Submitted by (edna.saturno@ufrpe.br) on 2016-11-28T12:13:06Z No. of bitstreams: 1 Liliane Marques da Silva.pdf: 566459 bytes, checksum: 54839b1e8470b48f9d90167ceb6a2716 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-11-28T12:13:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Liliane Marques da Silva.pdf: 566459 bytes, checksum: 54839b1e8470b48f9d90167ceb6a2716 (MD5) Previous issue date: 2013-02-04 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / The bacterium Bacillus thuringiensis (Berliner) presents remarkable aspects for the control of insect pests, such as its mode of action, specificity and selectivity. Thus, this study aimed to evaluate the toxic activity of B. thuringiensis isolates in larvae of Diatraea saccharalis (Fabr.) and Diatraea flavipennella (Box) and determine the toxin gene contents for the very active isolates. The insects were maintained on artificial diet. Twenty four isolates were used, which were preserved in LB medium, 15% glycerol and 0.02% SDS and kept at -80 ° C. General and specific primers were used to survey for toxin genes. In pathogenicity tests with D. saccharalis and D. flavipennella, 16 and 18 isolates showed activity toward borers, respectively. The LC50 values among isolates for the population of D. saccharalis ranged from 0.08 x 105 (LIIT-0105) and 4104 x 105 (LIIT-2707) crystals + spores/mL. The isolated LIIT-0105 was 4,382 and 18.59 times more toxic than Btk and Btt, respectively. For D. flavipennella, the LC50 values between isolates ranged from 0.40 x 105 (LIIT-2707) and 542.75 x 105 (LIIT-2109) crystals + spores/mL. The isolate LIIT-2707 was 1,137 and 11.52 times more toxic than Btk and Btt, respectively. The isolate LIIT-0105 presented the lowest LC50 for D. saccharalis that harbored the genes cry1, cry2, cry8 cry9, cry1Aa, cry1Ab, cry1Ac, cry1B, cry1C, cry1D, cry1F, cry1I, cry2A, cry2Aa1, cry2Ab2, cry9C. For the borer D. flavipennella, the isolated LIIT-2707 presented the lowest LC50 and the following genes cry1, cry2, cry9, cry1Aa, cry1Ab, cry1Ac, cry1B, cry1D, cry1F, cry1I, cry2A, cry2Aa1 and cry2Ab2 were amplified. The results suggest that B. thuringiensis isolates present a great variability of genes for bioprospection, and thus potential for developing new products and insertion on plants to express Bt genes for the control of D. saccharalis and D. flavipennella. / A bactéria Bacillus thuringiensis (Berliner) apresenta características essenciais no controle de insetos-praga, tais como seu modo de ação, especificidade e seletividade. Dessa forma, esta pesquisa objetivou avaliar a atividade tóxica de isolados de B. thuringiensis em larvas de Diatraea saccharalis (Fabr.) e Diatraea flavipennella (Box) e caracterizar quanto à presença de gene de toxinas os isolados tóxicos. Estas pragas foram mantidas em dieta artificial. Foram utilizados 24 isolados, preservados em meio LB, glicerol a 15% e SDS a 0,02% e mantidos a -80ºC. Para caracterização molecular foram utilizados iniciadores gerais e específicos. Nos testes de patogenicidade com D. saccharalis e D. flavipennella, 16 e 18 isolados mostraram-se ativos, respectivamente. Os valores de CL50 entre os isolados para a população de D. saccharalis variaram entre 0,08 x 105 (LIIT-0105) e 4104 x 105 (LIIT-2707) esporos + cristais/mL. O isolado LIIT-0105 foi 18,59 e 4382 vezes mais tóxico que o Btk e Btt, respectivamente. Para D. flavipennella, os valores de CL50 entre os isolados variaram entre 0,40 x 105 (LIIT-2707) e 542,75 x 105 (LIIT-2109) esporos + cristais/mL. O isolado LIIT-2707 foi 11,52 e 1137 vezes mais tóxico que o Btk e Btt, respectivamente. O isolado LIIT-0105 que teve a menor CL50 para D. saccharalis apresentou os genes cry1, cry2, cry8, cry9, cry1Aa, cry1Ab, cry1Ac, cry1B, cry1C, cry1D, cry1F, cry1I, cry2A, cry2Aa1, cry2Ab2 e cry9C e para D. flavipennella o isolado LIIT-2707 apresentou a menor CL50 amplificando para os genes cry1, cry2, cry9, cry1Aa, cry1Ab, cry1Ac, cry1B, cry1D, cry1F, cry1I, cry2A, cry2Aa1 e cry2Ab2. Os resultados sugerem que isolados de B. thuringiensis apresentam grande potencial e variabilidade para bioprospecção desta bactéria, para o desenvolvimento de produtos ou transformação de plantas que expressem genes de Bt para o controle de D. saccharalis e D. flavipennella.