Made available in DSpace on 2015-12-06T22:54:32Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Neste estudo, 151 isolados brasileiros de Sporothrix schenckii foram caracterizados quanto as suas características fenotípicas e genotípicas. Quanto às características fenotípicas, a maioria dos isolados apresentou conídios ovais, sendo que os de origem animal são maiores que os de origem humana (animal: 2,96 ± 1,07 versus forma linfocutânea: 2,37 ± 0,43; forma fixa: 2,33 ± 0,53). Os isolados provenientes da região Norte do Brasil são os mais termotolerantes e os isolados do Nordeste são os mais termossensíveis. Os isolados de origem animal são mais tolerantes à temperatura quando comparados com isolados obtidos de pacientes. Os isolados brasileiros apresentaram grande variabilidade genética quando avaliados por RAPD. Por Southern Blot, utilizando a enzima APA I para o estudo do polimorfismo das regiões ITS, três genótipos foram obtidos. Não houve correlação entre o perfil obtido por RAPD ou Southern Blot com a origem clínica ou geográfica dos isolados. A secreção de proteínas/glicoproteínas é variável entre os isolados, sofrendo influência direta do meio de cultura. Os isolados brasileiros avaliados são produtores das enzimas DNAse e urease, 15,78% produzem gelatinase, 26,31% produzem proteinase e 21,05% produzem caseinase. Todos os isolados avaliados toleram pressão osmótica de 16,6% de glicerol, 89,47% toleram 20% e todos são inibidos a 23% e 28,5 % de glicerol. Todos os isolados avaliados toleram pressão salina de 6% e 8%; 42,10% toleram pressão de 9% e 10% de sal e todos são inibidos a 12% de sal. Todos os isolados avaliados crescem na faixa de pH de 2,2 a 12,5. A patogenia e virulência são variáveis entre os isolados, podendo estar relacionada ao genótipo do isolado. Diferentes proteínas são reconhecidas pelos soros dos camundongos infectados, sendo a molécula de 60 kDa, a mais reconhecida neste sistema. Em relação à esporotricose humana, as moléculas de 70 kDa e 38 kDa são comumente reconhecidas por soros de pacientes com esporotricose fixa e linfocutânea. O antígeno bruto do isolado Ss 118 e a fração SsCBF são eficientes para diagnóstico da esporotricose felina através da técnica de ELISA. A fração SsCBF é capaz de elicitar resposta imune do tipo HTT em camundongos experimentalmente infectados. Em geral, os resultados indicam que os isolados brasileiros são heterogêneos, apresentando características genéticas e fenotípicas individuais, independentes de sua origem. Somente a área conidial e a tolerância a temperatura foram características fenotípicas relacionadas à origem. / In this study, we analyzed 151 Brazilian S. schenckii isolates by phenotyping and genotyping aspects. About phenotyping aspects, most of isolates showed oval conidia and the mean conidial area of S. schenckii animal isolates was greater than clinical isolates (animal: 2.96 ± 1.07 versus lymphocutaneous form: 2.37 ± 0.43; fixed form: 2.33 ± 0.53). Isolates from the Northeast region exhibited the lowest thermotolerance and the Northern isolates exhibited the highest thermotolerance. Animal isolates are better thermotolerants than clinical isolates. The Brazilian isolates showed great genetic diversity when analyzed by RAPD. By Southern blot using the endonuclease APA I to study polymorphism of ITS regions, three genotypes were obtained. There was no association between RAPD and Southern profiles with clinical forms origin or geographic origin. The protein/glycoprotein secretion was variable among isolates and was directly influenced by the medium composition. All Brazilian isolates studied produced DNAse and urease exoenzymes, 15.78% produced gelatinase, 26.31% produced proteinase and 21.05% produced caseinase. All analyzed isolates grew at 16,6% of glycerol, 89,47% grew at 20% of glycerol and all of them were inhibited at 23% and 28,5 % of glycerol. All analyzed isolates grew at 6% and 8% of NaCl, 42.10% grew at 9% and 10% of NaCl and all of them were inhibited at 12% of NaCl. All of them were able to grow at pH 2.2 to 12.5. The pathogenicity and virulence were variable among isolates and it can be related to the genotype. Different proteins were recognized by sera of infected mice and the 60 kDa molecule was the most one recognized in murine system. In relation to human sporotrichosis, 70 kDa and 38 kDa molecules were common recognized by sera from patients with fixed and lymphocutaneous sporotrichosis. The crude exoantigen of Ss 118 isolate and the SsCBF fraction are able to be used in the diagnosis of feline sporotrichosis by ELISA. The SsCBF fraction is able to elicit DTH immune response in infected mice. In general, our results indicate that Brazilian isolates are heterogeneous, which present individual phenotyping and genotyping characteristics, independent of origin. Only the conidial area and thermotolerance were related to origin. