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Staphylococcus aureus ist einer der bedeutendsten Erreger boviner Mastitiden. Die Vielgestaltigkeit der Resistenzmuster und Virulenzfaktoren seiner Stämme macht ihn zu einem Problemkeim aus therapeutischer und prophylaktischer Sicht. Seine Fähigkeit zur Bildung hitzestabiler Enterotoxine verleiht ihm lebensmittelhygienische Relevanz. Mehrfachresistente Stämme stellen gefährliche Zoonose-Erreger dar. Ziel der durchgeführten Untersuchung war es daher, Aufschluss über Resistenzdeterminanten und Virulenzfaktoren der in Thüringer Milchviehherden vorkommenden Staphylococcus aureus zu erhalten, wobei eine Microarray-gestützte Genotypisierung zum Einsatz kam. Weiterhin sollte analysiert werden, ob der Genotyp der Isolate mit dem Phänotyp korreliert. In 34 Thüringer Milchviehherden wurde der gesamte Bestand der laktierenden Kühe zweimal auf Basis von Viertelgemelksproben bakteriologisch untersucht. Die Beurteilung der Kulturen erfolgte im Nativausstrich nach 48-stündiger Bebrütung und zusätzlich nach Voranreicherung in einer Glucose-Bouillon mit anschließender 24-stündiger Bebrütung. Staphylococcus aureus-positiv waren 1902 von insgesamt 81 567 Milchproben. Aus diesen wurden 189 für die Herden repräsentative Isolate ausgewählt und mittels Microarray-Technologie umfassend charakterisiert und klassifiziert. Zudem wurde der Phänotyp der Isolate auf Äskulin- und Columbia-Blutagar erfasst und das Resistenzverhalten mittels Agardiffusionstest ermittelt. Die 189 typisierten Staphylococcus aureus konnten elf verschiedenen klonalen Komplexen (CC) zugeordnet werden. Der Großteil der Isolate (80,4 %) zählte zu CC133, CC151 und CC479. Diese Isolate besaßen mit einer Ausnahme das Leukozidin-Gen lukF-P83/lukM. Die übrigen Isolate, die negativ auf lukF-P83/lukM getestet wurden, gehörten acht vergleichsweise sporadisch vorkommenden CC (CC7, CC9, CC20, CC45, CC50, CC97, CC101, CC398) an. In nur 0,7 % der zu den drei dominanten CC zählenden Isolate war das Beta-Laktamase-Gen blaZ vorhanden, während es bei 54,1 % der sporadisch vorkommenden CC detektiert wurde. Das Methicillin-Resistenzgen mecA wurde bei lediglich vier Isolaten (2,1 %) nachgewiesen, die alle CC398 angehörten. Sie verfügten neben Resistenzen gegenüber β-Laktam-Antibiotika über eine Tetrazyklin-Resistenz. Darüber hinaus wurde in einem Isolat das Makrolid/Lincosamid/Streptogramin-Resistenz vermittelnde vgaA und in einem Isolat das Aminoglykosid-Resistenz vermittelnde aacA-aphD detektiert. Humanmedizinisch relevante Enterotoxin-, Exfoliatin- oder PVL-Gene wurden in den vier Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus (MRSA) nicht gefunden. Im Agardiffusiontest zeigten diese Isolate eine Penicillin- und eine Tetrazyklin-Resistenz, jedoch keine Resistenz gegenüber Oxacillin, welches als MRSA-Marker gilt. Die Gene der klassischen, humanmedizinisch bedeutsamen Enterotoxine A, B und C waren bei 12,7 % der Isolate vorhanden, wohingegen die Gene von Enterotoxin D und E nicht vorkamen. Insgesamt fanden sich Enterotoxin-Gene bei 78,3 % der typisierten Staphylococcus aureus, wobei die für Enterotoxin G, I, M, N, O und U kodierenden dominierten. Phänotypisch unterschieden sich die CC bezüglich Hämolyse und Pigmentierung, wobei alle CC398-Isolate als eierschalenfarben mit doppelzoniger Hämolyse auftraten. Hämolysin-Gene besaßen alle Isolate, ein Zusammenhang zu den phänotypisch ausgeprägten Hämolysezonen bestand jedoch nicht. Die vorliegende Untersuchung zeigt, dass in Thüringer Milchviehbeständen zwei epidemiologisch unterschiedliche Varianten von Staphylococcus aureus existieren. Die in dieser Studie dominierenden, lukF-P83/lukM-positiven CC133, CC151 und CC479 verursachten einen Großteil der Infektionen und gelten als auf das Euter beschränkte Erreger. Sie können daher als „euterassoziiert“ angesehen werden. Dagegen verfügten die anderen in dieser Untersuchung detektierten, lukF-P83/lukM-negativen CC über Charakteristika „umweltassoziierter“ Keime. Sie besitzen ein breites Wirtsspektrum und treten auch außerhalb des bovinen Euters in der Umgebung der Kühe auf. Die Prüfung auf lukF-P83/lukM erwies sich als zuverlässige Methode, zwischen beiden epidemiologischen Varianten zu unterscheiden. Folglich