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_rita_de_cassia_dos_santos_da_conceicao.pdf: 1008237 bytes, checksum: 314712b961ce0f1c183271a96a57f4ea (MD5) Previous issue date: 2012-12-21 / Salmonella spp. is the most commonly bacterium transmitted through contamined food. The foods of animal are the most responsible for the worldwide distribution of this bacterium. Salmonella spp. is able to induce a variety of diseases, ranging from an enteric fever, septicemia, gastroenteritis and infections focused. This is due to the bacteria produce different pathogenicity factors and these factors, the flagellum was the target of our study and it is one of the pathogenicity factors induced by Quorum Sensing. Quorum Sensing is a bacterial signaling system that operates through the so-called autoinducer (AI). Gram-negative bacteria produce three auto-inducers. Studies find that catecholamines are able to use the same pathway the autoinducer 3 (AI-3) to active certain genes. Epinephrine and norepinephrine are catecholamines that are present in the mammalian gastrointestinal tract can modulate bacterial gene expression. This work had as objectives to evaluate the Quorum Sensing signaling system on motility, on the growth and flagellar assembly gene expression of Salmonella enterica serovar Typhimurium (ST) and do a review about pathogenicity factors of Salmonella spp. induced by Quorum Sensing. ST was exposed to different concentrations of epinephrine and conditioned medium and its association. The combination of 500 μM epinephrine with 50 % conditioned medium increased ST bacterial motility, growth and increased the expression of the fliC, motA, motB and fliA genes. These results suggest that epinephrine in association with conditioned medium increases ST growth and motility, by modulating the expression of genes involved in flagellum assembly. These observations provide valuable insight into the association between catecholamine and autoinducer and their role in the outcome of Salmonella spp. infection. / Salmonella spp. é um dos principais patógenos transmitidos por alimentos. Os produtos de origem animal são os maiores responsáveis pela distribuição mundial desta bactéria. Salmonella spp. é capaz de induzir uma série de doenças, que vão desde uma febre entérica, septicemia, gastroenterite e infecções focalizadas. Isto é decorrente da bactéria produzir diferentes fatores de patogenicidade e dentre estes fatores, o flagelo foi o alvo no nosso estudo e é um dos fatores de patogenicidade induzidos por Quorum Sensing. Este é um de sistema de sinalização entre as bactérias, através de substâncias denominadas de auto-indutores (AI). As bactérias Gram-negativas produzem três auto-indutores. Estudos verificaram que catecolaminas são capazes de usar a mesma via de sinalização do auto-indutor 3 (AI-3) para ativar determinados genes. Adrenalina e noradrenalina são catecolaminas presentes no trato gastrointestinal de humanos e animais que são capazes de modular a expressão de gênica de bactérias. O presente trabalho teve por objetivos avaliar o sistema de sinalização Quorum Sensing (AI-3) na motilidade, no crescimento celular e na expressão de genes envolvidos na montagem do flagelo de Salmonella enterica sorovar Typhimurium (ST) e fazer uma revisão bibliográfica de fatores de patogenicidade de Salmonella spp. induzidos por Quorum Sensing. ST foi exposta a diferentes concentrações de adrenalina e esta associada ao meio condicionado. A combinação de 500 μM de adrenalina + 50% de meio condicionado aumentou a motilidade de ST, o crescimento celular e induziu a expressão dos genes motA, motB, fliA e fliC. Estes resultados sugerem que a maior motilidade de ST foi decorrente de uma maior expressão de genes envolvidos com a montagem do flagelo. Estas observações fornecem dados valiosos sobre a associação da adrenalina com os auto-indutores e seu papel na infecção causada por Salmonella spp..

