD fosforilada aumentou com C+R, porém sua forma total não sofreu alterações. Já o fator de transcrição proteína ligadora ao elemento responsivo ao cAMP (CREB) e sua forma fosforilada, pCREB, não apresentaram alterações após os diferentes tratamentos. Após o tratamento prolongado não houve diferença entre os grupos no índice de Sobrevivência Neuronal. Não observamos efeito aditivo com tratamento simultâneo de CNTF e Rolipram nas vias relacionadas com a sobrevivência neuronal no presente modelo de lesão nervosa periférica / Abstract: The search for strategies for the treatment of neurodegenerative diseases and neurotraumas has been performed through the use of molecules that may act as neuroprotective agents and avoid the death of neural cells and/or stimulate axonal and dendritic regeneration. Among these strategies, the neurotrophic factors, specially the ciliary neurotrophic factor (CNTF), member of the neurocytokines, have gained interest due to the fact of being capable of promoting the survival of a variety of neurons besides playing an important role in response to nervous injury. The mechanism of action is through Janus Kinase/ Signal Transducer and Activator of Transcription (JAK/STAT), known to be involved in the expression of a variety of genes implicated in neuroprotection by phosphorylation of STAT3. Another intracellular signaling via also related with neuroprotection and axonal regeneration mechanisms is the one dependent on the cytoplasmic concentration of cyclic adenosine monophosphate (cAMP), whose intracellular concentration may also be modified pharmacologically through the interference in the processes of its synthesis and degradation. cAMP has been reported to be involved in several physiological events involving the nervous system and its protection. Its main target is Protein Kinase A (PKA), which exerts functions such as neuronal survival and axonal regeneration. The strategy applied on this work consisted on the inhibition of the breakdown of cAMP through an inhibitor of phosphodiesterase type IV, Rolipram. It has been described important relationship between the activity of cAMP and action of neurocytokines that potentiate the neuroprotective effects of the latter. In the present work we investigated the effects of the association of Rolipram and CNTF on the protection of spinal motoneurons of neonatal rats after transection of sciatic nerve. A set of rats was used to investigate short period treatment (treatment and sacrifice in the same day) in order to analyse intracelullar signaling vias involved and other set to investigate a prolonged treatment (treatment for five days) to make a morphological analysis of the groups CNTF (0,3ug/g), Rolipram (2,0ug/g), CNTF + Rolipram (C+R) (0,3ug/g e 2,0ug/g, respectively), PBS and DMSO. For proteic analysis, the two latter were grouped in one group called CONTROL. C+R group showed failure to thrive, meaning that a deleterious effect occurred as of the second day of intervention (P3). Short period treatments showed different results. Treatment with induced both phosphorylation and total amount of STAT3. The pro-apoptotic protein BAD raised its levels in response to C+R, but the total levels were not affected. On the other hand, cAMP Responsive Element Binding Protein (CREB) and its phosphorilated form, pCREB, showed no alteration after the treatments. In the prolonged investigation there was no difference between the treatments in the Neuronal Survival Index. There was no additive effect after simultaneous treatment with CNTF and Rolipram in neuronal survival in the present model of peripheral nervous injury / Mestrado / Fisiologia / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Francesco Langone / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-14T15:12:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Facchini_Gustavo_M.pdf: 1152252 bytes, checksum: 2aeaf5af11625ea4d656804e4b4ab4b3 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A melatonina (MLT) é um neurohormônio presente em humanos e outros vertebrados, sendo a glândula pineal principal fonte produtora. Além de sua conhecida ação cronobiológica, a MLT tem papel regulador sobre o metabolismo energético e sobre a massa corporal de mamíferos. A presença de receptores para MLT nos núcleos hipotalâmicos dorso-medial, supraquiasmático, paraventricular do hipotálamo desde a fase embrionária, corrobora a mediação da MLT no controle neural do metabolismo. Dentro deste contexto o presente trabalho avaliou os efeitos da administração de MLT sobre a evolução ponderal e os níveis plasmáticos de glicose, triglicérides, colesterol, ácido graxo livre e insulina. Também foram investigados os efeitos da MLT sobre a fosforilação da AKT e ERK1/2 no hipotálamo de ratos neonatos. Neste estudo foram utilizados ratos neonatos com dois dias de vida (P2) que receberam doses diárias de MLT (1, 10, 50 e 100 mg/kg, s.c.; n=10) e/ou luzindole, antagonista não seletivo da MLT (1 mg/kg, s.c.; n=10). Os animais foram tratados por seis dias e sacrificados 24 horas após a última dose (P8). Três grupos adicionais foram utilizados, dois deles receberam apenas os veículos de diluição da melatonia (n=10) ou luzindole (n=10). O terceiro foi formado por animais não tratados (n=10). Imediatamente após o sacrifício foi coletado sangue para as dosagens plasmáticas, sendo realizada também a dissecação do hipotálamo. Os hipotálamos foram processados para análise por Western Blot (WB) das formas fosforiladas e não fosforiladas das proteínas AKT e ERK1/2. A evolução ponderal dos animais tratados com veículo de diluição foi semelhante ao dos animais sem tratamento. Contrariamente, todos os grupos tratados com MLT e com MLT+LZD apresentaram redução da evolução ponderal ao longo do tempo. A análise da fosforilação de proteínas no hipotálamo mostrou que todos os grupos tratados com MLT exibiram aumento