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Orientador: Antonio Batista Filho / Banca: Carlos Frederico Wilcken / Banca: José Eduardo Marcondes Almeida / Resumo: O trabalho foi conduzido com o objetivo de avaliar a patogenicidade dos fungos Beauveria bassiana (isolado IBCB 66), Metarhizium anisopliae (isolado IBCB 425) e Lecanicillium lecanii (isolado JAB 02) sobre o psilídeo da goiabeira Triozoida sp. (HEMIPTERA: PSYLLIDAE) e a compatibilidade destes isolados com agrotóxicos. Os psilídeos, provenientes do campo, foram transferidos para ramos de goiabeira, contidos em tubos de PVC cuja extremidade inferior estava apoiada em placas de Petri com papel filtro umedecido. Cada ramo de goiaba foi pulverizado com 20mL das seguintes concentrações do patógeno: 5 OE 106, 1 OE 107, 5 OE 107, 1 OE 108 e 5 OE 108 conídios/mL, mais uma testemunha (água esterilizada). A partir das porcentagens de mortalidade de Triozoida sp., que variaram entre 26 e 77% para B. bassiana, 26 e 43% para M. anisopliae e 74 e 90% para L. lecanii, foi determinada a CL50 de 3,02 OE 107, 3,43 OE 1011 e 1,53 OE 107, para as três espécies respectivamente. A compatibilidade em laboratório foi observada incorporando-se os agrotóxicos ao meio de cultura BDA que, após a solidificação, foi inoculado com os fungos em três pontos eqüidistantes da placa de Petri, a qual foi mantida em câmara tipo B.O.D. por um período de 15 dias. Após este período, foram avaliados o crescimento vegetativo, esporulação, viabilidade e virulência dos entomopatógenos. Em condições de semi-campo, preparações dos produtos químicos e dos entomopatógenos foram pulverizadas em mudas de goiaba de três diferentes formas, a saber: a) primeiramente os produtos químicos e depois o fungo; b) primeiro o fungo e posteriormente o produto químico e c) os dois simultaneamente. 2 Após a aplicação, três folhas de cada ramo foram coletadas e lavadas obtendo-se uma suspensão que foi plaqueada em BDA para avaliação da esporulação, viabilidade e virulência dos conídios dos fungos. Observou-se... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo). / Abstract: This study was carried out to evaluate the pathogenicity of the fungi Beauveria bassiana (IBCB 66 isolate), Metarhizium anisopliae (IBCB 425 isolate) and Lecanicillium lecanii (JAB 02 isolate) on the guava psyllid Triozoida sp. and their compatibility with agrochemical products. The psyllids were transferred to guava branches, inside a plastic tube hold between Petri dishes containing a wet filter paper. The insects were sprayed with 20 mL of dosages containing 5 OE 106, 1 OE 107, 5 OE 107, 1 OE 108 e 5 OE 108 conidia/mL, for the control, sterilized water was sprayed on. The mortality rates of Triozoida sp., ranged from 26 to 77% for B. bassiana, 26 to 43% for M. anisopliae and 74 to 90% for L. lecanii. The LC50 were 3,02 OE 107, 3,43 OE 1011 and 1,53 OE 107, respectively. The compatibility to agrochemicals was verified by adding the products to the PDA medium. After solidification, the medium was inoculated with each fungus in three different points of the Petri dish, which were maintained in acclimatized chamber BOD for a 15 days period. After this period, the evaluated parameters were the vegetative growth, sporulation, viability and virulence of the entomopathogens. In semi-field conditions, the chemical products mixed with the fungi were sprayed on guava plants at three different ways: a) the fungi were sprayed on after the pulverization of the chemical products; b) chemical products were sprayed on after the pulverization of the fungi; c) chemical products and fungi were sprayed on all together. Subsequently, three leaves of each treatment were collected and washed to obtain a suspension that were inoculated on PDA medium to evaluate the sporulation, viability and virulence of the fungus. In laboratory conditions, most of the fungicides and insecticides was classified as toxic or very toxic for the 4 three fungi evaluated. In semi-field conditions, a large variation of conidia... (Complete abstract, click electronic address below). / Mestre

Resumo: O cancro cítrico está entre as principais doenças que afetam a produção de laranjas no Brasil e é causado pela bactéria fitopatogênica gram-negativa Xanthomonas citri subsp. citri (Xac). O presente trabalho teve por objetivo analisar a expressão diferencial de proteínas secretadas pela bactéria selvagem e por um mutante (02H02) assintomático, que teve a proteína HrpB4, que participa de seu sistema de secreção tipo III (SSTT) inativada, em condição de cultivo em meio rico CN e em meio XAM1 indutor de hipersensibilidade e patogenicidade (genes hrp). As proteínas secretadas em meio de cultura foram extraídas pela ação do ácido tricloroacético (TCA) e identificadas através de espectrometria de massas. Tais análises identificaram 55 proteínas diferentes secretadas em ambos os meios de cultura, tanto para Xac quanto para 02H02, de modo que 13 destas proteínas são comuns entre a Xac e seu mutante cultivados em XAM1 e 14 são exclusivas para Xac cultivada em XAM1, as quais deixaram de ser secretadas no 02H02. Proteínas relacionadas aos genes reguladores do SSTT foram detectadas em condição infectante para ambas as bactérias, demonstrando a eficácia do meio de cultura XAM1 em induzir Hrp. Foi observado que diversas proteínas secretadas pelo sistema de secreção tipo II (SSTD) em condição infectante para Xac e seu mutante possuem um papel ativo na degradação das paredes celulares do hospedeiro e podem ser reguladas por proteínas