Orientador: Marcos Antonio Machado / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-09T03:27:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Winck_FlaviaVischi_M.pdf: 4501613 bytes, checksum: 37c71381bde27b6bd814d565ab527886 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: A bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) é o agente causador do cancro cítrico, doença que leva a severas perdas econômicas devido à contaminação e à erradicação de plantas de citros. Com o seqüenciamento completo do genoma de Xac, vários genes supostamente envolvidos com a patogenicidade de Xac foram identificados. Os genes ligados à resposta de hipersensibilidade (hrp) e avirulência (avr) em geral estão relacionados à patogenicidade de Xanthomonas, entretanto, poucos estudos funcionais destes genes de Xac foram feitos. Foram construídas linhagens mutantes de Xac para a perda de função dos genes hrpF e avrXacE2 e, nas análises in vivo, foi verificado que hrpF está envolvido na patogenicidade de Xac e é essencial para a manifestação dos sintomas primários da doença. A mutação de avrXacE2 não provocou alterações na capacidade de Xac em provocar os sintomas do cancro, portanto, este gene não parece ser essencial para a patogenicidade da bactéria, podendo não estar envolvido diretamente na patogenicidade de Xac. Os genes hrpF e avrXacE2 foram clonados em vetores de expressão e foram realizados testes de indução da expressão destas proteínas em sistemas heterólogos. Somente a proteína AvrXacE2 foi expressa, purificada e submetida a teste de interação com as proteínas citoplasmáticas da linhagem mutante de Xac para o gene avrXacE2. Os testes de interações não confirmaram a identificação de proteínas com afinidade específica pela proteína recombinante AvrXacE2. A proteína HrpF não foi super-expressa em sistema heterólogo. Nas análises de proteoma comparativo da linhagem de Xac selvagem versus linhagem mutante para o gene hrpF, foram detectadas alterações na expressão de proteínas citoplasmáticas e "pericelulares". Com base nas observações pode-se supor que HrpF possa influenciar processos celulares relacionados à respostas à situações de estresse e não somente atuar na translocação de moléculas efetoras via T3SS. A partir do que foi exposto neste trabalho, sugere-se que as técnicas de estudos funcionais de genes e análises proteômicas podem conjuntamente permitir que novos mecanismos relacionados a patogenicidade de Xac sejam interpretados. Com os mutantes produzidos neste estudo, espera-se criar condições para novos ensaios funcionais visando a melhor compreensão da patogenicidade de Xac e buscar novas formas de combate ao cancro cítrico / Abstract: The bacterium Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) is the causative agent of the citrus canker disease, which leads to economic losses due the contamination and erradication of citrus plants. The complete sequencing of its genome identified a number of genes supposedly involved with pathogenicity. Genes that code for hipersensitivity response (hrp) and avirulence (avr), in general, are related to the pathogenicity of Xanthomonas, however, only a few functional studies of these genes in Xac have been made. Here we report findings based on genomics and proteomics methods for Xac. Mutant strains of Xac for genes hrpF and avrXacE2 and in vivo assays demonstrated that hrpF is strongly involved in the pathogenicity of Xac and is essential for the manifestation of the primary symptoms of the citrus canker. On the other hand, the lack of avrXacE2 expression did not result in modifications in the capacity of Xac to elicite the symptoms of canker, therefore, this gene does not seem to be essential for the pathogenicity of the bacterium. The genes hrpF and avrXacE2 were cloned in expression vectors and tests of induction of the expression of these proteins in heterologous systems were carried out. The protein AvrXacE2 was expressed, purified and tested on interaction assays with cytoplasmic proteins of the mutant of Xac for the gene avrXacE2. The tests of interactions had not confirmed the identification of proteins with specific affinity for the recombinant protein AvrXacE2. The protein HrpF was not overexpressed in heterologous system. In the comparative proteome of the wild versus mutant strains for hrpF, modifications in the cytoplasmic protein expression and "pericellular" expression levels were detected. We postulate that, besides acting as a translocator of molecules through T3SS, HrpF may influence stress-related cellular responses. Thus, it is an opportune time to highlight the new and different ways in which HrpF serves Xac function. Moreover, we can assume that the techniques of functional genomics and proteomics analyses will clarify the mechanisms of pathogenicity used by Xac to cause citrus canker and, thus, enable the search for additional information to control the disease / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de NÃvel Superior / Lasiodiplodia theobromae à um fungo cosmopolita, polÃfago e oportunista, com reduzida especializaÃÃo patogÃnica, que infecta espÃcies de plantas em regiÃes tropicais e temperadas, causando os mais variados sintomas. A crescente expansÃo das doenÃas causadas por L. theobromae em frutÃferas tropicais vem causando inestimÃveis perdas, tanto no sistema produtivo como em pÃs-colheita, representando uma ameaÃa à fruticultura no Nordeste. Daà a necessidade de conhecimentos