Made available in DSpace on 2016-06-02T20:34:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseGCLA.pdf: 4953630 bytes, checksum: 13c8dd01d0df7c6da5e9a087678857f8 (MD5) Previous issue date: 2004-09-03 / Universidade Federal de Minas Gerais / This work suggests the chemical characterization of the genus Paspalum and was divided in 3 steps: 1) sample preparation of plants with diluted acids; 2) biosorption studies employing Paspalum notatum root material, and 3) investigation of root cellular wall constituents. Therefore, in the first step, solutions ranging from 2 to 14 mol L-1 HNO3 were used to assisted high-pressure microwave plant samples digestion. Quantitative amounts of analytes were obtained, including Fe and Al, by using 2 mL of 2 mol L-1 HNO3 solution plus 1 mL of H2O2 30 % v v-1. Residual carbon contents were ≤ 11 %. The 1H NMR spectra indicated lower variety of nitrocompounds for samples digested with diluted acids. For the second step, sorption studies in root material leached and no-leached with 0.14 mol L-1 HNO3 solution were performed. The sorption obtained for the former was higher than for the latter material. Sorption isotherms of Al3+, Fe3+, Cu2+ and Ni2+ in H3CCOONH4 and KNO3 environments with mono and multielemental solutions were plotted and adjusted to the more representative theoretical models for the experimental results. The KNO3 monoelemental studies presented higher sorption for Fe and Cu than for H3CCOONH4 environment, probably owing to the absence of bounding ions. Sorption has reduced for all analytes in KNO3 multielemental studies, probably owing to the competition by the sorption sites. In the other hand, H3CCOONH4 multielemental studies showed an increasing of two times for Fe and Al sorption, probably due to lateral interactions between the analytes and the biosorbent surfaces, which were verified with sorption isotherm profiles. In the last step, the 1H NMR spectra and the potentiometric titration indicated that the acid rinsing changed the material. In this case, interpretation of the results obtained with potentiometric titration suggests the amine and phenol groups as likely sorption sites. The determination of Al, Fe, Cu, Ni, aminoacids and sugar in fractions obtained from the sequential extraction of the cell wall compounds, combined to Pearson s correlation coefficient studies, evidenced different distributions of the analytes at the fractions and material. Thus, the functional groups related to each metal could be estimated. / Este trabalho propõe a caracterização química do gênero Paspalum e, para tanto foi dividido em 3 etapas: 1) preparo de amostras vegetais com ácido diluídos; 2) estudos de biossorção empregando material radicular de Paspalum notatum e 3) investigação de constituintes da parede celular do material radicular. Assim, para a primeira etapa, foram empregadas soluções de HNO3 (2 a 14 mol L-1) para a digestão de amostras vegetais assistida por forno de microondas com cavidade. Foram obtidas recuperações quantitativas de analitos, incluindo Fe e Al, empregando-se 2 mL de solução de HNO3 2 mol L-1 e 1 mL de H2O2 30 % v v-1. Os teores de carbono residual obtidos foram ≤ 11 %. A análise dos espectros de 1H NMR indicou menor variedade de nitrocompostos para as amostras preparadas com ácidos diluídos. Para a segunda etapa realizaram-se estudos de sorção em material radicular de Paspalum notatum não lixiviado e lixiviado com HNO3 0,14 mol L-1. Foram obtidas sorções mais elevadas para o material previamente lixiviado. Isotermas de sorção para Al3+, Fe3+, Cu2+ e Ni2+ em meio H3CCOONH4 e KNO3, com soluções mono e multilementares, foram traçadas, sendo ajustados os modelos teóricos mais representativos dos resultados experimentais. O meio KNO3 apresentou sorção mais elevada de Fe e Cu para estudos monoelementares do que o meio H3CCOONH4, provavelmente à ausência de íons complexantes. Em estudos multielementares a sorção em meio KNO3 foi reduzida para todos os analitos, provavelmente devido à competição pelos sítios de sorção. Por outro lado, o meio H3CCOONH4 apresentou o dobro de sorção para Fe e Al, provavelmente em função de interações laterais entre os analitos e à superfície do biossorvente, fatos verificados a partir do perfil das isotermas de sorção. Na última etapa do trabalho, espectros de 1H NMR e titulação potenciométrica indicaram que a lixiviação ácida alterou o material. Neste caso, a titulação potenciométrica indicou grupamentos aminos e fenólicos como prováveis sítios de sorção. A determinação de Al, Fe, Cu, Ni, aminoácidos e açúcares nas frações obtidas a partir da extração seqüencial dos componentes da parede celular, aliada a estudos de correlação de Pearson, permitiu evidenciar diferentes distribuições dos analitos nas frações e nos materiais. Assim, os grupos funcionais relacionados a cada metal puderam ser estimados.