controladoras do SSTT. Fatores de sinalização difusíveis produzidos por Xac aparentemente sofreram alteração em sua secreção no mutante devido à inativação do pilus do SSTT, demonstrando a relação dessa molécula com o SSTT. A não detecção de proteínas secretadas diretamente pelo SSTT denota que as mesmas podem estar sendo secretadas no interior de vesículas lipídicas de membrana externa, assim como ocorre em Xanthomonas campestris / Abstract: Citrus canker is among the major diseases which affect citrus production in Brazil and is caused by the gram-negative phytopathogenic bacterium Xanthomonas citri subsp. citri (Xac). This work aimed to analyze the differential expression of secreted proteins by the wild bacterium and by an asymptomatic mutant (02H02), lacking the type III secretion system (TTSS) protein HrpB4, in rich cultivation medium NB and in the hrp inducing medium XAM1. The proteins secreted in all culture media have been extracted by trichloroacetic acid based protocols (TCA) and identified using mass spectrometry. The analysis identified 55 different proteins secreted in both culture medium for Xac and 02H02, of which 13 are common among Xac and its mutant cultivated in XAM1 and 14 proteins are exclusively secreted by Xac cultivated in XAM1. Proteins related to the TTSS regulatory genes have been detected in infecting condition in both bacteria, showing the effectiveness of XAM1 hrp inducing medium. It has been observed that several type II secretion system's secreted proteins showed an active role in host cell wall degradation and may be regulated by type III secretion system's proteins in Xac and 02H02 in infecting condition. Diffusible signal factors produced by wild Xac apparently suffered an altered secretion in the mutant due the inactivation of the type three secretion system's pilus, showing the relationship of this molecule with this secretion system. The lack of detection of proteins secreted by the TTSS denote that these proteins may be secreted in the interior of outer membrane lipid vesicles, just like it was verified in Xanthomonas campestris / Orientador: Jesus Aparecido Ferro / Coorientador: Julio Cezar Franco de Oliveira / Banca: Maria Teresa Marques Novo / Banca: Leandro Márcio Moreira / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:09Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-11-05Bitstream added on 2014-06-13T20:33:53Z : No. of bitstreams: 1 ferreira_rm_me_jabo.pdf: 510263 bytes, checksum: 543073ee3d6f55d77bb1607889dc966f (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O cancro cítrico está entre as principais doenças que afetam a produção de laranjas no Brasil e é causado pela bactéria fitopatogênica gram-negativa Xanthomonas citri subsp. citri (Xac). O presente trabalho teve por objetivo analisar a expressão diferencial de proteínas secretadas pela bactéria selvagem e por um mutante (02H02) assintomático, que teve a proteína HrpB4, que participa de seu sistema de secreção tipo III (SSTT) inativada, em condição de cultivo em meio rico CN e em meio XAM1 indutor de hipersensibilidade e patogenicidade (genes hrp). As proteínas secretadas em meio de cultura foram extraídas pela ação do ácido tricloroacético (TCA) e identificadas através de espectrometria de massas. Tais análises identificaram 55 proteínas diferentes secretadas em ambos os meios de cultura, tanto para Xac quanto para 02H02, de modo que 13 destas proteínas são comuns entre a Xac e seu mutante cultivados em XAM1 e 14 são exclusivas para Xac cultivada em XAM1, as quais deixaram de ser secretadas no 02H02. Proteínas relacionadas aos genes reguladores do SSTT foram detectadas em condição infectante para ambas as bactérias, demonstrando a eficácia do meio de cultura XAM1 em induzir Hrp. Foi observado que diversas proteínas secretadas pelo sistema de secreção tipo II (SSTD) em condição infectante para Xac e seu mutante possuem um papel ativo na degradação das paredes celulares do hospedeiro e podem ser reguladas por proteínas controladoras do SSTT. Fatores de sinalização difusíveis produzidos por Xac aparentemente sofreram alteração em sua secreção no mutante devido à inativação do pilus do SSTT, demonstrando a relação dessa molécula com o SSTT. A não detecção de proteínas secretadas diretamente pelo SSTT denota que as mesmas podem estar sendo secretadas no interior de vesículas lipídicas de membrana externa, assim como ocorre em Xanthomonas campestris / Citrus canker is among the major diseases which affect citrus production in Brazil and is caused by the gram-negative phytopathogenic bacterium Xanthomonas citri subsp. citri (Xac). This work aimed to analyze the differential expression of secreted proteins by the wild bacterium and by an asymptomatic mutant (02H02), lacking the type III secretion system (TTSS) protein HrpB4, in rich cultivation medium NB and in the hrp inducing medium XAM1. The proteins secreted in all culture media have been extracted by trichloroacetic acid based protocols (TCA) and identified using mass spectrometry. The analysis identified 55 different proteins secreted in both culture medium for Xac and 02H02, of which 13 are common among Xac and its mutant cultivated in XAM1 and 14 proteins are exclusively