lässt die An- oder Abwesenheit dieser Genkombination einen Rückschluss auf die in der Herde verbreiteten CC zu. Das ermöglicht die Berücksichtigung der CC-spezifischen Erreger-Eigenschaften bei der Etablierung von Sanierungsprogrammen, die somit effizient gestaltet werden können. MRSA waren in Thüringer Milchviehbeständen wenig verbreitet und nur schwach mit Resistenzdeterminanten und humanmedizinisch bedeutsamen Pathogenitätsfaktoren ausgestattet. Diese MRSA aus Rohmilchproben sind daher nicht mit multiresistenten Isolaten aus der Humanmedizin zu vergleichen. Gene für humanmedizinisch relevante Enterotoxine, für die ein Zusammenhang mit Lebensmittelintoxikationen belegt ist, wurden selten, andere Enterotoxin-Gene jedoch häufig nachgewiesen.

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[ES] El complejo de especies de Ralstonia solanacearum es el responsable de la marchitez bacteriana, una enfermedad que afecta en todo el mundo a cultivos y plantas ornamentales de gran importancia económica. El filotipo (ft) II raza 3 biovar (bv) 2 produce la podredumbre parda de la patata y la marchitez bacteriana de las solanáceas en climas templados, y se ha introducido recientemente en algunas áreas de la Unión Europea y de Estados Unidos, donde este patógeno se considera un organismo de cuarentena. La presencia de R. solanacearum ft II raza 3 bv 2 en estas zonas ha hecho surgir ciertos interrogantes sobre la biología y la patogenicidad de esta bacteria, algunos de los cuales se han abordado en este trabajo. De esta manera, se han evaluado aspectos del comportamiento, la capacidad de supervivencia y la capacidad para la inducción de la enfermedad, de cepas de R. solanacearum ft II raza 3 bv 2 de origen europeo en diferentes especies vegetales y diversas muestras de agua medioambiental. El comportamiento en cuanto a la colonización de R. solanacearum ft II raza 3 bv 2 in planta ha permitido realizar una clasificación en huéspedes susceptibles o tolerantes y en no huéspedes, en base a la localización histológica del patógeno y su aislamiento. Se ha observado que los huéspedes susceptibles y tolerantes eran intensamente invadidos a nivel del xilema de las raíces, pero densamente o bien débilmente colonizados, respectivamente, a nivel del xilema del tallo. Ninguno de ellos debe ser considerado como candidato para la rotación de cultivos en suelos contaminados. Por otra parte, se ha observado que en los no huéspedes no se producía la invasión a nivel del xilema de la planta, aunque podría haber presencia esporádica del patógeno en el córtex de las raíces o en la superficie y, por lo tanto, algunos podrían actuar como reservorios. Los no huéspedes podrían seleccionarse para los sistemas de rotación tras su evaluación en condiciones de campo. La capacidad de supervivencia de R. solanacearum ft II raza 3 bv 2 en microcosmos de agua medioambiental se ha visto influida por factores tanto abióticos como bióticos. El patógeno ha mostrado una resistencia considerable frente a la exposición a la oligotrofía como único factor de stress. Así, desarrolló varias estrategias que le permitieron sobrevivir en microcosmos de agua medioambiental durante cuatro años bajo condiciones de limitación de nutrientes, manteniendo la capacidad de inducir la enfermedad en el huésped incluso a través de riego. Las estrategias adaptativas para superar la oligotrofía observadas durante este largo periodo han sido la respuesta de supervivencia frente a la privación de nutrientes, la entrada en el estado viable no cultivable, una transformación progresiva de las formas bacilares típicas en cocoides de reducido tamaño, los fenómenos de filamentación y gemación, y la agregación. El patógeno también ha mostrado estrategias eficientes cuando ha sido expuesto a diferentes temperaturas simultaneamente a las condiciones de escasez de nutrientes. De esta manera, a 4°C el frío indujo la entrada en un estado viable no cultivable que fue dependiente del contenido en nutrientes del agua, mientras que a 14°C y 24°C las respuestas de supervivencia frente a la privación de nutrientes, aunque aparentemente similares, revelaron un efecto de la temperatura en la formación de los cocoides. Por otra parte, la persistencia del patógeno se redujo de