bÃsicos sobre a biologia populacional e a interaÃÃo do patÃgeno com as plantas hospedeiras. Este estudo teve como objetivo caracterizar isolados de L. theobromae associados a frutÃferas tropicais de diferentes regiÃes, avaliando o aspecto cultural, morfolÃgico e patogÃnico. Foram avaliados o crescimento micelial, coloraÃÃo da colÃnia, dimensÃes dos conÃdios e patogenicidade dos isolados em mudas de cajazeira, cajueiro, gravioleira e umbuzeiro. O trabalho foi realizado na Casa de VegetaÃÃo e no LaboratÃrio de Fitopatologia da Embrapa AgroindÃstria Tropical. Os dados de caracterizaÃÃo morfocultural mostraram haver alta diversidade na populaÃÃo do patÃgeno. As inoculaÃÃes realizadas nas quatro diferentes espÃcies hospedeiras apontaram alta variabilidade patogÃnica entre os isolados do fungo. Em mudas de cajueiro CCP 76 nÃo foi possÃvel observar especificidade patogÃnica, pois todos os isolados apresentaram similar nÃvel de agressividade, demonstrando a suscetibilidade deste clone ao patÃgeno, suscetibilidade essa, tambÃm observada em gravioleira. O umbuzeiro foi a espÃcie que apresentou maior resistÃncia ao fungo. Os dados mostraram que existe interaÃÃo entre as caracterÃsticas morfoculturais e a agressividade dos isolados de L. theobromae. De acordo com os resultados, a altitude dos locais de origem dos isolados nÃo influencia em suas caracterÃsticas morfoculturais e patogÃnicas. / Lasiodiplodia theobromae is an ubiquitous, polyphagous and opportunistic fungus with a reduced pathogenic ability. Nevertheless, it may infect several plant species over tropical and temperate regions, causing many different kinds of symptoms. The increasingly expansion of diseases caused by L. theobromae in tropical fruit plants has been imposing severe losses both at orchard level and in post-harvest at market, threaten the fruit crop industry in Northeast Region of Brazil. Therefore there is an urgent need for research pursuing basic knowledge on population biology of the fungus and host-pathogen interactions. This study aimed to characterize a L. theobromae population which has been associated to tropical plant species growing under different ecosystems in northeastern Brazil. Colony growth in culture, color and size of conidia and ability to cause disease upon inoculation on cashew nut (Anacardium occidentale), soursop (Annona muricata), yellow mombin (Spondias mombin) and Brazil plum (Spondias tuberosa) were evaluated. He study was carried out at Plant Pathology Lab and screenhouse of Embrapa Agroindustria Tropical in Fortaleza, Cearà State. Results showed a high diversity of morphology and hyphal growth among fungus isolates. Also, a very high variability on disease expression upon inoculation into four plant species was observed. However, it was found a lack of specificity of isolates as to infect cashew plants, since all isolates were able to infect cashew with similar high aggressiveness, which demonstrated a high degree of susceptibility of cashew clone used (CCP 76). Similar results were found also for soursop plants as host. Brazil plum showed a very high resistance to all isolates. The data points out for the existence of morphological and pathogenic interactions within L. theobromae population studied. According with the results, altitude and region of isolate origin has no effect on the studied features.

Vírus da raiva provenientes de 23 morcegos de espécies hematófagas, frugívoras e insetívoras foram caracterizados geneticamente pelo seqüenciamento completo da região que codifica a nucleoproteína N. A análise filogenética das seqüências, incluindo lyssavirus e isolados de morcegos do Chile e Estados Unidos, mostrou que os diferentes isolados do vírus da raiva foram de modo geral segregados em quatro grupos genéticos distintas: morcegos hematófagos, morcegos insetívoros 1, 2 e 3. Os morcegos insetívoros 1 constituiram-se por isolados de Eptesicus furinalis: BR-EF1, BR-EF2, BREF3, BR-EF-4, BR-EA1 e BR-NL2; os morcegos insetívoros 2 consistiram de isolados de Molosssus spp: BR-MM1, BR-MM2 e BR- MA1 e os morcegos insetívoros 3 isolados de Nictinomops laticaudatus: BR-NL1 e BR-NL3. A homologia de nucleotídeos entre cada grupo de morcegos insetívoros 1, 2 e 3 foi maior que 99%, 97% e 99%, respectivamente. O grupo de morcegos hematófagos foi representado pelos isolados de: 3 morcegos hematófagos Desmodus rotundus (BR-DR1, BR-DR2 e BR-DR3); 5 morcegos frugívoros Artibeus lituratus BR-AL1, BR-AL2, BR-AL3, BR-AL4 e Artibeus planirostris BRAP1; 2 morcegos insetívoros (BR-MR1 e BR-EA2) e 2 de espécies não identificadas (BR-BAT1 e BR-BAT2). Entre as amostras seqüenciadas foram selecionadas cinco (BR-EF1, BR-NL1, BR-AL3, BR-MM1, BR-DR1) e um isolado de cão (BR-C) para os estudos de patogenicidade em camundongos albinos suíços inoculados pela vias intracerebral (IC) e intramuscular (IM). Todas as amostras quando inoculadas em camundongos pela via IC apresentaram-se patogênicas, provocando a morte dos mesmos num período de 4 a 14 dias pós-inoculação. No entanto, 500DLIC50 das mesmas amostras inoculadas pela via IM levaram a uma mortalidade de camundongos de: 60% (BR-DR1); 50% (BR-C, BR-NL); 40% (BR- AL3); 9,5% (BR-MM1); 5,2% (BR-EF10). As mesmas amostras foram utilizadas para a verificação de proteção cruzada, conferida por vacina comercial de uso animal, de camundongos que receberam uma ou duas doses de vacina pela via subcutânea (SC) e desafiados pelas vias IC e IM. Camundongos inoculados com duas