da fosforilação da AKT. Por sua vez, a administração conjunta de MLT e LZD fez com que o valor de pAKT se assemelhasse os grupos controles. Os animais que receberam 10 mg/kg de MLT apresentaram aumento significativo da pERK1/2 quando comparado aos grupos controles. Entretanto, a administração de MLT+LZD tornou os valores de pERK1/2 similares aos valores dos animais controles. As dosagens plasmáticas mostraram que a MLT não alterou valores de colesterol, mas modificou as concentrações de glicose, triglicérides, ácido graxo livre e insulina. Por outro lado, os grupos tratados com o veículo de diluição do LZD apresentaram aumento dos valores de colesterol e diminuição de triglicérides e ácido graxo livre. Nossos dados mostram pela primeira vez que doses farmacológicas de melatonina produzem alterações metabólicas em ratos neonatos e que tais efeitos podem ser conseqüência de sua ação periférica e central. / Abstract: Melatonin (MLT) is a neurohormone present in human and other vertebrates, the pineal gland being its main source. In addition to its known chronobiological action, MLT has a regulatory role on energy metabolism and body mass of mammals. The presence of receptors for MLT in dorsomedial, supraquiasmaic and paraventricular hypothalamic nuclei since embryonic stage, speaks in favor of MLT as a mediator of neural control of metabolism. In this study we used newborn rats with two days of life (P2) who received daily doses of MLT (1, 10, 50 and 100 mg/kg, sc, n = 10) and / or luzindol (LZD; non-selective antagonist of MLT, 1 mg/kg, sc, n = 10). Animals were treated for six days and sacrificed 24 hours after the last dose (P8). Two additional groups received only the vehicle of dilution of melatonin (n = 10) or luzindol (n = 10). Another group was composed of animals not treated pharmacologically (n = 10). Body weight was recorded daily. At the end of treatment rats were killed by decapitation and blood was collected for plasma glucose (GLI), total cholesterol (COL), free triglycerides (TG), free fatty acid (FFA) and insulin (INS) determination. The hypothalamus was also dissected and processed for analysis by Western Blot (WB) of phosphorylated AKT and ERK1/2. The body weight of animals treated with vehicle was similar to that of untreated animals. Conversely, all groups treated with MLT and MLT + LZD showed reduced body weight over time. Analysis of protein phosphorylation in the hypothalamus showed that all groups treated with MLT had increased AKT phosphorylation. Rats that received MLT and LZD had pAKT levels similar to control rats. Animals that received 10 mg / kg of MLT showed significant increase in pERK1/2 compared to control groups. However, rats that received MLT + LZD had pERK1/2 levels similar to control rats. MLT did not alter plasmatic COL, but modified the GLI, TG, AGL and INS plasmatic levels. Moreover, groups treated with vehicle for dilution of LZD showed increase in COL and decrease of TG and FFA. Our data show for the first time that pharmacological doses of melatonin produces metabolic changes in newborn rats and that this effect may be a consequence of its peripheral and central actions. / Mestrado / Fisiologia / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Antonio Carlos Boschero / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-11T18:52:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Barbosa_HelenaCristinadeLima_D.pdf: 1532159 bytes, checksum: fe4c9ebe74242b72b674f100ed50b427 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Islet Neogenesis Associated Protein (INGAP) aumenta a massa das células ß e potencializa a secreção de insulina induzida por glicose. Neste projeto, estudamos os efeitos de um pentadecapeptídeo contendo a seqüência 104 a 118 de aminoácidos do INGAP (INGAP-PP) sobre a expressão de genes das células insulares, expressão e fosforilação de componentes das vias PI3K e MAPK, sinalização colinérgica, bem como secreções dinâmica e estática de insulina, em ilhotas isoladas de ratos neonatos. Ilhotas cultivadas com INGAP-PP por 4 dias secretaram significativamente mais insulina em resposta a glicose, comparado às ilhotas controle. Análise do padrão da expressão, por macroarray, de ilhotas cultivadas com INGAP-PP, mostrou que de 2.352 genes fixados na membrana de nylon 210 apresentaram expressão aumentada e apenas 4 diminuída. Dentre os genes modulados positivamente pelo INGAP-PP vários estão relacionados com o metabolismo das células insulares, mecanismo de secreção de insulina, crescimento, maturação, manutenção da massa celular e exocitose. Exposição aguda de ilhotas neonatais ao INGAP-PP aumentou significativamente a fosforilação de Akt-Ser473 e ERK1/2-Thr202/Tyr204 bem como a secreção dinâmica de insulina frente a 2 e 20 mM de glicose. Ilhotas tratadas durante 4 dias com INGAP-PP também apresentaram aumento da expressão do receptor muscarínico M3 e da PLC-ß2. Essas ilhotas, quando expostas agudamente ao Cch tiveram fosforilação de P70S6K-Thr389 e ERK1/2 aumentada. Ainda, essas ilhotas secretaram mais insulina frente a estímulo colinérgico, comparado às ilhotas controle. Nossos resultados mostram que o INGAP-PP aumenta a secreção de insulina, a transcrição de vários genes importantes para a funcionalidade do pâncreas endócrino e a fosforilação de proteínas envolvidas nas vias PI3K e MAPK. O aumento da secreção de insulina bem como fosforilação de P70S6K e ERK1/2 pelo Cch sugere participação também da via colinérgica nos efeitos mediados pelo INGAP-PP. / Abstract: The Islet Neogenesis Associated Protein (INGAP) increases pancreatic ß-cell mass and potentiates glucose-induced insulin secretion. Here, we have studied the effects of the pentadecapeptide having the 104-118 amino acid sequence of INGAP (INGAP-PP) on the expression of genes related to the pancreatic islets, the expression and phosphorylation of components of the PI3K and