manera significativa en microcosmos de agua medioambiental por la actividad predadora, competitiva o lítica de los protozoos, las bacterias y/o los bacteriófagos presentes en el agua. Entre todos ellos, se demostró que los fagos líticos fueron los responsables principales del descenso en las poblaciones de R. solanacearum, si bien los protozoos y las otras bacterias contribuyeron en cierta medida. El efecto fue más apreciable a 24°C que a 14°C debido a que las interacciones bióticas fueron más lentas a la temperatura más baja. Esta bacteria ha mostrado una gran capacidad de adaptación, consiguiendo sobrevivir y mantener su poder patógeno en prácticamente todas las condiciones ensayadas. La finalidad de este trabajo ha sido contribuir al progreso del conocimiento de las interacciones entre R. solanacearum ft II raza 3 bv 2 y sus ambientes naturales, para mejorar las estrategias preventivas tanto de la diseminación del patógeno como de la propagación de la marchitez bacteriana en dichos hábitats. / [EN] The Ralstonia solanacearum species complex causes bacterial wilt, a plant disease affecting economically important crops and ornamentals worldwide. The phylotype (ph) II race 3 biovar (bv) 2 produces potato brown rot and bacterial wilt in solanaceous plants in temperate climates and has recently been introduced to several areas of the European Union and the USA, where the pathogen has a quarantine status. Presence of R. solanacearum ph II race 3 bv 2 in these zones raised questions on biological and phytopathological aspects of this bacterium, some of them being addressed in this work. Thus behaviour, ability for survival and disease inducing capacity of European R. solanacearum ph II race 3 bv 2 have been assessed in a range of different plant species and diverse surface run-off water samples. Behaviour of R. solanacearum ph II race 3 bv 2 in planta has led to a classification in susceptible or tolerant hosts and non-hosts, based on the pathogen histological localization and isolation. Susceptible and tolerant hosts were highly invaded in root xylem but, heavily or weakly colonized respectively in stem xylem. They are to be avoided as candidates for crop rotation. Non-hosts were not invaded in plant xylem but, occasional presence of the pathogen in root cortex or on surface might occur and so, some of them might act as reservoirs. They could be selected for crop rotation systems after being carefully tested in open field conditions. Ability for survival of R. solanacearum ph II race 3 bv 2 in environmental water microcosms has been influenced by abiotic and biotic factors. When faced to oligotrophy as the only stressing factor the pathogen displayed a considerable endurance. It resorted to a number of survival strategies which enabled it to survive in environmental water microcosms over four years under starvation, retaining disease inducing capacity in the host even by watering. Adaptations to overcome nutrient limitation during the long period were starvation-survival responses, the entrance into a viable but non-culturable state, progressive transformation from the typical bacillar shape into coccoid forms reduced in size, filamentation and budding phenomena and aggregation. Survival strategies were also successfully exhibited by the pathogen when exposed to environmental temperatures simultaneously to nutrient scarcity conditions. Thus, at 4°C a viable but non-culturable state dependent on water nutrient contents was cold-induced, whilst at 14°C and 24°C apparently similar starvation-survival responses revealed a distinct effect of temperature on coccoid formation. On the other hand, indigenous freshwater protozoa, bacteria and/or phages with predatory, competitive or lytic activity reduced significantly pathogen persistence. Among them, lytic bacteriophages were the main responsible for the decrease in R. solanacearum populations, although protozoa and other bacteria also contributed. The effect was more appreciable at 24°C than at 14°C because of slower biotic interactions at the lower temperature. The pathogen was able to adapt itself, succeeding in surviving and keeping pathogenic in almost all condition. This work intends to contribute to the progress in the knowledge of the interactions