Orientadores: Márcia Regina Braga, Simone de Pádua Teixeira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-16T00:05:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Caccere_Rodrigo_M.pdf: 5287310 bytes, checksum: 7433584cc6dacc1485f7ed86dd51116e (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Inga vera Pennington produz sementes com alta sensibilidade à dessecação, o que dificulta seu armazenamento. Diversos mecanismos estão relacionados tolerância à dessecação, dentre eles o acúmulo de reservas insolúveis e de moléculas protetoras, redução do metabolismo e dobramento da parede celular. Desse modo, o objetivo deste trabalho foi analisar o comportamento de eixos embrionários e cotilédones de I. vera com respeito a seus teores e composição de açúcares solúveis, de reserva e de parede celular e quanto à ultra-estrutura durante a maturação e após a secagem. Eixos embrionários e cotilédones de I. vera durante a maturação, acumulam altos níveis de amido e armazenam também outras substâncias como compostos fenólicos. O acúmulo de massa seca e o processo de vacuolização durante todo o desenvolvimentos dos embriões desta espécie indicam alta atividade metabólica até o momento da dispersão. Além disso, as paredes celulares de eixos embrionários e cotilédones acumulam galactanos que podem lhe conferir maior rigidez. Embriões de I. vera secos até 35% de teor de água apresentaram redução da capacidade germinativa. Esta desidratação parcial provocou um estímulo metabólico, evidenciado pela mobilização de reservas e deposição de material nas paredes celulares, além de intensa atividade do retículo endoplasmático rigoso, observada nos eixos embrionários. A secagem severa (17% de teor de água) provocou rompimento das membranas resultando no aparecimento de células completamente colapsadas. Dessa forma, pode-se concluir que embriões I. vera mantém o metabolismo ativo durante a desidratação até que os processos de injúria comecem a ocorrer. / Abstract: Inga vera Pennington produces recalcitrant seeds, characterized by desiccation sensibility and short post-harvest life span, no longer than one mouth. Mechanisms proposed to explain the ability of organisms to survive desiccation include accumulation of insoluble reserves and protective molecules, metabolic "switch off" and cell wall folding, among others. The aim of the present study was to analyze the behavior of I.vera embryos (axes and cotyledons) with respect to sugar content, cell wall composition and ultrastructure during different stages of development and after desiccation. Axes and cotyledons accumulate starch and phenolic compounds and also showed vacuolization all over development, suggesting high metabolic activity up to the end of the maturation period. Moreover, cell walls of axes and cotyledons cantain polysaccharides, like galactans, that can provide more rigidity to the cell wall. Mature I.vera seeds were dried 35% or 17% and seed variability was skilghtly reduced due to drying to 35% of water content, but no seeds survived to severe desiccation (17% water content). Starch mobilization, increase in the cell wall thickness in axes and cotyledons, and high degree of development of the rough endoplasmic reticulum in axes suggest that drying to 35% of water content enhanced metabolic activity. Severe desiccation resulted in membrane breaking leading to collapsed protoplasm. Therefore we can conclude that I.vera embryos keep high metabolic activity during desiccation until damage processes start. / Mestrado / Biologia Celular / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

A ocorrência de mamões Golden com casca verde e polpa mole, em determinadas épocas do ano, tem sido relatada por produtores da região Norte do Espírito Santo. Não sendo possível distinguir frutos com o distúrbio do amolecimento precoce (DAP) apenas pela análise da cor da casca e da firmeza da polpa no momento da colheita, o objetivo deste trabalho foi estudar aspectos da fisiologia e bioquímica do amadurecimento que pudessem auxiliar no entendimento da perda precoce da firmeza. As coletas ocorreram no período de maior frequência de frutos com o distúrbio (meados de verão a final de outono). Os frutos foram coletados no estádio 1 de maturação, armazenados a 10º±1oC e 85±10% UR, durante 10 dias e submetidos à metodologia do Índice de Amolecimento (IA). O sintoma do amolecimento precoce foi observado claramente no 4°dia após o armazenamento sendo verificada a perda de firmeza nos frutos com DAP entre o 2° e o 8°dia a 10°C, sendo o decréscimo na firmeza equivalente a 71% da firmeza inicial, comportamento atípico para frutos armazenados sob refrigeração. Frutos com e sem DAP não apresentaram diferença significativa no teor de sólidos solúveis, acidez titulável e ácido ascórbico. A atividade respiratória e a produção de etileno foram reduzidas com o armazenamento refrigerado, sem diferença entre os frutos com e sem DAP, o que sugere que o aparecimento do distúrbio não se deve ao aumento na produção de etileno no período póscolheita. Os resultados indicam forte associação entre o amolecimento precoce e mudanças na parede celular. O rendimento das frações solúvel em água (FSA) e em NaOH (FSH) nos frutos com DAP, foi superior ao observado nos frutos sem DAP, durante todo o período de armazenamento. O menor nível da fração solúvel em imidazol (FSI) no tempo 0 pode estar associado à maior atividade da pectinametilesterase nos frutos com DAP. O decréscimo na fração celulose (CEL) em frutos com DAP pode indicar modificação na parede celular, ao nível celulose-hemicelulose. A produção de etileno não acompanhou as modificações