doses de vacina foram protegidos quando desafiados pela via IC, com todas as amostras testadas. Quando os camundongos receberam uma dose da mesma vacina houve proteção parcial daqueles desafiados com as amostras de vírus PV e BR-C. Houve proteção de 100% dos camundongos desafiados pela via IM, com exceção daqueles vacinados com uma dose de vacina e desafiados com a amostra PV que apresentaram um índice de 66% de sobreviventes. Os resultados indicam a possibilidade de existir variantes do vírus da raiva espécies específicas circulando em morcegos. Sugerem ainda, que espécies de morcegos hematófagos, frugívoros e insetívoros compartilham o mesmo polimorfismo de vírus. A vacina comercial contra a raiva contendo vírus inativado e de uso veterinário protegeu os camundongos contra o desafio com as diferentes amostras testadas, sugerindo que as vacinas usualmente utilizadas são efetivas no tratamento profilático da raiva transmitida por morcegos, apesar da marcada diferença de neurovirulência dos diferentes isolados quando inoculados em camundongos pela via IM. / Twenty-three rabies viruses isolated from hematophagous, frugivorous and insectivorous bats were characterized genetically by complete sequencing of the region coding the nucleoprotein N. The phylogenetic analysis of the sequences, including the lyssavirus and the bat isolates from Chile and USA revealed that the isolates were segregated into four distinct genetic lineages: those related to the vampire bats and to the insectivorous bats 1, 2 and 3. The isolates related to the insectivorous bats 1 were from the Eptesicus furinalis: BR-EF1, BR- EF2, BREF3, BR-EF-4, BR-EA1 e BR-NL2; those of the insectivorous bats2 included the isolates from Molosssus spp: BR-MM1, BR-MM2 and BR-MA1 and the group 3, by the isolates from the Nictinomops laticaudatus: BR-NL1 and BR-NL3. The homology among each group of the insectivorous bats 1, 2 and 3 were greater than 99%, 97% and 99%, respectively. The lineage related to vampire bats was represented by three isolates from the D. rotundus (BR-DR1, BR-DR2 e BR-DR3); five from the fruit bats Artibeus lituratus (BR-AL1, BR-AL2, BR-AL3, BR-AL4) and Artibeus planirostris (BRAP1); two from insectivorous bats (BR-MR1 and BR-EA2) and two from unidentified species (BR-BAT1 and BR-BAT2). Among the sequenced amples, five bat isolates (BR-EF1, BR-NL1, BR-AL3, BR-MM1, BR- DR1) and one dog isolate (BR-C) were selected for the study of their pathogenicity in Swiss mice, inoculating through intracerebral (IC) and intramuscular (IM) routes. All the isolates, when inoculated via IC, were pathogenic, provoking death in 4 - 14 post inoculation days. However, mice inoculated with 500ICLD50 of the same isolates through IM route were found with different death rates: 60.0% (BR-DR1); 50.0% (BR-C, BR-NL); 40.0% (BR-AL3); 9.5% (BR-MM1) and 5.2% (BR-EF10). The same isolates were used for the assessment of cross protection conferred by a commercial vaccine of veterinary use. The mice were vaccinated subcutaneously, receiving either one or two shots of vaccine, and challenged through IC and IM routes. Mice receiving two shots were protected against all the isolates, when challenged intracerebrally. Mice receiving one shot were found only partially protected against the challenge with the fixed PV strain and BR-C isolate. Mice challenged intramuscularly showed 100.0% of protection, with the exception of those vaccinated with one dose and challenged with PV strain, which were found with 66.0% of survivors. These results indicate the possibility of the existence of rabies virus variants circulating in different species of bat population. The data also suggest that the vampires, frugivorous and insectivorous bats share the same lineage of rabies viruses. The commercial vaccine has protected the mice against the challenge with different rabies virus isolates, suggesting that the vaccines usually employed in the field are effective, although some marked difference in neurovirulence by IM inoculation was found among the isolates tested.

Colletotrichum species are considered one of the most economically important plant pathogens. They cause many losses in tropical, subtropical and temperate regions affecting a wide range of plant species. In tropical and subtropical regions C. gloeosporioides and C. acutatum are associated with significant losses on pre and post-harvest anthracnoses. There are still many features to understand about Colletotrichum biology and its systematics. The accurate identification of species involved with each anthracnose is of high relevance to establish management strategies to control the disease. Although the great advances on Colletotrichum systematics, species complex such as C. gloeosporioides and C. acutatum are used in a broad sense in Brazil. These complexes were recently investigated and showed to be highly genetic and geographic variable. In this study multigene analysis were carried out based on ITS, GAPDH, CHS-1, TUB2 and CAL or HIS3 partial sequences for strains of C. gloesporioides and C. acutatum complexes collected from fruit crops in Brazil. Strains from different countries and exepitypes and others sequences available on GenBank from the species accepted on both complexes were added on dataset. Six strains from C. gloeosporiodes complex and five for C. acutatum were selected based on multigene phylogeny to investigate the pathogenicity through inoculations on detached fruit. The multigene