between R. solanacearum ph II race 3 bv 2 and natural environments, which may allow to improve the strategies to prevent pathogen dissemination and bacterial wilt spread in natural settings. / [FR] Le complexe d'espèces de Ralstonia solanacearum est l'agent causal du flétrissement bactérien, une maladie qui affecte des cultures et des plantes ornementales de grande importance économique dans le monde entier. Le phylotype (phyl) II race 3 biovar (bv) 2 produit la pourriture brune de la pomme de terre et d’une manière générale le flétrissement bactérien des Solanacées dans les climats tempérés. Ce phylotype II a récemment été introduit dans des certaines régions de l'Union Européenne et des États-Unis, où cette bactérie est considérée comme un pathogène de quarantaine. La présence de R. solanacearum phyl II race 3 bv 2 dans ces régions a soulevé quelques questions au sujet de sa biologie et de son pouvoir pathogène, questions qui ont été abordées dans ce travail. Nous avons notamment évalué, chez R. solanacearum phyl II race 3 bv 2 d'origine européenne, l'aptitude à survivre dans divers échantillons de l'eau environnementale de surface et la capacité à induire la maladie dans des différentes espèces de plantes cultivées. Notre étude de la capacité de colonisation de R. solanacearum phyl II race 3 bv 2 in planta a permis une classification en hôtes sensibles ou tolérants et non hôtes sur la base de la localisation histologique de l'agent pathogène et de son isolement in planta. Il a été noté que les hôtes sensibles et tolérants sont intensément envahis à niveau du xylème des racines, mais fortement ou faiblement colonisés à niveau du xylème de la tige chez les plantes sensibles ou tolérantes respectivement. Aucune de ces plantes ne doit être recommandée comme candidat dans une rotation culturale. En outre, nous avons noté que le xylème des plantes non hôtes n’est pas envahi, bien que l’on puisse noter la présence sporadique de l'agent pathogène dans le cortex des racines ou sur la surface racinaire. Cela signifie que certaines plantes non hôtes pourraient potentiellement être des réservoirs d’inoculum latent. En conséquence les plantes non hôtes qui pourraient être recommandées dans des systèmes de rotation culturale doivent être évaluées non seulement au laboratoire mais aussi au champ dans des conditions naturelles. Nous avons montré que la capacité de survie de R. solanacearum phyl II race 3 bv 2 dans des microcosmes de l'eau environnementale, préalablement filtrée ou autoclavée, est influencée par des facteurs abiotiques et biotiques. L'agent pathogène fait preuve d'une résistance considérable quand il est exposé à l'oligotrophie comme seul facteur de stress. Nous avons mis en évidence différentes stratégies utilisées par cette bactérie pour survivre plus de quatre ans dans des conditions de limitation des éléments nutritifs dans des microcosmes de l'eau environnementale tout en maintenant sa capacité d'induction de la maladie chez un hôte sensible à la suite de sa dissémination par irrigation. Les adaptations utilisées par cette bactérie pour surmonter l'oligotrophie au cours de cette longue période ont été l'entrée dans l'état viable non cultivable, une transformation progressive des typiques formes bacillaires vers des formes coccoïdes de petite taille, des phénomènes de filamentation et de bourgeonnement et d'agrégation. L'agent pathogène a également utilisé des stratégies efficaces quand il a été exposé à des différentes températures de l'environnement en même temps qu'à des conditions de limitation des éléments nutritifs. Ainsi à 4°C le froid a entraîné un état viable non cultivable qui a été dépendant de la teneur en éléments nutritifs de l'eau. Par contre à 14°C et 24°C les réponses de survie face à la privation des éléments nutritifs ont induit la formation de formes coccoïdes. En outre, la persistance de l'agent pathogène a été considérablement réduite dans des microcosmes de l'eau environnementale par l'activité prédatrice, compétitive ou lytique des protozoaires, des bactéries et/ou des bactériophages qui étaient contenus dans de l'eau. Notamment, il a été constaté que les phages lytiques sont les principaux responsables de la baisse des populations de R. solanacearum, bien