na parede celular, sugerindo que alterações na estrutura da parede podem ter ocorrido durante o crescimento do fruto. Frutos com DAP apresentaram níveis de auxina (AIA) 6 vezes menor do que frutos sem DAP, no dia 0, sem diferença durante o armazenamento. Possivelmente os níveis de AIA nos frutos com DAP estavam reduzidos quando o fruto ainda estava ligado à planta. O distúrbio possivelmente está relacionado à alteração na parede celular e níveis de AIA. Desta forma, uma alteração hormonal durante o desenvolvimento do fruto anterior à colheita -, associada à sensibilidade do fruto à essa sinalização hormonal, levaria à mudanças na parede celular, o que determinaria a ocorrência do distúrbio do amolecimento precoce. / The occurrence of green skin and soft pulp in Golden papaya fruit during certain seasons has been reported by orchards in northern Espírito Santo State, Brazil. It is not possible solely by skin color and pulp firmness analysis to distinguish early softening disorder fruits (DAP), at the time of harvest, from those without the disorder. The aim of this work was to study the physiological and biochemical ripening aspects that might help to understand the early softening disorder. Fruits were harvested on the most common seasons (mid-summer to mid-autumn) in maturity stage 1 and evaluated for 10 days. Fruits were stored at 10°C, and submitted to softening index (IA). The symptoms of early softening disorder were clearly observed on the 4th day after storage. However, the firmness decrease in DAP fruits happened between the 2nd and 8th day at 10°C, with a decrease of 71% of initial firmness, presenting an atypical behavior for fruits stored under refrigeration. There was no difference between fruits with DAP and without DAP for soluble solids, titratable acidity and ascorbic acid content. Besides that, there was no difference between fruits with DAP and without DAP for respiration rate and ethylene production under refrigerated storage, which suggests that the disorder occurrence is not related to an increase in ethylene in the postharvest period. The results indicate a strong association between early softening disorder and changes in the cell wall composition. The cell wall polymers fractionation show that the yield of water soluble polymers (FSA) and NaOH soluble polymers (FSH) was higher in fruits with DAP than on fruits without DAP during the entire storage period. The smallest level of the imidazole soluble fraction (FSI) in DAP fruit, on day 0, may be related to a higher activity of pectinmethylesterase. The decrease in cellulose-rich polysaccharides (CEL) in the DAP fruit suggest modifications in the cellulose-hemicellulose domain. Ethylene production did not follow cell wall modification, suggesting that changes in the cell wall structure could be happening during fruit growth. DAP fruit presented an AIA level 6 times smaller than fruit without DAP, in day 0, without storage differences. Possibly, AIA levels in DAP fruit were reduced while fruits were still connected to the plant. The disorder may be related to cell wall changes and to AIA level. Should a hormonal change occur during fruit development i. e. prior to harvesting -- and still depending on fruit sensibility to hormonal signaling, cell wall changes could have different intensities, which determine if the fruit will or not have the flesh early softening observed after harvest.

A associação de tecnologias como transgenia, genômica e proteômica aos programas de melhoramento convencional de árvores, pode acelerar o processo de obtenção de exemplares com características específicas da madeira para a indústria de papel e celulose. A parede celular vegetal é extremamente importante para este setor industrial, pois fornece polissacarídeos como celulose e hemiceluloses. A UDP-glucose pirofosforilase (UGPase, EC 2.7.7.9) é uma enzima chave na produção de UDP-glucose, precursor relevante na interconversão de nucleotídeoaçúcares que constituem os monômeros desses polissacarídeos. O objetivo deste trabalho foi clonar os cDNAs que codificam a UGPase, extraídos do tubérculo de batata (Solanum tuberosum L.) e da raiz de eucalipto (Eucalyptus grandis), e inseri-los por meio de transformação genética via Agrobacterium tumefaciens, respectivamente, no genoma de plantas de fumo (Nicotiana tabacum) e de eucalipto, para alterar o fluxo de carbono de modo a aumentar o conteúdo de pentosanas (xilose e arabinose). O maior teor de pentosanas é benéfico economicamente para a indústria de papel e celulose, pois diminui a energia consumida no refino da polpa além de benificiar a qualidade do papel que se torna mais resitente ao rasgo. O impacto da superexpressão do gene ugp nas plantas de tabaco e de eucalipto obtidas da transformação genética, foi avaliado por meio de análises bioquímicas e morfológicas. A análise de Southern blot indicou uma a quatro cópias do transgene no DNA genômico de dez linhagens T2 de tabaco, e uma cópia em uma linhagem T0 de eucalipto. A análise de qPCR mostrou que todas as linhagens T2 de tabaco apresentaram expressão do gene ugp exógeno, sendo que em quatro o nível de expressão foi maior que nas demais. As linhagens com menor expressão do gene ugp exógeno, com exceção de uma delas, também expressaram menos o gene ugp endógeno, sugerindo que nessas linhagens algum mecanismo de regulação atuou alterando a expressão desse gene, tanto endógeno, quanto exógeno. As linhagens transgênicas de tabaco foram morfologicamente semelhantes às plantas controle quando comparadas quanto à altura da planta, comprimento de internós, área foliar total, diâmetro do caule e massa