MAPK pathways, the cholinergic signaling, and static and dynamic insulin secretion in neonatal rat islet. Islets cultured with INGAP-PP released significantly more insulin in response to glucose than controls. The macroarray analysis showed that 210 out of 2,352 genes, spotted in the nylon membranes, were up- ,regulated while only 4 were down-regulated by INGAP-PP-treatment. The main categories of genes modulated by INGAP-PP 4-days cultured islet include several genes related with islet metabolism, insulin secretion mechanism, growth, maturation, maintenance of islet-cell mass, and exocytosis. Shortterm exposure of neonatal islets to INGAP-PP significantly increased Akt-Ser473 and ERK1/2-Thr202/Tyr204 phosphorylation as well as insulin secretion from islets perifused with 2 and 20 mM glucose. Four-days cultured islets with INGAP-PP also showed increased expression of M3 receptor subtype and PLC-ß2 proteins. In addition, brief exposure of INGAP-PP-treated islets to Cch significantly increased P70S6KThr389 and ERK1/2 phosphorylation and these islets released more insulin when challenged with Cch. In conclusion, these data show that INGAP-PP enhances insulin secretion and transcription of several islet genes, and also increases the expression and phosphorylation of proteins involved in PI3K and MAPK pathways. The increased insulin secretion in response to Cch as well as P70S6K and ERK1/2 proteins phosphorylation, also suggest the participation of the cholinergic pathway in INGAP-PP mediated effects. / Doutorado / Fisiologia / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Rejane Maira Góes, Maria Etelvina Pinto / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T07:52:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Christante_CarolineMaria_M.pdf: 8386652 bytes, checksum: 6c501e195d790722221976fe7452ee67 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Os gonócitos são os precursores das células germinativas masculinas, encontrados durante o período fetal e neonatal. Sua diferenciação neonatal é fundamental para a função reprodutora e envolve retomada da atividade proliferativa, movimentação para a base do epitélio seminífero e diferenciação em espermatogônia. Sabe-se que, no período fetal, a atividade proliferativa dessas células é andrógeno dependente, e que a obesidade altera o cenário dos hormônios sexuais, levando a um aumento dos níveis de andrógenos em mulheres. Contudo, pouco é conhecido sobre os efeitos da obesidade materna sobre o desenvolvimento do aparelho genital masculino, em particular no período neonatal, e as implicações com o cenário hormonal. Sendo assim, o objetivo desse estudo foi avaliar se a obesidade materna interfere no desenvolvimento neonatal do testículo de ratos Wistar, tanto no que se refere às suas características morfológicas gerais, quanto à diferenciação das células germinativas. A obesidade materna foi induzida pelo tratamento, por 15 semanas, com dieta contendo 20% de lipídeos saturados. Foram utilizados filhotes machos de mães normais e obesas nas idades de 0,5, 4,5, 7,5 e 14,5 dias pós-parto (dpp). Os testículos foram processados para microscopias de luz e eletrônica de transmissão. Os cortes histológicos submetidos à reação imunocitoquímica para hormônio anti-Mülleriano (AMH) foram utilizados para a determinação da densidade numérica (Nv) de gonócitos e estimativa da densidade de gonócitos reposicionados para a periferia do túbulo. Também foi avaliado os níveis de apoptose, após imunocitoquímicas para Caspase 3 ativada, e a localização dos receptores de andrógeno (AR) e de estrógeno (ER? e ER?). Nossos resultados revelaram uma diminuição no peso dos filhotes de mães obesas, ao nascimento, mas nenhuma variação foi observada para a distância anogenital. O peso das gônadas foi significantemente menor para os animais obesos de 4,5 dpp, resultando em uma variação do índice gonadossomático, nessa idade. A Nv de gonócitos e os níveis de apoptose não variaram nos neonatos de mães obesas em comparação com o grupo controle, em nenhuma das idades consideradas. No entanto, o número de gonócitos reposicionados para a base do epitélio seminífero, aos 4,5 dpp, foi aproximadamente o dobro nos testículos de animais controle em comparação com os submetidos à obesidade materna. Também foi observado que esse tipo celular não possui imunoreatividade para AR. Entretanto, as células de origem mesenquimal e o citoplasma das células de Leydig fetais, de maneira geral, são imunomarcados. Com relação aos níveis de andrógenos, verificou-se que as médias obtidas para os animais sujeitos à obesidade materna, de 4,5 até 14,5 dpp, são muito semelhantes às encontradas para as idades anteriores no grupo controle, sendo possível inferir que a obesidade materna afete a esteredoigênese e promova alterações na concentração de testosterona, no período peri-natal. De maneira geral, nossos dados indicam que a obesidade materna afeta os níveis de esteroides sexuais e, consequentemente, o padrão de diferenciação dos gonócitos. Contudo, tais alterações parecem ocorrer nos primeiros dias de vida, principalmente na idade de 4,5 dpp, com uma recuperação do desenvolvimento testicular ainda no período pré-púbere / Abstract: The gonocytes are the precursors of male germ cells, found during fetal and neonatal period. Their differentiation is critical for neonatal reproductive function and involves resumption of proliferative activity, drive to the base of the seminiferous epithelium and differentiation into spermatogonia. It is also known that in the neonatal period the proliferative activity of these cells is androgen-dependent, and that the obesity changes the sex hormones scenario, leading to increased androgens levels in women. However, little is known about the effects of maternal obesity on the male genital tract development, particularly in the neonatal period, and the implications