phylogenies showed the occurrence of species in Brazil related to those complexes with a high genetic variability among them. The phylogeny of Brazilian strains belonging to the C. gloeosporioides complex showed that C. siamense represents the most genetically and host-specific variable clade. In contrast, C. asianum clade grouped only strains isolated from mango. The strains from this clade used on pathogenic test were not able to infect avocado and one of the strains caused symptoms only on mango. All strains from Brazil grouped in one subclade within the C. fructicola clade and seem to represent a genetically distinct group. C. theobromicola is first reported causing anthracnose on acerola fruit. Three new species (C. polyphialidicum, C. paranaense and C. pruni) belonging to the C. acutatum complex were recognized and their morphologic descriptions were provided. The pathogenic test for the strains in the C. acutatum complex showed their cross infection ability, but in some cases the larger lesions were produced on the original host. Most brazilian strains from C. acutatum complex grouped in one subclade within the C. nymphaeae clade and seem to be genetically distinct. / Fungos do gênero Colletotrichum são considerados um dos mais importantes economicamente na Fitopatologia. Espécies desse gênero são encontradas amplamente disseminadas e estão associadas a diversas espécies de plantas hospedeiras. Em regiões tropicais e subtropicais, espécies dos complexos C. gloeosporioides e C. acutatum são a principal causa das antracnoses em pré e póscolheita de frutos e consequentemente causam significantivas perdas. Ainda há muitos aspectos a serem compreendidos sobre o gênero Colletotrichum, como a biologia e a sistemática. A acurada identificação das espécies associadas a antracnoses é de suma importância para o estabelecimento de estratégias de controle. No entanto, apesar dos grandes avanços na sistemática desse gênero, complexos de espécies como aquelas citadas acima são tratados de modo genérico no Brasil. Estes complexos de espécies foram recentemente estudados e considerados geneticamente e geograficamente variáveis. Neste sentido, o presente trabalho teve como objetivo caracterizar isolados de Colletotrichum spp. associados a diferentes frutos e regiões do Brasil por meio de análise filogenética. Para análise multilocus, foram utilizadas sequências parciais dos genes ITS, GAPDH, CHS-1, TUB2 and CAL ou HIS3. Sequências de espécies-tipos disponíveis no GenBank e de isolados de diferentes países foram adicionadas ao conjunto de dados. Com base nos resultados obtidos por meio de filogenia multilocus, seis isolados do complexo C. gloeosporiodes e cinco do complexo C. acutatum foram escolhidos para testes de patogenicidade cruzada. A espécie C. siamense, pertencente ao complexo C. gloeosporioides, foi a mais variável geneticamente e quanto ao hospedeiro de origem. Diferentemente, apenas isolados obtidos de manga se agruparam no clado C. asianum. Isolados agrupados neste clado não infectaram abacate e um dos isolados (CPC 20969) causou sintomas apenas em manga. No clado C. fructicola, isolados coletados no Brasil se agruparam em um subclado e parecem representar um grupo geneticamente distinto. A espécie C. theobromicola é relatada pela primeira vez em acerola. Foram identificadas três novas espécies, C. polyphialidicum, C. paranaense e C. pruni, pertencentes ao complexo C. acutatum. Isolados brasileiros agrupados no clado C. nymphaeae parecem representar um grupo geneticamente distinto, todos se agruparam em um subclado. Isolados do complexo C. acutatum utilizados no teste de patogenicidade provocaram sintomas nos hospedeiros testados, porém, em algumas inoculações, as lesões foram maiores no hospedeiro de origem.

O cancro cítrico, causado pela bactéria Gram negativa Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) é considerado uma das principais doenças da citricultura nacional e mundial, devido à susceptibilidade do hospedeiro e por não existirem métodos de controle eficientes. Dados da literatura relatam que alguns genes de bactérias fitopatogênicas possuem uma seqüência consenso de nucleotídeos (TTCGC...N15...TTCGC) denominada “PIP box” ou “plant-inducible-promoter box”, localizada na região promotora e responsável pela ativação da expressão de fatores de patogenicidade e virulência quando o patógeno entra em contato com a planta hospedeira. O objetivo deste trabalho foi mapear e investigar no genoma da Xac a expressão de genes contendo seqüências do tipo “PIP box”, a 5’ da ORF ou internamente na região codificadora, através da técnica de macroarranjo. Com auxílio de uma ferramenta de bioinformática (script PERL), 208 seqüências consenso para o elemento cis-regulatório “PIP box” foram mapeados no genoma da Xac, e clones contendo seqüências codificadoras associadas aos promotores do tipo “PIP box” foram recuperados do banco de clones gerado pelo projeto de seqüenciamento da bactéria e validados por seqüenciamento. Os DNAs plasmidiais representando cada clone foram preparados e imobilizados em membranas de náilon (macroarranjo), as quais foram hibridadas com sondas de cDNAs marcadas com [a33P] dCTP e obtidas a partir de RNA total extraído da bactéria em estádio não infectante (cultivada em meio de cultura Caldo Nutriente – meio CN) e da bactéria infectante (cultivada por 12 horas ou 20 horas em meio XAM1 indutor de patogenicidade e virulência, ou coletada por exsudação 