que les protozoaires et d'autres bactéries aient également contribués dans une certaine mesure. L'effet a été plus sensible à 24°C qu'à 14°C en raison d'interactions biotiques plus lentes aux températures plus basses. En conclusion cette bactérie a démontré une grande capacité pour s'adapter, survivre et de maintenir son pouvoir pathogène dans pratiquement toutes les conditions couramment rencontrées dans les conditions naturelles. Le but de ce travail a été de contribuer à l'avancement de la connaissance des interactions entre R. solanacearum phyl II race 3 bv 2 et les milieux aquatiques naturels ou les plantes hôtes potentielles, dans l’espoir de développer les meilleures stratégies pour empêcher la propagation de l'agent pathogène et donc du flétrissement bactérien dans ces environnements. / [CA] El complex d'espècies de Ralstonia solanacearum és l'agent causal del pansiment bacterià, una malaltia vegetal que afecta a tot el món a cultius i plantes ornamentals de gran importància econòmica. El filotipo (fil) II raça 3 biovar (bv) 2 produeix la podridura marró de la patata i el pansiment bacterià en plantes solanàcies de climes temperats, i s'ha introduït recentment en algunes àrees de la Unió Europea i dels Estats Units, on aquest patogen es considera de quarantena. La presència de R. solanacearum fil II raça 3 bv 2 en aquestes zones ha fet sorgir certs interrogants sobre qüestions biològiques i fitopatològiques d'aquest bacteri, algunes de les quals s'han abordat en aquest treball. D'aquesta manera s'han valorat aspectes del comportament, la capacitat de supervivència i la capacitat per a la inducció de la malaltia, de R. solanacearum fil II raça 3 bv 2 de procedència europea en diferents espècies vegetals i diverses mostres d'aigua d'escorrentia superficial. El comportament pel que fa a la colonització de R. solanacearum fil II raça 3 bv 2 in planta ha proporcionat una classificació en hostes susceptibles o tolerants i en no hostes, en base a la localització histològica del patogen i el seu aïllament. S'observà que els hostes susceptibles i tolerants eren intensament envaïts a nivell del xilema de les arrels, però densament o bé feblement colonitzats respectivament a nivell del xilema de la tija. Cap d'ells ha de ser considerat com a candidat per a la rotació cultural. D'altra banda, es va observar que els no hostes no eren envaïts en el xilema de la planta, encara que podria haver presència esporàdica del patogen en el còrtex de les arrels o a la surperfície i, per tant, alguns podrien actuar com a reservoris. Els no hostes podrien ser seleccionats per als sistemes de rotació cultural després d'haver estat avaluats en condicions de camp. La capacitat de supervivència de R. solanacearum fil II raça 3 bv 2 en microcosmos d'aigua mediambiental s'ha vist influïda per factors abiòtics i biòtics. El patogen ha mostrat una resistència considerable quan ha estat exposat a l'oligotrofia com a únic factor d'estrès. Així, va recórrer a diverses estratègies que li van permetre sobreviure en microcosmos d'aigua mediambiental durant quatre anys sota condicions de limitació de nutrients, mantenint la capacitat per a la inducció de la malaltia en l'hoste fins i tot a través de reg. Les adaptacions per superar l'oligotrofia que s'han observat durant aquest llarg període han estat respostes de supervivència front a la privació de nutrients, l'entrada en l'estat viable no cultivable, una transformació progressiva de les típiques formes bacilars a cocoids de reduït tamany, els fenòmens de filamentació i gemmació, i l'agregació. El patogen també ha mostrat estratègies eficients quan ha estat exposat a diferents temperatures mediambientals simultàneament a les condicions d'escassetat de nutrients. D'aquesta manera, a 4°C el fred va induir un estat viable no cultivable que va ser dependent del contingut en nutrients de l'aigua, mentre que a 14°C i 24°C les respostes de supervivència front a la privació de nutrients, encara que aparentment similars, van revelar un efecte de la temperatura a la formació dels cocoids. D'altra banda, la persistència del patogen s'ha vist significativament reduïda en microcosmos d'aigua mediambiental per l'activitat predadora, competitiva o lítica dels protozous, els