with hormonal scenario. Therefore, the objective of this study was to evaluate whether maternal obesity interferes with rat testis development, both with regard to their overall morphology, as the differentiation of germ cells. Obesity was induced by treating, for 15 weeks, with a diet containing 20% of saturated lipids. We used male offspring from normal and obese mothers at 0.5, 4.5, 7.5 and 14.5 days postpartum (dpp). The testes were processed for light microscopy and transmission electron microscopy. The sections subjected to immunocytochemistry for anti- Müllerian Hormone (AMH) were used to determine the numerical density (Nv) of gonocytes and density estimation of repositioned gonocytes to the periphery of the tubule. We also assessed the apoptosis levels after immunocytochemistry for activated Caspase 3, and location of androgen receptors (AR) and estrogen (ER? and ER?). Our results showed a decrease in the weight of pups born from obese mothers, at birth, but no change was observed for the anogenital distance. The gonad weight was significantly lower in obese animals at 4.5 dpp, resulting in a variation of the gonadosomatic index in this age. The Nv of gonocytes and apoptosis levels did not differ in newborns subjected to maternal obesity compared with the control group, for any age considered. However, the number of repositioned gonocytes to the base of the seminiferous epithelium at 4.5 dpp was approximately twice in control group compared with the maternal obesity group. It was also observed that this cell type has no AR immunoreactivity. However, mesenchymal cells and the cytoplasm of the fetal Leydig cells generally are immunostained. With respect to androgens levels, it was found that the mean for the animals subjected to maternal obesity from 4.5 to 14.5 dpp are very similar to those found in earlier ages in the control group, it is possible to infer that maternal obesity affects steroidogenesis and promotes changes in testosterone concentration, in the perinatal period. Overall, our data indicate that maternal obesity affects the sex steroids levels and, consequently, the pattern of differentiation of gonocytes. However, these changes seem to occur in the first days of life, especially at the age of 4.5 dpp, with a recovery of testicular development in the pre-pubertal age / Mestrado / Biologia Celular / Mestra em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Antonio Carlos Boschero / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-06T10:55:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Stoppiglia_LuizFabrizio_D.pdf: 2405428 bytes, checksum: 6387a533bea2ca65f3826092e2220b39 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: No diabetes mellitus, radicais de oxigênio estão associados com perda de sensibilidade à glicose ou destruição das células b. Nesse trabalho, investigamos a tolerância de ilhotas de Langerhans de ratos neonatos ao estresse provocado por H2O2, seus mecanismos antioxidantes de defesa e os fatores que promovem manutenção da sensibilidade à glicose. Cultivadas com 1 mM de H2O2, as ilhotas aumentaram até 6' seu consumo de glicose e resistiram ao estresse induzido por H2O2 quando em meio contendo 20 mM de glicose. A expressão da enzima catalase em resposta à glicose se mostrou necessária a essa resistência, mas não suficiente. Em concentrações baixas de H2O2, quando a catalase tem sua atividade modulada por NADPH, observamos que mesmo proteínas sem atividade catalítica adquiriam capacidade antioxidante e eram regeneradas por NADPH. Mapeando a distribuição de atividade peroxidase na ilhota, observamos sensibilidade ao NADPH nas frações nuclear e citossólica. As ilhotas cultivadas em 20 mM de glicose e as que resistem ao H2O2 possuem em comum uma maior atividade da via das pentoses, que gera NADPH citossólico. Nessas ilhotas, verificamos que a produção citossólica de NAD(P)H limita a secreção de insulina. Tais ilhotas produzem NAD(P)H principalmente da oxidação de substratos endógenos no citossol e nas mitocôndrias, ao invés de localizarem seu uso somente no citossol, como se dá nas ilhotas mais sensíveis ao H2O2. A cultura com 20 mM de glicose produziu ilhotas com alta expressão da lançadeira de NADH glicerol-fosfato, enquanto o H2O2 selecionou ilhotas com alta expressão da lançadeira mal/asp. Como ambas as lançadeiras promovem a comunicação entre citossol e mitocôndrias, concluímos que o sistema de lançadeiras e a geração de NADPH sejam fatores críticos para a manutenção da sensibilidade à glicose nas ilhotas / Abstract: In diabetes mellitus, oxygen radicals are associated with loss of glucose-sensibility and destruction of b-cells. In this work, we investigated the tolerance of neonatal rat islets to stress induced by H2O2, the islets antioxidant defense mechanism and factors maintaining islet glucoseresponsiveness. Islets cultured with 1 mM of H2O2 increased 6 fold the glucose uptake and resisted H2O2-induced stress when cultured in media containing 20 mM of glucose. Glucose-induced catalase expression was shown to be necessary to islet cell-survival, although not sufficient. In low H2O2 concentrations, the activity of catalase is dependent on NADPH and we observed that even proteins with no catalytic activity could be antioxidants regenerated by NADPH. Mapping the peroxidase activity in islets, we observed sensibility to NADPH in nuclear and cytossolic fractions. Islets cultured with 20 mM of glucose and islets that survived after culture with H2O2 both showed increased activity of the pentose phosphate pathway, which generate cytossolic NADPH. Is theses islets, we verified that cytossolic production of NAD(P)H limits insulin secretion. Such islets generate NAD(P)H principally from oxidation of endogenous fuels in cytossol and mitochondria, in contrary of the most H2O2-sensible islets which use endogenous fuels exclusively in cytossol. Culture