secreted by Xac cultivated in XAM1. Proteins related to the TTSS regulatory genes have been detected in infecting condition in both bacteria, showing the effectiveness of XAM1 hrp inducing medium. It has been observed that several type II secretion system’s secreted proteins showed an active role in host cell wall degradation and may be regulated by type III secretion system’s proteins in Xac and 02H02 in infecting condition. Diffusible signal factors produced by wild Xac apparently suffered an altered secretion in the mutant due the inactivation of the type three secretion system’s pilus, showing the relationship of this molecule with this secretion system. The lack of detection of proteins secreted by the TTSS denote that these proteins may be secreted in the interior of outer membrane lipid vesicles, just like it was verified in Xanthomonas campestris

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3253.pdf: 2155477 bytes, checksum: 03c92d367d865f20f90059d887400f1f (MD5) Previous issue date: 2010-08-30 / Financiadora de Estudos e Projetos / Citrus canker is an economically important disease that affects many citrus growing areas around the world, and there is no effective control or cure. The causative agents are bacteria from the genus Xanthomonas, recently classified as two novel species, X. citri e X. fuscans. The most virulent strain is X. citri subsp. citri (Xac). In this study, we did a differential proteomic analysis of a periplasmatic proteins enriched fraction from Xac, by comparison of the protein profiles after cellular growth in pathogenicity inducing medium (XAM1) or non-inducing medium (Nutrient Broth). We performed Bidimensional Electrophoresis (2D-PAGE) in triplicate and statistical analyses were done with the software Image Master Platinum (GE). At least 80 spots showed significant differences on protein expression (p<0.05) between the two conditions tested (induction/ non-induction) and had their proteins digested by trypsin. The peptides were analyzed by mass spectrometry (LCESI- Q-Tof) and the results were compared with proteins from genome databases using the Mascot tool. Among Xac proteins identified with higher expression in in vitro pathogenicity inducing situation, two are classified as proteins involved with Pathogenicity, Virulence, and Adaptation (in according to the genome annotation): superoxidase dismutase (XAC2386) e phosphoglucomutase (XAC3579). A highly differential spot (46), increased in the inducing condition, had their proteins identified as lytic murein transglycosilase (XACb0007) and/or transglycosylase (XAC3225), oxidoreductase (XAC1160) and DNA polymerase III subunit beta (XAC0002). The spot 46 was isolated from several 2D gels and used to produce antibody in mouse. The expressions of these proteins were analyzed by Western blot in others citrus canker genome strains, which differ from Xac in the virulence and host types. This analysis showed that proteins from the spot 46 had different expression pattern among these strains, with higher expression in Xac growing in inducing condition. We conclude that the proteomic study of proteins from periplasmic fraction is an important strategy to detect Xac proteins involved with pathogenicity and virulence, even including proteins transported outside the cell. Proteins found in this fraction could be used as biomarkers, however more experiments are still necessary. / O cancro cítrico é uma doença economicamente importante para a citricultura, não existindo atualmente medidas preventivas e curativas eficazes para combatê-la. Os agentes etiológicos são bactérias do gênero Xanthomonas, classificadas em duas espécies, X. citri e X. fuscans. A variedade mais agressiva aos citros é a bactéria X. citri subsp. citri (Xac). Pelo presente trabalho, realizamos a análise proteômica diferencial de uma fração celular de Xac enriquecida em proteínas periplasmáticas, após indução in vitro da sua patogenicidade, comparativamente à condição de não indução de patogenicidade (controle). As proteínas dessa fração foram separadas por eletroforese bidimensional (2D-PAGE), sendo a análise estatística das intensidades dos spots realizada por meio do software Image Master Platinum (GE). Aproximadamente 80 spots apresentaram expressão diferencial significativa (p<0,05) entre as duas condições estudadas, os quais foram isolados do gel e sua(s) proteína(s) constituinte(s) digerida(s) com tripsina. Os peptídeos resultantes da digestão foram analisados por espectrometria de massas (LC-ESI-QTof) e os dados obtidos utilizados na identificação da proteína por pesquisa em bancos de Xac e/ou de outros organismos com o software Mascot. Dentre as proteínas de Xac identificadas como mais expressas após indução de patogenicidade in vitro duas estão classificadas como proteínas relacionadas com Patogenicidade, Virulência e Adaptação (segundo anotação do genoma de Xac), sendo elas: superoxidase dismutase (XAC2386) e fosfoglicomutase (XAC3579). Proteínas pertencentes a um spot com notável aumento de expressão em situação de indução de patogenicidade (spot 46) foram identificadas por espectrometria de massas, sendo elas: proteína lytic murein transglycosilase (XACb0007) e/ou