seca da raiz. As alterações nos tabacos transgênicos, em relação aos controles, verificadas através das análises químicas, foram estatisticamente mais significativas na medula caulinar, onde houve aumento no conteúdo dos monossacarídeos e dos ácidos urônicos. As poucas diferenças encontradas no tecido xilemático sugerem que a planta, de alguma forma, tende a alterar menos a composição da parede celular secundária, do que da parede primária. Também sugerem que o metabolismo dos carboidratos pode afetar o conteúdo de lignina, embora seja sintetizada por outra rota metabólica. A parede celular primária, analizada utilizando a medula das plantas de tabaco e folhas de eucalipto, mostrou um aumento no conteúdo de pentosanas, o que não foi observado na análise de plântulas de tabaco. / Assossiating technologies like transgenesis, genomics and proteomics with conventional forestry breeding can accelerate the process of obtaining new trees with specific wood properties for the paper and pulp industry. Plant cell wall is extremely important for this industry, providing polysaccharides like cellulose and hemicelluloses. UDP-glucose pyrophosphorylase (UGPase, EC 2.7.7.9) is a key enzyme producing UDP-glucose, an important forerunner for nucleotide sugars that constitute the monomers of these polysaccharides. The goal in this work was to clone the cDNAs that encode UGPase, extracted from potato (Solanum tuberosum L.) tuber, and eucalypt (Eucalyptus grandis) root, and transfer through genetic transformation via Agrobacterium tumefaciens, respectively, in tobacco (Nicotiana tabacum) plants and eucalypts, in order to change the carbon flux, increasing the pentosans (arabinose and xylose) content. Higher pentosans content is economicaly important for the paper and pulp industry, as decreases energy consumption at pulp refining and also can benefit paper quality that becomes more resistant to rip. The impact of the ugp gene overexpression over tobacco and eucalypt plants obtained through genetic transformation were morphological and biochemicaly evaluated. Southern blot analysis showed one to four copies of the transgene in the genomic DNA of ten tobacco T2 lines, and one copy in one eucalypt T0 line. The qPCR analysis showed that all tobacco T2 lines expressed exogenous ugp gene, being the expression level in four of them biger than the others. Lines that expressed less exogenous ugp gene, with exception of one of them, equally had less endogenous ugp gene expression level, suggesting that in these lines, some kind of regulation acted changing the gene expression. The transgenic tobacco lines were morphologicaly similar to the control plants when compared for total height, internode lenght, total leaf area, stem diameter and root dry mass. Alterations in transgenics tobacco plants, in relation to controls, checked by chemical analysis, were statisticaly more significants in the pith, where the monosaccharides and uronic acids contents increased. The few diferences founded in the xilematic tissue sugest that the plant, somehow, tends to change less the secondary cell wall composition than the primary wall. They also suggest that the carbohydrate metabolism can affect lignin content, thought it\'s sintetizaded in another metabolic pathway. The primary cell wall, evaluated using tobbaco plants pith and eucalypt leaves, showed an increase in pentosanas content, that wasn\'t observed analising tobacco seedlings.

O etanol celulósico a partir da palhada de cana pode elevar a produção do bioetanol, porém esta é normalmente decomposta no campo. A degradação da parede celular no campo não foi elucidada e compreender este processo auxiliará na produção de etanol celulósico. O objetivo deste trabalho foi caracterizar a degradação da palhada de cana de açúcar no campo durante um ano. Foi analisada a composição da parede celular por fracionamento e composição dos monossacarídeos. Na parede celular, observou-se redução de 26% no teor de celulose enquanto houve aumento de 13% na fração de hemiceluloses mais solúveis. Mudanças na composição dos monossacarídeos das frações mostraram que o arabinoxilano (AX) foi o primeiro polímero a ser solubilizado (após 3 meses) seguido dos <font face=\"Symbol\">b-glucanos e celulose (após 6 meses). Isto sugere que o AX é a hemicelulose mais exposta e sua solubilização permitiu a degradação da celulose após 6 meses. A partir dos dados obtidos, sugeriu-se a utilização de xilanases seguidas de glucanases numa possível ordem de enzimas para produção de etanol celulósico. / The sugarcane straw cellulosic ethanol can increase bioethanol production, but the straw is usually degraded in the field. However, the process that leads the cell wall disassembly under field conditions is unknown and understanding how this happens can improve cellulosic ethanol production. In the present work we aimed at studying how sugarcane straw is degraded in the field during a year. Cell wall composition was determined by fractioning and determination of monosaccharide composition. Results showed a decrease (ca.26%) in cellulose content and an increase of 13% in high solubility hemicelluloses fraction. Changes in monosaccharide composition showed that the first polymer to be solubilised is the arabinoxylan (AX) (after 3 months) followed by <font face=\"Symbol\">b-glucans and cellulose (after 6 months). This suggests that AX is the most exposed hemicelullose and its solubilisation allowed cellulose degradation after 6 months. Our data suggest the use of xylanases followed by glucanases as an enzyme order to be used in cellulosic ethanol production from sugarcane straw.