with 20 mM of glucose produced islets with high expression of the glycerol-phosphate NADH shuttle, where as culture with H2O2 selected islets with high expression of the mal/asp shuttle. Since both shuttles promote interchange between cytossol and mitochondria, we have concluded that the shuttle system together with NAD(P)H generation ability are critical factors in maintaining islet glucoseresponsiveness / Doutorado / Fisiologia / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Jose Camillo Novello / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-14T12:47:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dias_ErichdeCastro_M.pdf: 2721434 bytes, checksum: 5649b1cd35c4a6d4ef9aef257d027b24 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Neurotraumas periféricos, situação recorrente atualmente na humanidade, resultam em reorganizações e modificações tanto do sistema nervoso periférico que foi lesado quanto do sistema nervoso central, mais especificamente da medula espinhal na tentativa de reparar o dano gerado. O período pós-natal apresenta intensa plasticidade neuronal medular já que é o intervalo no qual a medula espinhal apresenta a maior capacidade de sofrer alterações e rearranjos dependentes de estímulos internos e externos, sendo assim, podem ocorrer modificações em seu desenvolvimento. Logo, este período é considerado ideal para estudos dos mecanismos envolvidos na degeneração e em possíveis reparos do tecido nervoso após um neurotrauma periférico. Visando contribuir para a elucidação dos mecanismos de neurodegeneração, este trabalho propôs um enfoque proteômico, área que na era pós-genômica tornou-se essencial tanto para a compreensão dos mecanismos que regem um organismo quanto para a análise comparativa entre duas condições contrastantes no mesmo organismo. Utilizando-se uma combinação entre as duas técnicas mais clássicas e usuais em estudos de proteoma, a eletroforese de duas dimensões e a espectrometria de massas, estudou-se o perfil proteômico da medula espinhal de ratos com sete dias de vida em duas situações distintas, uma que sofreu axotomia do nervo ciático com dois dias de vida, e a outra que não sofreu tal lesão, com a finalidade de conhecer as proteínas diferencialmente expressas nas duas classes e sugerir suas prováveis funções biológicas. Dentre essas, foram identificadas proteínas responsáveis diretamente e indiretamente pela desintoxicação celular e combate as espécies reativas de oxigênio como a catalase, a glutationa S-trasnferase Mu1 e a glicose 6-fosfato 1-desidrogenase, além da proteína dissulfeto isomeraseA3 que participa do processo oxidativo. Proteínas estruturais como a tubulina ß-5 e a anexina A6 também foram identificadas. Infere-se, dessa forma, que essas e outras proteínas podem representar alvos moleculares importantes para futuros tratamentos visando à diminuição da degeneração e o reparo de uma lesão nervosa periférica. / Abstract: Peripheral neurotraumas are a common situation nowadays in humanity. These nerve damages results in reorganizations and modifications over the own injured peripheral nerve system and over the central nerve system, more specifically over the spinal cord due the attempt to repair the damage. The post-natal period shows intense neuronal plasticity on spinal cord because the spinal cord ability to suffer alterations and rearrangements due internal and external stimuli, therefore maybe occur modifications in your development. Therefore, this period is ideal for study the involved mechanisms in nerve degeneration and nerve tissue repair after a neurotrauma. Trying to contribute with the degeneration mechanisms elucidation, this study proposed a proteomic approach, field which in the post-genomic era has become essential for both, to understanding all the pathways which controls an organism as to comparative analysis between two different conditions of the same organism. Using the two most useful and classical techniques combination for proteomics labor, which are two dimension electrophoresis and mass spectrometry, was studied a seven days of life rat's spinal cord proteomic profile in two different situations: in the first, the rats had suffered sciatic nerve section with two days of life and other that the rats had not suffered any trauma in sciatic nerve. The purpose is to know the differentially expressed proteins in the two classes and suggest their probable biological functions. Among these, proteins directly responsible for the cell detoxification and combat the reactive oxygen species were identified, like a catalase, a Glutathione S-transferase Mu 1 and a Glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase. Structural proteins like a ß-5 Tubulin and Protein disulfide isomerase A3 were indentified too. Thus it, these and other proteins could represent important molecular targets to future treatments aiming the post trauma degeneration decrease and the peripheral nerve injury repair. / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