transglycosylase (XAC3225), oxidoredutase (XAC1160) e subunidade beta da DNA polimerase III (XAC0002). O spot 46 foi isolado a partir de vários géis 2D e utilizado para produção de anticorpos em camundongos. A análise da expressão da(s) proteína(s) pertencente(s) ao spot 46 foi realizada por meio de Western blot nas linhagens-genoma B e C do cancro cítrico, as quais diferem de Xac na virulência e tipo de citros- hospedeiro. Por esta análise foi verificado que proteínas do spot 46 possuem expressão muito distinta entre as linhagens genoma do cancro cítrico, sendo sua expressão preponderante em Xac, especialmente em situação de indução de patogenicidade. Concluímos que o estudo das proteínas utilizando a fração periplasmática como objeto de estudo é de grande interesse para investigação de proteínas envolvidas com patogenicidade e virulência em Xac, e que tenham passagem pelo periplasma, inclusive de proteínas transportadas para o meio extracelular. Além disso, algumas proteínas desta fração possuem potencial para serem utilizadas como biomarcadores ou como possível alvo de combate ao cancro cítrico.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2005-11-01Bitstream added on 2014-06-13T18:45:54Z : No. of bitstreams: 1 wenzel_im_dr_botfca.pdf: 544393 bytes, checksum: f67161337e2bde1fdbfde14613c06462 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Secretaria Agricultura / Este trabalho teve como objetivo avaliar a patogenicidade do isolado JAB 02 de Lecanicillium lecanii (Zimm.) Zare & Gams ao ácaro rajado Tetranychus urticae e a sua compatibilidade com agrotóxicos, nematóides entomopatogênicos e ácaros predadores. Os conídios do fungo, produzidos em arroz, foram avaliados nas concentrações de 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108 e 5 x 108 conídios/mL. A partir das porcentagens de mortalidade de T. urticae, que variaram entre 49 e 90% no décimo dia de avaliação, foi determinada a CL50 de 5,25 x 106 con./mL. A compatibilidade em laboratório foi verificada misturando-se os agrotóxicos em meio de cultura BDA e os parâmetros utilizados para a avaliação foram crescimento vegetativo, esporulação e viabilidade do entomopatógeno. Em condições de estufa, as suspensões dos produtos químicos e, posteriormente, a do fungo foram pulverizadas em plantas de crisântemo. Após a aplicação, quatro folhas foram coletadas e lavadas obtendo-se uma suspensão que foi plaqueada em BDA, sendo então avaliado o crescimento das colônias do fungo. Verificou-se, em laboratório, que a maioria dos inseticidas e os acaricidas foram compatíveis ao fungo, com exceção do inseticida Thiodan® classificado como muito tóxico. Todos os fungicidas testados foram classificados como tóxico e muito tóxico. Em condições de estufa, no tratamento com o fungicida Rovral® foi observado um número de colônias fúngicas formadas compatível com a testemunha. Essa compatibilidade repetiu-se para os produtos Alto 100® e Thiodan® em alguns dos tempos avaliados. No teste de patogenicidade, os conídios produzidos em meio de cultura com inseticidas e acaricidas, a partir da compatibilidade em laboratório, não tiveram sua viabilidade afetada e foram patogênicos ao ácaro rajado Tetranychus urticae. Além disso, foram realizados... / The objective of this study was to evaluate the pathogenicity of Lecanicillium lecanii (Zare & Gams), isolate JAB 02, to the two-spotted mite Tetranychus urticae (Koch), its compatibility with agrochemical products and its selectivity to entomopathogenic nematodes and predatory mites. The pathogenicity of the fungus produced in rice to T. urticae was evaluated at the concentrations of 5 x 106, 1 x 107, 5 x107, 1 x 108 and 5 x 108 conidia/mL. The mortality rates of T. urticae ranged from 49 and 90 % in the tenth evaluation day and the LC50 was 5,25 x 106 conidia/mL. The compatibility in laboratory was verified by adding chemical products to the PDA media and the evaluated parameters were the vegetative growth, sporulation and viability of the entomopathogen. In greenhouse, L. lecanii were sprayed on chrysanthemum plants after the pulverization of the chemical products; subsequently, four leaves of each treatment were collected and washed to obtain a suspension that were transferred to PDA medium to evaluate the growth of the fungus colonies in laboratory conditions. The acaricides and the most of insecticides were compatible to the isolate JAB 02, except the insecticide Thiodan®, which was classified as very toxic. All the evaluated fungicides were classified as toxic or very toxic. In greenhouse assays, the fungicide Rovral® produced a number of grown colonies similar to those of the control and this compatibility was also showed by the products Alto 100® and Thiodan® in some of the evaluated periods. In another pathogenicity test, when L. lecanii were grown in culture media containing the insecticides, the conidia viability were not affected and the fungus were pathogenic to T. urticae, with mortality rates superior to the control in some cases. Also, compatibility bioassays involving L. lecanii at 5 x 106, 1 x 107 and 5 x 107 con./mL and the entomopathogenic nematodes Steinernema sp. (CB n6) and Heterorhabditis indica (CB n5) were conducted.