O Eucalyptus é o gênero mais importante para a indústria brasileira de papel e celulose. Eucalyptus grandis Hill ex. Maiden e seus híbridos são preferencialmente usados pela indústria devido ao rápido crescimento e alta produtividade volumétrica. Embora possua características adequadas à utilização comercial, vários estresses abióticos e bióticos influenciam sua produção. O IPGRI (International Plant Genetic Resources Institute) destaca a Puccinia psidii como sendo a maior ameaça para a cultura nos tempos atuais. A doença não co-evoluiu com o hospedeiro e por essa razão, torna o patógeno um elemento potencial a vencer as barreiras impostas pelo hospedeiro. O fungo ataca plantas jovens, incluindo mudas em viveiros, plantas em jardins clonais e plantações comercias com até 2 anos de idade. Com o objetivo de identificar proteínas diferencialmente expressas e avaliar as mudanças ocorridas na composição química da parede celular das folhas, o presente trabalho analisou o impacto da presença do fungo sobre os clones comerciais, resistentes (7) e suscetíveis (24), de eucalipto. Os clones de E. grandis, 7 e 24, previamente inoculados com uredósporos de P. psidii, foram utilizados para extração de proteínas após 24 horas de interação com o fungo. As análises foram realizadas com auxílio de SDS-PAGE de primeira e segunda dimensão, em gradiente de pH na faixa de 4-7, utilizando-se 750 µg de proteínas. As imagens dos géis, em triplicata, analisadas pelo programa (Image Master Elite v. 3.01), possibilitaram a identificação de 466 spots. A comparação entre os perfis eletroforéticos dos clones que foram analisados e os controles não inoculados, mostrou que o processo de infecção do fungo nas plantas induziu o aparecimento de 72 spots exclusivos para o clone 7 além de alterações do volume de outros 115 spots. Já para o clone 24, a exposição ao fungo promoveu o aparecimento de 22 spots exclusivos e alterações de outros 98. Os perfis eletroforéticos dos clones controle, que não foram expostos ao fungo, mostraram diferenças genéticas entre os clones 7 e 24. O clone resistente, apresentou grande concentração de spots na região entre 14 a 45 kDa. Já para o clone suscetível, os spots se concentraram na região entre 25 a 97 kDa. A avaliação do conteúdo de carboidratos e ácidos urônicos da parede celular mostrou alterações no conteúdo dos açúcares no material inoculado com P. psidii, após 24 horas, 6 e 12 dias de inoculação. Os teores de glicose observados para os clones 7 e 24, já após 24 horas da inoculação, mostraram-se bastante alterados, indicando que esse açúcar possui papel chave no processo de formação da parede celular e conseqüentemente no mecanismo de defesa vegetal. / Eucalyptus is the most important genus for the Brazilian pulp and paper industry. Eucalyptus grandis Hill ex. Maiden and hybrids are preferentially used by the industry due to its rapid growth and high volumetric productivity. Although they possess characteristics adequate for commercial use, various biotic and abiotic stresses influence production. IPGRI (International Plant Genetic Resources Institute) highlight Puccinia psidii as the largest current threat to the culture. The disease did not co-evolve with the host and for this reason has become the pathogen with most potential to overcome the barriers imposed by the host. The fungus attacks young plants, including saplings in nursery, clonal gardens and commercial plants up to 2 years-old. With the objectives of identifying the proteins differentially expressed and evaluate the changes occurring in the chemical composition of the cell walls in the leaves, the present work analyzed the impact of the presence of the fungus on the commercial eucalyptus clones, resistant (7) and susceptible (24). The E. grandis clones (7 and 24) were inoculated with P. psidii urideospores and proteins extracted after 24 hours interaction with the fungus. The analyses were carried out using a pH gradient (4-7) in the first and SDS-PAGE in the second dimension, loading 750 µg onto the gel. The gel images, in triplicate, were analyzed using the software Image Master Elite v. 3.01, allowing the identification of 466 spots. The electrophoretic profiles for each clone were analyzed and compared to the uninoculated controls, showing that the fungal infection process induced the appearance of 72 exclusive spots in clone 7 and an alteration in the volume of another 115 spots. In clone 24, exposure to the fungus induced the appearance of 22 exclusive spots and altered another 98. The electrophoretic profiles of the control clone, not exposed to the fungus, demonstrated genetic differences between the 7 and 24. The resistant clone (7) presented a large concentration of spots around 14 to 45 kDa. In contrast, the susceptible clone (24) presented a concentration of spots around 25 to 97 kDa. Evaluation of the carbohydrate and uronic acid content of the cell wall showed an alteration in the sugar content in the material exposed to P. psidii after 24 hour, 6 and 12 days after inoculation. The glucose levels observed for clones 7 and 24 were considerable altered 24 hours after inoculation, indicating that this sugar has a key role in cell wall formation and consequently in the plant defense mechanism.