A dor pediátrica tem sido o foco de estudo de muitos pesquisadores nas últimas décadas devido à constatação de que neonatos apresentam menor limiar para estímulos nocivos e inócuos em comparação aos adultos. Em decorrência disto, o uso de analgésicos tem sido frequente em ambiente hospitalar. A morfina é um dos analgésicos opióides mais utilizados para sedação e analgesia nestes pacientes. Este opióide apresenta maior potência analgésica no período neonatal, sendo o receptor μ mais expresso em neurônios medulares com pico de densidade em P7 e diminuindo até o P21, atingindo então níveis de adulto. Nosso grupo mostrou que ratos neonatos submetidos ao tratamento repetido com morfina não apresentam tolerância. Porém, permanecem maior tempo em analgesia ao final do tratamento do que no 1º dia. Além disto, após dois dias do término do tratamento os animais apresentaram alterações na atividade e expressão gênica da NTPDase 1 (enzima que hidrolisa ATP até adenosina) em medula espinal e córtex cerebral, sugerindo modulação nos níveis extracelulares de nucleotídeos, o que pode levar alterações na resposta nociceptiva. Além do sistema purinérgico outro importante sistema no processamento da resposta nociceptiva é o glutamatérgico. Desde o período neonatal o glutamato é o responsável pelos estímulos nociceptivos em medula espinal, e transportadores no terminal pré-sináptico ou glia são responsáveis pela captação do glutamato liberado, controlando seus níveis. A exposição à morfina também leva a mudanças comportamentais, conhecidas por sensibilização comportamental, que são dependentes, em parte, da ativação do receptor dopaminérgico D2 no sistema límbico. Além disso, esta exposição pode alterar os níveis de BDNF em estruturas relacionadas à nocicepção. Levando em consideração a carência de estudos focados nos efeitos da exposição repetida a opióides em neonatos, o objetivo deste estudo foi verificar os efeitos a curto (P16), médio (P30) e longo prazo (P60) do tratamento com 5 μg de morfina, uma vez ao dia, do P8 ao P14, sobre comportamento nociceptivo; captação de glutamato em medula espinal; comportamentos exploratórios e do tipo ansioso, avaliando o envolvimento do receptor D2; níveis de BDNF e TNF-α, e estresse oxidativo em hipocampo; atividades de nucleotidases solúveis em soro; e além disso avaliar a ação antinociceptiva da melatonina nas respostas nociceptivas alteradas. Os animais que receberam morfina demonstraram em P30 e P60: aumento da resposta nociceptiva que foi revertida por antagonista do receptor NMDA; diminuição da captação de glutamato em medula espinal; aumento dos níveis de BDNF em hipocampo, e diminuição da atividade da SOD no P60; alterações nas atividades das nucleotidases solúveis; aumento do comportamento exploratório no P16 e P30; efeito antinociceptivo da melatonina na hiperalgesia. Estes dados demonstram a necessidade de pesquisas que sejam focadas nos efeitos do tratamento com morfina no período neonatal ao longo da vida, bem como buscar alternativas terapêuticas que possam reverter possíveis alterações. / The study of pediatric pain has been the focus of many researchers in recent decades due to the fact that neonates have a lower threshold for innocuous and noxious stimuli compared to adults. As a result, the use of analgesics has been frequent in hospitals. Morphine is an opioid analgesic commonly used for sedation in these patients. This opioid presents greater analgesic potency in the neonatal period in which the μ opioid receptor is over expressed in neurons of the spinal cord, with peak binding on day 7 and decreasing until day 21, reaching adult levels then. Our research group has shown that neonate rats subjected to repeated treatment with morphine not present tolerance. However, they remain with more time of analgesia at the end of treatment than on first day. Moreover, two days after the end of treatment the animals showed changes in activity and gene expression of NTPDase 1 (enzyme that hydrolyzes ATP to adenosine) in spinal cord and cerebral cortex, suggesting modulation of nucleotides extracellular levels which can alters nociceptive response. Besides the purinergic system another important system associated with nociceptive pathways is glutamatergic. Since the neonatal period glutamate is responsible for nociceptive stimulus in spinal cord, being its level controlled by transporters in the presynaptic terminal or glia responsible for the uptake of glutamate released. Importantly, studies have shown that morphine administration in adult animals can lead to behavioral changes, known as behavioral sensitization, dependent of activation of the limbic dopamine system, with the D2 dopamine receptor is associated with these changes. Moreover, such exposure may lead to altered levels of BDNF on the nociception related structures. Considering the lack of studies focused on the effects of repeated exposure to opioids in neonates, the objective of this study was to assess the short-(P16), medium (P30) and long term (P60) effects of treatment with 5 μg of morphine, once a day, from 8 to 14 days old, on nociceptive behavioral responses; glutamate uptake in the spinal cord; exploratory and type anxiously behavioral responses assessing the involvement of the dopamine receptor D2; levels of BDNF and TNF-α, and oxidative stress in the hippocampus; activities of serum soluble nucleotidases, and furthermore evaluate the antinociceptive action of melatonin on nociceptive responses changed. The results obtained with this study show that in P30 and P60 the animals that had received morphine: increase of the nociceptive response that was reversed by NMDA receptor antagonist, decreased glutamate uptake in spinal cord; increasing levels of BDNF in hippocampus, and decreased activity of the antioxidant enzyme SOD in P60; changes in nucleotide hydrolysis; increased exploratory behavior in P16 and P30; antinociceptive effect of melatonin on nociceptive responses increased. These data demonstrate the need for further research that are focused on the effects of morphine treatment in the neonatal period lifelong and seek alternative therapies that can reverse any changes.