A poluição, alteração física do habitat e a introdução de espécies invasoras via água de lastro, representam os maiores impactos antropogênicos para os ambientes costeiros. Foram pesquisadas em amostras da região costeira de S. Paulo, regiões portuárias brasileiras e de tanques de lastro de navios, bactérias das espécies Vibrio cholerae (Vc), V. parahaemolyticus (Vp) e V. vulnificus (Vv) que são as que têm maior implicação na saúde pública. As amostras foram avaliadas levando-se em conta parâmetros físico-químicos e microbiológicos e suas relações com a presença de Vc, Vp e Vv. As relações clonais foram verificadas através das técnicas de ERIC, BOX e REP-PCR. Foram identificadas 90 cepas de Vp e 11 de Vc. Foram observadas correlações entre alguns parâmetros microbiológicos e a presença de vibrios. A análise clonal permitiu verificar a alta diversidade das cepas. Concluiu-se que Vc e Vp são autóctones do ambiente costeiro brasileiro e podem ser tornar reservatórios para determinados fatores associados à virulência, gerando cepas com potencial epidêmico. / Pollution, physical alteration of habitat and the introduction of alien species through ballast water constitute the biggest anthropogenic impacts on coastal environments. We examined samples taken from the coastal region of S. Paulo state, Brazilian ports and ship ballast tanks, for bacteria of the species Vibrio cholerae (Vc), V. parahaemolyticus (Vp) and V. vulnificus (Vv) which have the most significant implication for public health. The samples were evaluated for microbiological and physical-chemical parameters as well as the presence of Vc, Vp and Vv. Clonal relationships of bacterial isolates were determined through ERIC, BOX and REP-PCR. A total of 90 strains of Vp and 11 of Vc were identified. Correlations between some microbiological parameters and the presence of vibrios were observed. The clonal analysis revealed extensive strain diversity. We concluded that Vc and Vp are autochthonous bacteria of the Brazilian coastal environment that can become reservoirs for factors associated with virulence, and are capable of generating strains with epidemic potential.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:23Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-08-10Bitstream added on 2014-06-13T19:56:01Z : No. of bitstreams: 1 almeida_amb_me_jabo.pdf: 563129 bytes, checksum: 02996595fd1963684492476407b56da9 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A traça-das-crucíferas Plutella xylostella é relatada como uma das principais pragas das crucíferas no Brasil e no mundo. Sua principal forma de controle ainda é o químico, mas seu uso indiscriminado tem causado problemas de resistência de algumas populações, além de matar seus inimigos naturais e trazer malefícios para o ambiente e para o homem. Alguns estudos de controle biológico vêm sendo realizados para o controle dessa praga, dentre eles destacando-se o uso de fungos entomopatogênicos e de parasitóides. Assim, foi realizado um estudo com o objetivo de determinar a concentração e tempo letal 50 e 90 dos fungos entomopatogênicos Beauveria bassiana, Isaria fumosorosea e Metarhizium anisopliae para lagartas de P. xylostella, e a patogenicidade de isolados deste fungos para ovos, lagartas, pupas e adultos da praga. Foram utilizados cinco isolados de cada espécie fúngica, sendo que os mais patogênicos à todas as fases do ciclo de vida do inseto foram utilizados para investigar a interação dos entomopatógenos com os parasitóides Trichogramma pretiosum e T. exiguum e com o predador Podisus nigrispinus. As CL90 para B. bassiana, I. fumosorosea e M. anisopliae foram 2 x 108, 8,65 x 107 e 1,77 x 108 conídios mL-1, respectivamente, sendo que estas foram utilizadas em todos os experimentos posteriores. Os isolados CB 75 e IBCB 133 de I. fumosorosea mostraram uma ação patogênica eficiente para ovos da praga, causando, respectivamente, 66 e 70% de mortalidade. Para a fase de lagarta os isolados E9 e o IBCB 425 de M. anisopliae, causaram, respectivamente, 98 e 96% de mortes. Considerando a mortalidade total de pupas tratadas e seus adultos emergidos, a ação dos isolados AM 09, JAB 07, IBCB 74 e IBCB 87 não diferiu significativamente (p<0,01) causando, respectivamente, 94, 92, 82 e 100% de mortalidade do inseto. Para os adultos não houve diferença significativa... / The diamondback moth Plutella xylostella is related as one of mainly pests in crucifers in Brazil. Its mainly control way still is chemical, but its indiscriminate use has been causing resistance in some populations, besides to kill its natural enemies and bring bad things for environment and human. Some studies of biological control have been made, outsdanding entomopathogenic fungi and parasitoids. Thus, it was determinated the lethal time and concentration 50 and 90 of entomopathogenic fungi Beauveria bassiana, Isaria fumosorosea and Metarhizium anisopliae to larvae of P. xylostella, and the pathogenicity of strains of these fungi to eggs, larvae, pupae and adults of the pest. It was used five strains of each fungal specie, and the most pathogenic were used to investigate the interaction between entomopathogens and the parasitoids Trichogramma pretiosum and T. exiguum and with the predator Podisus nigrispinus. The LC90 for B. bassiana, I. fumosorosea and M. anisopliae were 2 x 108, 8,65 x 107 e 1,77 x 108 conidia ml-1, respectively, being used in the following bioassays. The strains CB 75 and IBCB 133 of I. fumosorosea showed an efficient pathogenic action for the eggs of the pest, causing, respectively, 66 and 70% of mortality. For larvae the isolates E9 and IBCB 425 of M. anisopliae, caused, respectively, 98 and 96% of death. Considering the total mortality of treated pupae and its emerged adults, the action of AM 09, JAB 07, IBCB 74 and IBCB 87, did not differ significantly (p<0,01) causing, respectively, 94, 92, 82 e 100% of insect mortality. For adults there was no statistical difference between the B. bassiana strains. The isolates CB 75 and IBCB 133 of I. fumosorosea caused, respectively, 98 and 94% of adults death of P. xylostella and the strains E9, IBCB 159 and IBCB 425 of M. anisopliae, caused 100, 92 and 96% of death. For the obtained results in all the stages of this study... (Complete abstract click electronic access below)