As paredes celulares vegetais são estruturas essenciais para o crescimento e desenvolvimento das plantas. Além das suas diversas funções biológicas, os componentes polissacarídicos constituintes das paredes celulares (celulose, hemiceluloses e pectinas) são de vital importância como fonte natural de fibras para a nutrição humana e animal e são considerados os principais recursos renováveis do planeta, utilizados como matéria-prima para diversos processos industriais, por exemplo nos processos de produção de polpa celulósica. Todos esses fatores têm despertado grande interesse no estudo da composição e biossíntese das paredes celulares. A biossíntese dos seus polímeros se inicia no citoplasma das células, onde ocorre a formação dos precursores por uma rota metabólica complexa de biossíntese de açúcares-nucleotídeo. O entendimento da regulação dessa rota metabólica é fundamental para modular a dinâmica de biossíntese desses açúcares e assim tentar manipular as propriedades bioquímicas das paredes celulares. Nesse contexto, o presente projeto de pesquisa teve como objetivo avaliar o efeito da superexpressão do gene miox2 de Arabidopsis thaliana em plantas de Nicotiana tabacum. O produto desse gene é a enzima mio-inositol oxigenase (E.C. 1.13.99.1), cuja função é converter o mio-inositol em ácido D-glucurônico, composto central da rota de biossíntese de açúcares-nucleotídeo. Foram determinadas quatro isoformas tecido-específicas para o gene miox (miox1, miox2, miox4 e miox5) em Arabidopsis, sendo que a isoforma miox2 é a predominante em caules. Esse gene foi clonado em trabalhos anteriores realizados no laboratório e no presente trabalho, o cDNA do gene miox2 foi superexpresso em plantas de tabaco (Nicotiana tabacum) a fim de se avaliar o efeito da superexpressão na composição de carboidratos de parede celular secundária. As linhagens de plantas transgênicas obtidas, não mostraram diferenças visualmente perceptíveis em comparação aos controles, indicando ausência de alterações fisiológicas e morfológicas. Foram quantificados os monossacarídeos de paredes celulares secundárias (arabinose, ramnose, galactose, glicose, xilose, manose), os ácidos urônicos (ácido galacturônico e glucurônico) e as ligninas (solúvel e insolúvel), a partir de tecido xilemático e parênquima medular do caule. A ausência de modificações significativas nas proporções desses metabólitos, indica que as plantas exercem um estrito controle na regulação da biossíntese de paredes celulares secundárias de forma que a superexpressão do gene miox2 não provocou nenhuma alteração altamente significativa. Outros genes candidatos e os mecanismos envolvidos na sua regulação deverão ser testados quanto ao nível de transcrição, modificações pós-trancricionais e pós-traducionais a fim de entender a regulação do fluxo de carbono para a biossíntese de paredes celulares. / Cell-walls are essential structures for plant development and growth. Apart from its biological functions, the polyssacharides that make cell-walls (cellulose, hemicellulose and pectins) are the principal natural fibrous materials used for human and animal nutrition. They are also considered the most important renewable resource on earth and their use as industrial raw material is inevitable. An example is the use of wood in the production of pulp and paper. For all these reasons, the study of molecular composition and biosynthesis of plant cell-walls has been a matter of great interest for researchers over the past few years. Cell-wall polyssacharides biosynthesis begins at the cytoplasm, where a pool of UDP-glucose and other activated sugar nucleotide precursors are generated by multiple and complex interconvertion reactions. Understanding how cells control the metabolic pathways responsible for sugar nucleotide precursors synthesis, would be a primary requirement for manipulating them in an attempt to generate plants with improved properties for human use. In that context, tha aim of this research work was to analyze the effects of Arabidopsis thaliana miox2 gene overexpression in a plant model system (Nicotiana tabacum). The product of miox2 gene is myo-inositol oxygenase enzyme 2 (E.C.1.13.99.1) which converts D-glucuronic acid, an important sugar nucleotide precursor, from its substrate myo-inositol. Four isoforms of miox gene, with apparent tissue specific expression (miox1, miox2, miox4 and miox5) were already determined, but miox2 is the one primarily expressed in stems. Its cDNA was cloned from Arabidopsis thaliana in previous works and overexpressed in tobacco plants. Five normal transgenic lines were obtained, showing no phenotypically differences relative to the control line. This fact implied that miox2 overexpression did not alter any physiological nor morphological aspect of plant development. The cell-wall monossacharides (arabinose, rhamnose, galactose, glucose, xylose and mannose), uronic acids (galacturonic and glucuronic acid) and lignins (soluble and insoluble) from stem xylem and parenchymal tissue were quantified. The absence of major changes in any of the compounds measured for the transgenic lines indicated that they were able to adjust their level of carbohydrate composition. Plants seem to regulate the proportions of sugar nucleotide precursors through highly complex metabolic pathways that establish strong compensatory mechanisms. It will be necessary to study other candidate genes and some aspects of their regulation at transcriptional, postranscriptional and postransaltional level, as an attempt to understand the cell-wall carbohydrate flux.