A dor pediátrica tem sido o foco de estudo de muitos pesquisadores nas últimas décadas devido à constatação de que neonatos apresentam menor limiar para estímulos nocivos e inócuos em comparação aos adultos. Em decorrência disto, o uso de analgésicos tem sido frequente em ambiente hospitalar. A morfina é um dos analgésicos opióides mais utilizados para sedação e analgesia nestes pacientes. Este opióide apresenta maior potência analgésica no período neonatal, sendo o receptor μ mais expresso em neurônios medulares com pico de densidade em P7 e diminuindo até o P21, atingindo então níveis de adulto. Nosso grupo mostrou que ratos neonatos submetidos ao tratamento repetido com morfina não apresentam tolerância. Porém, permanecem maior tempo em analgesia ao final do tratamento do que no 1º dia. Além disto, após dois dias do término do tratamento os animais apresentaram alterações na atividade e expressão gênica da NTPDase 1 (enzima que hidrolisa ATP até adenosina) em medula espinal e córtex cerebral, sugerindo modulação nos níveis extracelulares de nucleotídeos, o que pode levar alterações na resposta nociceptiva. Além do sistema purinérgico outro importante sistema no processamento da resposta nociceptiva é o glutamatérgico. Desde o período neonatal o glutamato é o responsável pelos estímulos nociceptivos em medula espinal, e transportadores no terminal pré-sináptico ou glia são responsáveis pela captação do glutamato liberado, controlando seus níveis. A exposição à morfina também leva a mudanças comportamentais, conhecidas por sensibilização comportamental, que são dependentes, em parte, da ativação do receptor dopaminérgico D2 no sistema límbico. Além disso, esta exposição pode alterar os níveis de BDNF em estruturas relacionadas à nocicepção. Levando em consideração a carência de estudos focados nos efeitos da exposição repetida a opióides em neonatos, o objetivo deste estudo foi verificar os efeitos a curto (P16), médio (P30) e longo prazo (P60) do tratamento com 5 μg de morfina, uma vez ao dia, do P8 ao P14, sobre comportamento nociceptivo; captação de glutamato em medula espinal; comportamentos exploratórios e do tipo ansioso, avaliando o envolvimento do receptor D2; níveis de BDNF e TNF-α, e estresse oxidativo em hipocampo; atividades de nucleotidases solúveis em soro; e além disso avaliar a ação antinociceptiva da melatonina nas respostas nociceptivas alteradas. Os animais que receberam morfina demonstraram em P30 e P60: aumento da resposta nociceptiva que foi revertida por antagonista do receptor NMDA; diminuição da captação de glutamato em medula espinal; aumento dos níveis de BDNF em hipocampo, e diminuição da atividade da SOD no P60; alterações nas atividades das nucleotidases solúveis; aumento do comportamento exploratório no P16 e P30; efeito antinociceptivo da melatonina na hiperalgesia. Estes dados demonstram a necessidade de pesquisas que sejam focadas nos efeitos do tratamento com morfina no período neonatal ao longo da vida, bem como buscar alternativas terapêuticas que possam reverter possíveis alterações. / The study of pediatric pain has been the focus of many researchers in recent decades due to the fact that neonates have a lower threshold for innocuous and noxious stimuli compared to adults. As a result, the use of analgesics has been frequent in hospitals. Morphine is an opioid analgesic commonly used for sedation in these patients. This opioid presents greater analgesic potency in the neonatal period in which the μ opioid receptor is over expressed in neurons of the spinal cord, with peak binding on day 7 and decreasing until day 21, reaching adult levels then. Our research group has shown that neonate rats subjected to repeated treatment with morphine not present tolerance. However, they remain with more time of analgesia at the end of treatment than on first day. Moreover, two days after the end of treatment the animals showed changes in activity and gene expression of NTPDase 1 (enzyme that hydrolyzes ATP to adenosine) in spinal cord and cerebral cortex, suggesting modulation of nucleotides extracellular levels which can alters nociceptive response. Besides the purinergic system another important system associated with nociceptive pathways is glutamatergic. Since the neonatal period glutamate is responsible for nociceptive stimulus in spinal cord, being its level controlled by transporters in the presynaptic terminal or glia responsible for the uptake of glutamate released. Importantly, studies have shown that morphine administration in adult animals can lead to behavioral changes, known as behavioral sensitization, dependent of activation of the limbic dopamine system, with the D2 dopamine receptor is associated with these changes. Moreover, such exposure may lead to altered levels of BDNF on the nociception related structures. Considering the lack of studies focused on the effects of repeated exposure to opioids in neonates, the objective of this study was to assess the short-(P16), medium (P30) and long term (P60) effects of treatment with 5 μg of morphine, once a day, from 8 to 14 days old, on nociceptive behavioral responses; glutamate uptake in the spinal cord; exploratory and type anxiously behavioral responses assessing the involvement of the dopamine receptor D2; levels of BDNF and TNF-α, and oxidative stress in the hippocampus; activities of serum soluble nucleotidases, and furthermore evaluate the antinociceptive action of melatonin on nociceptive responses changed. The results obtained with this study show that in P30 and P60 the animals that had received morphine: increase of the nociceptive response that was reversed by NMDA receptor antagonist, decreased glutamate uptake in spinal cord; increasing levels of BDNF in hippocampus, and decreased activity of the antioxidant enzyme SOD in P60; changes in nucleotide hydrolysis; increased exploratory behavior in P16 and P30; antinociceptive effect of melatonin on nociceptive responses increased. These data demonstrate the need for further research that are focused on the effects of morphine treatment in the neonatal period lifelong and seek alternative therapies that can reverse any changes.