Submitted by Livia Mello (liviacmello@yahoo.com.br) on 2016-09-22T12:11:52Z No. of bitstreams: 1 DissAVA.pdf: 2653238 bytes, checksum: 6ed4edf2962eb1273324c54a2e900fa6 (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-10-10T14:38:43Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissAVA.pdf: 2653238 bytes, checksum: 6ed4edf2962eb1273324c54a2e900fa6 (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-10-10T14:38:51Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissAVA.pdf: 2653238 bytes, checksum: 6ed4edf2962eb1273324c54a2e900fa6 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-10T14:38:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissAVA.pdf: 2653238 bytes, checksum: 6ed4edf2962eb1273324c54a2e900fa6 (MD5) Previous issue date: 2015-03-03 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Citrus canker imposes damages to citriculture by causing drop in productivity and fruit quality and the absence of effective control and cure. Thus, the economic potential of citrus is limited in part by this disease mainly caused by the bacterium Xanthomonas citri subsp. citri (XAC) that presents the greatest virulence and broad spectrum of citrus hosts, compared to bacteria Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii types B (XauB) and C (XauC). In a proteomic analysis previously performed by our research group, periplasmic trehalase was identified as a protein which expression differed between XAC e XauC in an in vitro induction of pathogenicity. Trehalase is an enzyme that catalyzes hydrolysis reaction of trehalose, a disaccharide composed of two glucose units, which role in the plant-pathogen interaction is poorly understood. One of the objectives of the study was to obtain this enzyme in purified form using an IPTG-inducible heterologous expression system in E. coli, for purposes of partial characterization of its structure and activity. The recombinant XAC periplasmic trehalase is a monomer bearing wide pH stability and showed Michaelian kinetics. The Michaelis-Menten constant (Km) for trehalose was 0,124 ± 0,015 mM and Vmax 17,319 ± 0,035 μMol glucose.min-1.mg protein-1 . Circular dichroism spectroscopy indicated the following composition of secondary structures: 42.7% α-helices and 13% β-sheets. A gene knockout method based on double homologous recombination between the genomic DNA and suicide vector pNPTS138 has made possible to obtain a strain deleted in the gene encoding the periplasmic trehalase (XACΔ0604), which enabled to evaluate the relationship between this gene and the XAC pathogenicity in Citrus aurantifolia. Infiltrated leaves with XACΔ0604 showed drenching and necrosis of plant tissue and intense brownish pustules compared with wild XAC, suggesting greater virulence of the mutant strain. The periplasmic trehalase activity was compared in XAC and XauC cell extracts from two culture mediums, non-pathogenicity-inducing (CN) and pathogenicity-inducing (XAM-M). Interestingly, XauC has showed higher enzyme activity compared to XAC in XAM-M. Thus, the noticeable higher XACΔ0604 pathogenicity and the greater activity of XauC periplasmic trehalase compared to XAC are indicatives that trehalose may promote pathogenicity. / O cancro cítrico impõe prejuízos ao setor citricultor por ocasionar queda na produtividade e qualidade dos frutos e pela ausência de medidas eficazes de controle e cura. Assim, o potencial econômico dos citros é limitado, em parte, por essa doença causada principalmente pela bactéria Xanthomonas citri subsp. citri (XAC), que apresenta maior virulência e largo espectro de hospedeiros cítricos, comparativamente às bactérias Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii tipos B (XauB) e C (XauC). Em um trabalho de análise proteômica anteriormente realizado por nosso grupo de pesquisa, a trealase periplasmática foi identificada como uma proteína cuja expressão foi diferencial entre XAC e XauC, em condição de indução da patogenicidade in vitro. A trealase é uma enzima que catalisa a reação de hidrólise da trealose, um dissacarídeo formado por duas unidades de glicose, cujo papel na interação planta-patógeno é ainda pouco compreendido. Um dos objetivos do trabalho foi obter esta enzima purificada, utilizando um sistema de expressão heteróloga induzível por IPTG (isopropil-β-D-tiogalactosídeo) em E. coli, para fins de caracterização parcial da sua estrutura e atividade. A trealase periplasmática de XAC de origem heteróloga apresentou-se como um monômero relativamente estável em relação ao pH, e de cinética Michaeliana,. A constante de Michaelis-Menten (Km) da enzima para a trealose foi de 0,124 ± 0,015 mM e a Vmáx 17,319 ± 0,035 μMol de glicose.min-1.mg de proteína-1. Análise de dicroísmo circular resultou na seguinte composição de estruturas secundárias: 42,7 % de α-hélices e 13 % de folhas-β. Uma metodologia de nocaute gênico baseada na dupla recombinação homóloga entre o DNA genômico e o vetor suicida pNPTS138 viabilizou a obtenção de uma linhagem mutante deletada