A parede celular vegetal, estrutura essencial para as plantas, é extremamente importante para a economia humana, já que apresenta diversas utilidades, como por exemplo, fabricação de papel, fibras de vestuário, construção civil, entre outras. A maior parte da parede celular vegetal primária (aproximadamente 90%), é formada por polissacarídeos como celulose, hemiceluloses e pectinas. Os monossacarídeos, unidades formadoras dos polissacarídeos, são sintetizados, nas plantas, a partir de diferentes açúcares nucleotídeos, sendo que, o suprimento desses, pode afetar a biossíntese dos polissacarídeos da parede celular. Visando analisar o impacto da alteração do fluxo metabólico do carbono na composição da parede celular, o presente projeto de pesquisa teve como objetivo alterar a composição dos polissacarídeos da parede celular de Nicotiana tabcum, através da modulação da expressão do gene uxs, responsável pela codificação da enzima UDP-D-glucuronato descarboxilase (UDPGlcADC, EC 4.1.1.35) que converte UDP-D-glucuronato em UDP-D-xilose, importante açúcar nucleotídeo, precursor do monossacarídeo xilose. Para isso, após a clonagem do gene uxs de ervilha, foram obtidas plantas transgênicas de tabaco superexpressando esse gene. Diversas análises foram realizadas para determinação da composição química da parede celular primária e secundária dessas plantas. Pela análise de FTIR da parede celular primária, verificou-se que três linhagens transgênicas apresentaram espectrotipos consistentes, indicando uma redução na quantidade de pectinas e ligações ésteres carboxílica nessas linhagens transgênicas. Apesar de não terem sido detectadas alterações na proporção dos monossacarídeos ramnose, xilose, arabinose, manose e galactose, e na quantidade de celulose, na parede celular primária das plantas transgênicas, foram observadas diferenças na proporção de galactose não esterificada, nas linhagens que apresentaram espectrotipo. Com relação à parede celular secundária, observou-se que algumas linhagens transgênicas apresentaram maior concentração de lignina solúvel relacionada a uma redução no conteúdo de lignina insolúvel. / The plant cell wall is not only an essential structure for plants, but also an extremely important raw material in human economy. The plant cell wall has diverse utilities, for example, papermaking, textile fiber, civil construction. Polysaccharides, such as cellulose, hemicelluloses and pectins, are the major components of the primary plant cell wall (approximately 90%). These polysaccharides are formed by monosaccharides, which are synthesized in the plant from different nucleotide sugars. The suppliment of the nucleotide sugars can affect plant cell wall polysaccharides biosynthesis. Aiming at analyzing the impact of the alteration in the metabolic carbon flux on cell wall composition, the objective of this research project was to alterate the plant cell wall polysaccharides composition by the modulation of the uxs gene. This gene encodes the UDP-D-glucuronic acid decarboxylase enzyme (UDPGlcADC, EC 4.1.1.35) that promotes the conversion of UDP-D-glucuronic acid to UDP-D-xylose, an important sugar nucleotide precursor of xylose monosaccharide. To achieve this goal, the pea uxs gene was cloned and transgenic tobacco plants overexpressing this gene were obtained. Several analyses were performed to determinate the primary and secondary cell wall composition of those transgenic plants. The primary cell wall analysis by FTIR identified three transgenic lines that show different spectrotypes compared to wild type and those transgenic spectrotypes had the same features. The results indicate a reduction of pectin and ester carbonyl binding in the transgenic plants. No alterations were detected in the monosaccharide (rhamnose, xylose, arabinose, manose and galactose) proportions and the amount of cellulose in the primary cell wall of the transgenic plants. Nevertheless, differences in the proportion of unesterified galactose were observed in the same transgenic lines that showed spectrotypes. With regard to secondary cell wall, some transgenic lines showed an increase in soluble lignin which is related to a reduction in insoluble lignin.

Os elementos celulares que constituem o tecido xilemático de várias espécies vegetais são amplamente utilizados em diversos setores industriais, com inúmeras aplicações, como por exemplo, a geração de energia e produção de celulose e papel. A parede celular das células vegetais é formada basicamente por celulose, hemiceluloses e lignina. A formação dos polímeros de celulose e hemicelulose dependem exclusivamente do suprimento de precursores chamados de nucleotídeos-açúcares, tais como UDP-glicose, UDP-glucuronato, UDP-xilose, UDP-arabinose, UDP-manose e UDP-galactose. A biossíntese da parede celular é altamente regulada do ponto de vista metabólico, e envolve a participação de várias enzimas que catalisam uma série de reações. Estratégias para alterar o fluxo metabólico destes precursores, podem originar modificações na deposição dos polissacarídeos na parede celular. Em particular, para o setor de celulose e papel tal estratégia pode resultar em fibras com determinadas características, melhorando a qualidade da polpa celulósica ou do papel produzido. O UDP-glucuronato é um dos principais precursores de polissacarídeos hemicelulósicos da parede celular, sendo formado a partir de UDP-glucose pela ação da enzima UDP-glicose desidrogenase (EC. 1.1.1.22). Esta enzima é chave na regulação da biossíntese das pentoses e hexoses da parede celular de plantas superiores. Com o objetivo de modular a síntese dos polissacarídeos hemicelulósicos na parede celular, o presente trabalho analisou o impacto da superexpressão do gene ugdh em plantas transgênicas de tabaco. Foram realizadas análises da composição química da parede celular primária e secundária de folhas e caules, bem como avaliações morfológicas das fibras do tecido xilemático, e também cortes histológicos da região basal do caule. Da parede secundária do tecido xilemático determinou-se o conteúdo de lignina klason e solúvel, bem como a concentração dos carboidratos via HPAE-PAD. No tecido xilemático, todas as plantas transgênicas apresentaram aumento do conteúdo de xilose, embora não significativo. Juntamente, ocorreu um aumento de arabinose significativo em três linhagens transgênicas. Paralelamente, todas as plantas transgênicas tiveram redução do conteúdo de lignina klason, embora significativo em apenas uma linhagem. A relação hexoses/pentoses reduziu em todas as linhagens transgênicas, sendo significativa em três linhagens. As análises histológicas do caule