A dor pediátrica tem sido o foco de estudo de muitos pesquisadores nas últimas décadas devido à constatação de que neonatos apresentam menor limiar para estímulos nocivos e inócuos em comparação aos adultos. Em decorrência disto, o uso de analgésicos tem sido frequente em ambiente hospitalar. A morfina é um dos analgésicos opióides mais utilizados para sedação e analgesia nestes pacientes. Este opióide apresenta maior potência analgésica no período neonatal, sendo o receptor μ mais expresso em neurônios medulares com pico de densidade em P7 e diminuindo até o P21, atingindo então níveis de adulto. Nosso grupo mostrou que ratos neonatos submetidos ao tratamento repetido com morfina não apresentam tolerância. Porém, permanecem maior tempo em analgesia ao final do tratamento do que no 1º dia. Além disto, após dois dias do término do tratamento os animais apresentaram alterações na atividade e expressão gênica da NTPDase 1 (enzima que hidrolisa ATP até adenosina) em medula espinal e córtex cerebral, sugerindo modulação nos níveis extracelulares de nucleotídeos, o que pode levar alterações na resposta nociceptiva. Além do sistema purinérgico outro importante sistema no processamento da resposta nociceptiva é o glutamatérgico. Desde o período neonatal o glutamato é o responsável pelos estímulos nociceptivos em medula espinal, e transportadores no terminal pré-sináptico ou glia são responsáveis pela captação do glutamato liberado, controlando seus níveis. A exposição à morfina também leva a mudanças comportamentais, conhecidas por sensibilização comportamental, que são dependentes, em parte, da ativação do receptor dopaminérgico D2 no sistema límbico. Além disso, esta exposição pode alterar os níveis de BDNF em estruturas relacionadas à nocicepção. Levando em consideração a carência de estudos focados nos efeitos da exposição repetida a opióides em neonatos, o objetivo deste estudo foi verificar os efeitos a curto (P16), médio (P30) e longo prazo (P60) do tratamento com 5 μg de morfina, uma vez ao dia, do P8 ao P14, sobre comportamento nociceptivo; captação de glutamato em medula espinal; comportamentos exploratórios e do tipo ansioso, avaliando o envolvimento do receptor D2; níveis de BDNF e TNF-α, e estresse oxidativo em hipocampo; atividades de nucleotidases solúveis em soro; e além disso avaliar a ação antinociceptiva da melatonina nas respostas nociceptivas alteradas. Os animais que receberam morfina demonstraram em P30 e P60: aumento da resposta nociceptiva que foi revertida por antagonista do receptor NMDA; diminuição da captação de glutamato em medula espinal; aumento dos níveis de BDNF em hipocampo, e diminuição da atividade da SOD no P60; alterações nas atividades das nucleotidases solúveis; aumento do comportamento exploratório no P16 e P30; efeito antinociceptivo da melatonina na hiperalgesia. Estes dados demonstram a necessidade de pesquisas que sejam focadas nos efeitos do tratamento com morfina no período neonatal ao longo da vida, bem como buscar alternativas terapêuticas que possam reverter possíveis alterações. / The study of pediatric pain has been the focus of many researchers in recent decades due to the fact that neonates have a lower threshold for innocuous and noxious stimuli compared to adults. As a result, the use of analgesics has been frequent in hospitals. Morphine is an opioid analgesic commonly used for sedation in these patients. This opioid presents greater analgesic potency in the neonatal period in which the μ opioid receptor is over expressed in neurons of the spinal cord, with peak binding on day 7 and decreasing until day 21, reaching adult levels then. Our research group has shown that neonate rats subjected to repeated treatment with morphine not present tolerance. However, they remain with more time of analgesia at the end of treatment than on first day. Moreover, two days after the end of treatment the animals showed changes in activity and gene expression of NTPDase 1 (enzyme that hydrolyzes ATP to adenosine) in spinal cord and cerebral cortex, suggesting modulation of nucleotides extracellular levels which can alters nociceptive response. Besides the purinergic system another important system associated with nociceptive pathways is glutamatergic. Since the neonatal period glutamate is responsible for nociceptive stimulus in spinal cord, being its level controlled by transporters in the presynaptic terminal or glia responsible for the uptake of glutamate released. Importantly, studies have shown that morphine administration in adult animals can lead to behavioral changes, known as behavioral sensitization, dependent of activation of the limbic dopamine system, with the D2 dopamine receptor is associated with these changes. Moreover, such exposure may lead to altered levels of BDNF on the nociception related structures. Considering the lack of studies focused on the effects of repeated exposure to opioids in neonates, the objective of this study was to assess the short-(P16), medium (P30) and long term (P60) effects of treatment with 5 μg of morphine, once a day, from 8 to 14 days old, on nociceptive behavioral responses; glutamate uptake in the spinal cord; exploratory and type anxiously behavioral responses assessing the involvement of the dopamine receptor D2; levels of BDNF and TNF-α, and oxidative stress in the hippocampus; activities of serum soluble nucleotidases, and furthermore evaluate the antinociceptive action of melatonin on nociceptive responses changed. The results obtained with this study show that in P30 and P60 the animals that had received morphine: increase of the nociceptive response that was reversed by NMDA receptor antagonist, decreased glutamate uptake in spinal cord; increasing levels of BDNF in hippocampus, and decreased activity of the antioxidant enzyme SOD in P60; changes in nucleotide hydrolysis; increased exploratory behavior in P16 and P30; antinociceptive effect of melatonin on nociceptive responses increased. These data demonstrate the need for further research that are focused on the effects of morphine treatment in the neonatal period lifelong and seek alternative therapies that can reverse any changes.