3 dias ou 5dias após inoculação em folhas de laranjeira). A análise da expressão dos genes contendo promotores “PIP box” putativos revelou 67 genes diferencialmente expressos quando a bactéria teve o seu programa de infecção disparado (indução “in vitro” ou “in vivo”). A validação dos resultados de macroarranjo foi realizada para alguns dos genes por meio de RT-PCR semi-quantitativo e a funcionalidade da seqüência “PIP box” para alguns promotores foi demonstrada através do gene repórter GUS. Os genes com expressão diferencial foram classificados segundo a função biológica das respectivas proteínas codificadas e estão envolvidos em processos tão distintos quanto sistema de secreção tipo III, metabolismo de membrana e parede celular, sistema de captação de ferro, metabolismo de açúcares e degradação da parede vegetal, transdução de sinais, metabolismo de flagelo, formação de biofilme e adesividade, metabolismo de ácidos nucléicos, transportadores de membrana, metabolismo energético e resposta a estresse ambiental. O possível papel destas modificações para a interação planta-patógeno e a instalação do cancro cítrico é discutida. / The citrus canker, caused by the bacterial pathogen Xanthomonas axonopodis pv citri (Xac), is considered worldwide as one of the most important disease of citrus crop due to the lack of resistance in citrus plants and to the absence of efficient methods to control the disease. It was already shown that several genes involved in virulence and pathogenicity in plant pathogenic bacteria have a consensus nucleotide sequence (TTCGC…N15…TTCGC) named plant-inducible-promoter box or PIP box, located in the promoter region of the genes, which are responsible to activate the expression of genes during the host-bacteria interaction. The aim of this work was to map in Xac genome the genes containing the PIP box sequence in the promoter region, or internal to the ORF sequence, and analyze their expression during plant infection using the macroarray technique. Using a PERL script, 208 PIP box consensus sequence associated to genes were found in the Xac genome and clones containing all these genes and their PIP box sequences were recovered from a Xac genome clone bank and reconfirmed by sequencing. The plasmidial DNA containing the gene and the PIP box from each clone were purified, immobilized onto a nylon membrane (macroarray) and hybridized with [a33P] dCTP-labeled cDNAs synthesized from Xac total RNA isolated from bacteria in non-infecting (grown in NB nutrient medium) and infecting (grown for 12 or 20 hours in XAM1 medium that mimics the environment of the plant intercellular space (“in vitro”) or for 3 or 5 days in orange plant leaves (“in vivo”) conditions. The gene expression profile resulting from the array analysis revealed that 67 genes were differentially expressed during the temporal course of the infection. The results were validated through the analysis of expression profile for some genes using semi-quantitative RT-PCR and the PIP box functionality for some promoters was demonstrated using GUS as reporter gene. The differentially expressed genes were classified regarding the biological function of the encoded protein and related to several relevant processes as type III secretion system, membrane and cellular wall metabolism, iron uptake, sugar metabolism and host cell wall degradation, signal transduction, flagellum metabolism, biofilm formation and adhesiveness, nucleic acid metabolism, membrane transporters, energetic metabolism and stress response. The possible roles of these modifications for the bacteria-plant interaction and disease installation are discussed.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_mariana_almeida_iglesias.pdf: 683600 bytes, checksum: 7c2d99601551e443f9b19dd649609f3f (MD5) Previous issue date: 2014-03-06 / Listeria monocytogenes is a foodborne pathogen that can cause listeriosis, both in humans and in animals. The contamination by this microorganism is difficult to control, given its wide dissemination and physiological adaptability, which allow its development under conditions which are usually unfavorable to other pathogenic bacteria. Therefore, this pathogen has become of concern to the food industry as well as consumers, since it is highly pathogenic, especially in relation to risk group and may be fatal in 30% of cases of listeriosis. Although any isolate of L. monocytogenes can be considered potentially pathogenic for humans, several studies suggest that this micro-organism has a heterogeneous pathogenicity of the strains, which makes it essential to know the gene expression of the pathogen can be understood that the differences in their virulence mechanisms, and how different potential pathogenicity. The present study aimed to verify the occurrence of. L. monocytogenes in slaughterhouses in southern Rio Grande do Sul, and through the isolates, assess their sensitivity to antibiotics, and perform a genotypic characterization by verifying the presence of virulence genes. L. monocytogenes occured in 6% of the samples, detected after bleeding at the point where the collect was held in the leather of the animal, and point 4 (pre-cooling after washing).Twelve isolates were obtained, which were evaluated for sensibility to 15 antimicrobials, of which 100% were susceptible to most antibiotics tested. Resistance to gentamycin (8%), ampicilin (8%), kanamycin (8%) and sulfonamide (83%) were observed in some isolated