mostraram que os transformantes apresentaram um aumento do tecido xilemático em relação às plantas controles. As análises morfológicas das fibras mostraram que todas as plantas transgênicas apresentaram reduções significativas no comprimento, em relação às plantas controles. No tecido foliar, o conteúdo de polissacarídeos da parede celular primária apresentou uma redução significativa em todas as plantas transgênicas. / The cellular elements that constitute the xylematic tissue of various plant species are widely used in diverse industrial sectors, with numerous applications, for example, the generation of energy and production of cellulose and paper. Plant cell walls are basically formed by cellulose, hemicellulose and lignin. The formation of cellulose and hemicellulose polymers depend exclusively on the supply of the precursors called nucleotide sugars, such as UDPglucose, UDP-glucuronate, UPD-xylose, UDP-arabinose, UDP-mannose and UDP-galactose. The biosynthesis of the cell wall is highly regulated from the metabolic point of view and involves the participation of various enzymes that catalyse a series of reactions. Strategies to alter the metabolic flux of these precursors could give rise to modifications in the deposition of polysaccharides in the cell wall. In particular, for the cellulose and paper sector these strategies could result in fibers with determined characteristics, improving the quality of the cellulose pulp or the paper produced. UDP-glucuronate is one of the principal precursors of the hemicellulose polysaccharides of the cell wall, which is formed from UDP-glucose by the action of UDPglucose dehydrogenase (EC1.1.1.22). This is a key enzyme in the regulation of the biosynthesis of the pentoses and hexoses in the cell walls of higher plants. With the objective of modulating the synthesis of the hemicellulose polysaccharides in the cell wall, the present study analysed the impact of the superexpression of the ugdh gene in transgenic tobacco plants. Chemical analyses were performed to determine the chemical composition of the primary and secondary cell walls of leaves and stems, as well as morphological evaluations of the fibers of the xylematic tissue and histological cuts through the base of the stem. The Klason and soluble lignin content as well as the carbohydrate concentrations (using HPAE-PAD) were determined in the secondary cell walls of the xylematic tissue. All of the transgenic plants showed an increase in xylose content, albeit not significant. A significant increase in arabinose content was observed in three transgenic lines. In parallel all the transgenic plants presented a reduction in Klason lignin, but only significant in one line. The ratio hexose/pentose was reduced in all transgenic lines, being significant in three. Histological analyses on the stem showed that the transformants presented an increase in the xylematic tissue when compared to the controls. The morphological analyses of the fibers showed that all the transgenic plants presented significant reductions in length when compared to the controls. In the leaf tissue, the polysaccharide content of the primary cell wall showed a significant reduction in all of the transgenic plants.

Apenas muito recentemente estratégias genômicas e pós-genômicas têm sido utilizadas em estudos de espécies arbóreas importantes na silvicultura. Nos países tropicais, a exemplo do Brasil, as espécies de eucalipto são especialmente importantes nos plantios comerciais principalmente destinados à indústria de papel e celulose. O eucalipto é caracterizado por elevadas taxas de crescimento e alta adaptabilidade resultante da interação de mecanismos moleculares e processos metabólicos ainda pouco conhecidos. Nesse sentido, o presente trabalho teve como objetivo principal o estabelecimento de perfis transcricionais comparativos para folhas e para o xilema em formação de árvores de Eucalyptus grandis. grandis. O uso do método SAGE permitiu analisar 5864 genes dos quais 2247 (38%) puderam ser identificados. Foram encontrados 464 genes diferencialmente expressos, sendo 47 exclusivamente expressos na região cambial e 64 nas folhas. Além disso, as estratégias adotadas na identificação tags-genes permitiram que as SAGE tags fossem eficientemente utilizadas na diferenciação de isoformas gênicas tecido-específicas e de localização celular específica. Genes relacionados à fotossíntese, fotorrespiração e destoxificação celular foram preferencialmente encontrados na biblioteca SAGE de folhas, enquanto genes relacionados à síntese da parede celular, organização do citoesqueleto e respiração, foram preferencialmente expressos na biblioteca SAGE de madeira. Os níveis de expressão dos transcritos sugeriram a ocorrência de possíveis mecanismos de controle transcricional comum para grupos de genes funcionalmente relacionados e foram também utilizados para sugestão de genes e processos que representam alvos potenciais para o melhoramento do eucalipto. / Recently genomic and post-genomic strategies have been used to study important tree species in planted forests. In the tropical countries, like Brazil, Eucalyptus species are especially important in commercial plantations destined for the paper and cellulose industry. Eucalyptus species are characterized by their high growth rates and great adaptability resulting from the interaction between molecular mechanisms and metabolic processes that are still uncharacterized. Thus, the main goal of this work was the comparison of the transcriptional profiles from leaves and the cambial region of Eucalyptus grandis trees. The use of SAGE allowed the evaluation of 5864 expressed tags of which 2247 (38%) could be identified. 464 differentially expressed tags were indicated, of which 47 were exclusively expressed in the cambial region library and 64 in the leaf library. Furthermore, the strategies used in the tag mapping process allowed an efficient use of the SAGE tags to distinguish gene isoforms with tissue-specific and/or specific cell localizations. Genes related to photosynthesis, photorespiration and cellular detoxification were preferentially found in the SAGE leaf library, while genes involved in cell wall biosynthesis, cytoskeletal organization and respiration were preferentially expressed in the developing xylem. Transcript expression levels suggested the presence of a common transcriptional control for a few functionally related genes, for example, some lignin related genes. Importantly, transcript expression levels were also used for the identification of target genes and processes potentially useful in future Eucalyptus breeding programs.