bacteris i/o els bacteriòfags que contenia l'aigua. Entre tots ells, es va determinar que els fags lítics eren els responsables principals del descens en les poblacions de R. solanacearum, si bé els protozous i els altres bacteris van contribuir en certa mesura. L'efecte va ser més apreciable a 24°C que a 14°C degut a que les interaccions biòtiques van ser més lentes a la temperatura més baixa. Aquest bacteri ha mostrat una gran capacitat d'adaptació, aconseguint sobreviure i mantenir el seu poder patogènic en pràcticament totes les condicions. La finalitat d'aquest treball és contribuir al progrés del coneixement de les interaccions entre R. solanacearum fil II raça 3 bv 2 i els seus ambients naturals, el que pot desenvolupar una millora de les estratègies per a la prevenció tant de la disseminació del patogen com de la propagació del pansiment bacterià en aquests ambients. / B. Álvarez specially thanks the Marie Curie Foundation for a Marie Curie Fellowship at the IFR40 in Toulouse (France) and the Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias for a predoctoral grant. This work has been funded by the European contract QLK3-CT-2000-01598 acronym “Potatocontrol” and FAIR 5-CT97-3632 of the European Union, FD 1997-2279 of the Ministerio de Educación y Ciencia of Spain and GV05/214 of the Generalitat Valenciana. / Álvarez Ortega, MB. (2009). Biology of Ralstonia Solanacearum Phylotype II in Host and Non-Host Environments [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/191532

The objective of this research was to investigate the occurrence of mycoflora in rice plants and rice seeds in South Africa and their negative impact. A total of six species of Fusarium were isolated from diseased rice plants and rice seeds and identified as F. anthophilum, F. chlamydosporum, F. compactum, F. equiseti, F. fujikuroi and F. semitectum. In the translation elongation factor data set, Fusarium equiseti isolates grouped together within the F. incarnatum - equiseti Species Complex (FIESC). The isolates from rice clustered together in a single clade with the F. equiseti and F. incarnatum isolates forming two separate sub-clades.The isolates of F. equiseti present a new phylogenetically distinct species in FIESC. In the pathogenicity tests, isolates of both F. anthophilum and F. fujikuroi caused bakanae disease to rice plants. Fifty four rice cultivars and lines were tested by the standardized test tube inoculation method for resistance and susceptibility against bakanae isolate of F. anthophilum and the bakanae isolate of F. fujikuroi. None of the rice cultivars and lines was found to be resistant to bakanae isolates of Fusarium spp. The fungicide, benomyl was found to be most effective as a seed treatment for controlling bakanae disease of rice due to isolates of both F. anthophilum and F. fujikuroi. Thiram was found to be the least effective fungicide for controlling bakanae disease of rice caused by isolates of both the Fusarium spp. Apart from Fusarium species, other fungi that were also isolated from diseased rice plants and rice seeds were identified as Alternaria alternata, Alternaria longipes, Cochliobolus miyabeanus, Nigrospora sphaerica, Phoma eupyrena, Phoma jolyana, Phoma sorghina and Pithomyces sp. In mycotoxin tests, the isolates of both F. anthophilum and F. fujikuroi produced moniliformin. None of the isolates of F. anthophilum and F. fujikuroi produced fumonisins. This research is important as it identifies many fungal species in rice plants and seeds in South Africa for the first time. Currently, there is very little literature that makes reference to such findings under South African conditions. In addition, this investigation unravels previously unknown information on the resistance of rice to bakanese disease. Finally, information is provided on the effectiveness of commonly used fungicides (benomyl and thiram) to control rice diseases. This knowledge is crucial information that is useful to plant pathologists, the farming community and the scientists that are involved in strategies of fighting or reducing rice diseases so as to help contribute to food security. / Environmental Sciences / D. Phil. (Environmental Science)

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