no gene que codifica a trealase periplasmática (XAC∆0604), o que possibilitou avaliar a relação entre tal gene e a patogenicidade de XAC em Citrus aurantifolia. Folhas infiltradas com a suspensão de XAC∆0604 apresentaram maior encharcamento e necrose do tecido vegetal, além de intensas pústulas acastanhadas quando comparadas com as folhas infiltradas com XAC selvagem, sugerindo maior virulência da linhagem mutante. A atividade da trealase periplasmática foi comparada em extratos celulares brutos provenientes de cultivos de XAC e XauC em dois meios de cultura, não-indutor de patogenicidade (CN) e indutor de patogenicidade (XAM- M). A bactéria XauC apresentou maior atividade enzimática de trealase em relação à XAC em XAM-M. Sendo assim, a acentuada patogenicidade de XAC∆0604 em relação à linhagem selvagem XAC e a maior atividade da trealase periplasmática de XauC em relação à XAC reforçam os recentes trabalhos que indicam a trealose como promotora da patogenicidade em fitopatógenos.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1830082 bytes, checksum: ec907521bfa48f79975e5fe22c20d972 (MD5) Previous issue date: 2009-10-01 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The filamentous fungus Colletotrichum lindemuthianum (Sacc & Magnus) Briosi & Cav., causal agent of anthracnose, is an important pathogen of common bean (Phaseolus vulgaris L.). This fungus is an excellent model organism for understanding the infection process of pathogenic fungi. A C. lindemuthianum non-pathogenic mutant (LVSa1) with partial deficiency in the production of melanin was obtained through plasmid insertional mutagenesis. The aim of this study was to isolate and characterize the interrupted gene in theLVSa1 mutant and demonstrate its importance in the plant infection process. The mutated gene was isolated from a C. lindemuthianum genomic bank and named slnCl1. The sequence analysis revealed that slnCl1 encodes a histidine kinase. The sequence presents an ORF of 3555 base pairs, interrupted by three putative introns, containing 51, 87 and 89 bp. The multiple alignment of the deduced sequence of the protein, including sequences of all histidine kinases classes available in the databases, grouped SlnCl1 in class VI; possessing highly conserved regions characteristic of histidine kinase, and related to its function. A mutant with partial deficiency for the production of melanin was obtained through site-directed insertional mutagenesis using a gene fragment. This mutant showed a significant reduction in the ability to infect bean leaves, demonstrating that SlnCl1 is important to the pathogenicity process of this fungus. As many histidines kinases already described in fungi, SlnCl1 is involved in osmoregulation and adaptation to different osmotic concentrations in C. lindemuthianum. Furthermore, through this sensor protein, the fungus can distinguish the osmotic stress caused by high concentrations of sugars and salts. The mutant was sensitive to fungicides that target a MAPK signaling pathway, probably regulated by slnCl1. The results suggest that C. lindemuthianum must have other histidines kinases involved in the osmoregulation process. The study of the signaling cascade regulated by slnCl1 may represent a major advance in understanding the pathogenicity and developing new methods to combat this disease. / O fungo filamentoso Colletotrichum lindemuthianum (Sacc & Magnus) Briosi & Cav., agente causal da antracnose, é um importante patógeno do feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris L.). Esse fungo é um excelente modelo de estudo para o entendimento do processo de infecção de fungos fitopatogênicos. Por meio de mutagênese por inserção de plasmídeo foi obtido um mutante (LVSa1) não patogênico de C. lindemuthianum com deficiência parcial na produção de melanina. O objetivo desse trabalho foi isolar e caracterizar o gene interrompido no mutante LVSa1 e comprovar a sua importância no processo de infecção da planta. O gene mutado foi isolado de um banco genômico de C. lindemuthianum e denominado slnCl1. A análise da sequência revelou que slnCl1 codifica uma histidina quinase. A sequência apresenta uma ORF de 3555 pares de bases, interrompida por três íntrons putativos, contendo 51, 87 e 89 pb. O alinhamento múltiplo da sequência deduzida da proteína, com sequências de todas as classes de histidinas quinases disponíveis nos bancos de dados agrupou SlnCl1 na classe VI, possuindo regiões extremamente conservadas características de histidina quinases e relacionadas a sua função. Por meio de mutagênese insercional sítio dirigida utilizando um fragmento do gene, foi obtido um mutante que apresentou deficiência parcial na produção de melanina. Esse mutante apresentou uma redução significativa na capacidade de infectar folhas de feijoeiro, demonstrando que SlnCl1 é importante no processo de patogenicidade desse fungo. Como muitas histidinas quinases já descritas em fungos, SlnCl1 apresenta envolvimento no processo de osmorregulação e adaptação a diferentes concentrações osmóticas em C. lindemuthianum. Além disso, por meio dessa proteína sensora, o fungo pode distinguir o estresse osmótico causado por altas concentrações de açúcares e de sais. O mutante mostrou-se sensível a fungicidas que tem como alvo uma via de sinalização MAPK, provavelmente regulada por slnCl1. Os resultados obtidos sugerem que C. lindemuthianum deve possuir outras histidinas quinases envolvidas no processo de osmorregulação. O estudo da cascata de sinalização regulada por slnCl1 pode representar um grande avanço no entendimento do processo de patogenicidade e na elaboração de novos métodos de combate a doença.