of L. monocytogenes. Intermediate susceptibility to clindamycin (60%) and erythromycin (8%) was observed, and multidrug-resistant strains were also observed. Proceeded to evaluate the presence of virulence genes (hlyA, plcA, inlA, inlB, inlC, inlJ, plcB, iap, actA, mpl and PrfA) and, through the results of PCR, it was observed that all isolates possessed the evaluated genes, also confirmed the expression of the gene of internalin A by RT-PCR, showing the potential pathogenic strains of L. monocytogenes isolated from food in southern Brazil. / Listeria monocytogenes é um patógeno de origem alimentar capaz de causar listeriose, tanto em humanos como em animais. A contaminação por este micro-organismo é de difícil controle, tendo em vista sua ampla disseminação e capacidade fisiológica de adaptação, as quais permitem seu desenvolvimento sob condições que usualmente são desfavoráveis a outras bactérias patogênicas. Assim sendo, esse patógeno tornou-se motivo de preocupação para a indústria de alimentos bem como para os consumidores, uma vez que é altamente patogênica, principalmente em relação ao grupo de risco, podendo ser fatal em até 30% dos casos de listeriose. Embora qualquer isolado de L. monocytogenes possa ser considerado potencialmente patogênico para humanos, vários estudos sugerem que este micro-organismo apresenta patogenicidade heterogênea, o que torna essencial a caracterização molecular de cada isolado, bem como o conhecimento de sua expressão gênica, para que possam ser entendidas as diferenças nos seus mecanismos de patogenicidade.. Em vista do exposto, o presente estudo objetivou verificar a ocorrência de L. monocytogenes em carcaças bovinas abatidas em dois frigoríficos-matadouros do sul do Rio Grande do Sul e, a partir dos isolados, avaliar sua sensibilidade a antimicrobianos, e realizar a caracterização genotípica, através da verificação da presença de genes de virulência e da expressão da internalina A. A ocorrência de L. monocytogenes nas carcaças foi de 6%, a qual foi detectada no Ponto 1 (após a sangria) e no Ponto 4 (após a lavagem pré-resfriamento). Foram obtidos 12 isolados, os quais foram avaliados quanto a sensibilidade a 15 antimicrobianos, dos quais 100% mostraram-se sensíveis a maioria dos antibióticos testados. Resistência à gentamicina (8%), ampicilina (8%), canamicina (8%) e a sulfonamida (83%) foram observadas em parte dos isolados. Suscetibilidade intermediária foi observada para clindamicina (60%) e eritromicina (8%). Quanto aos isolados multirresistentes, dois deles apresentaram resistência a mais de um agente antimicrobiano. Procedeu-se à avaliação da presença de genes de virulência (prfA, plcA, plcB, hlya, iap, actA, mpl, inlA, inlC e inlJ) e, através dos resultados da PCR, foi possível observar que todos os isolados possuíam os genes avaliados, sendo também confirmada a expressão do gene da internalina A através da técnica de RT-PCR, evidenciando o potencial patogênico das cepas de L. monocytogenes isoladas de alimentos no sul do Brasil.

Les infections à Pseudomonas aeruginosa sont un problème de santé publique important et peu de solutions thérapeutiques sont disponibles face à des souches isolées multi-résistantes. Le séquençage de souches de P. aeruginosa a montré qu'en plus du génome cœur, il existe de nombreux gènes accessoires. La souche PA14 est un isolat clinique hautement virulent, de part la présence de deux îlots de pathogénicité, PAPI-1 et PAPI-2, contribuant de manière individuelle et synergique à la virulence. L'îlot PAPI-1, de 108 kb, est un élément intégratif et conjugatif (ICE), capable de s'auto-transférer à des souches de Pseudomonas par un mécanisme de conjugaison. Le mécanisme de transfert fait intervenir un pilus de type IVb encodé dans l'îlot PAPI-1.Mon travail de thèse a eu pour objectif d'identifier les régulateurs de ce locus pilPAPI-1. Ce travail a montré que ce locus est faiblement exprimé mais qu'il peut être induit par l'ajout d'acide caprique. Par une approche de mutagénèse aléatoire, j'ai démontré qu'il existe au moins deux gènes de fonctions inconnues présents dans PAPI-1 nécessaires à l'activation du locus et au transfert de l'îlot : RL103, qui coderait pour un régulateur transcriptionnel de type Ribbon-Helix-Helix (RHH) et RL102, qui coderait pour une protéine de partitionnement chromosomique. Par une approche transcriptomique, j'ai démontré que ces deux régulateurs sont aussi impliqués dans l'activation de l'expression de plus de 35% des gènes de PAPI-1. Dans leur ensemble, ces résultats ont mis en évidence que RL103 et RL102 sont deux activateurs du transfert de PAPI-1 et ont montré le premier exemple de régulateur de type RHH impliqué dans le transfert d'un ICE. / P. aeruginosa infections have become a serious threat to public health and are very difficult to treat due to the increasingly emergence of strains resistant to all known antibiotics. Sequencing of P. aeruginosa strains showed, that in addition to a conserved core genome, there are variable accessory genes. The PA14 strain is a highly virulent clinical and this is mainly due to two pathogenicity islands, PAPI-1 and PAPI-2, that contribute individually and synergistically to the virulence. The 108 kb PAPI-1 pathogenicity island is an integrative and conjugative element (ICE), capable of self-transferring to any recipient Pseudomonas strain by a conjugative mechanism. The transfer mechanism is mediated by a type IVb pilus, encoded within the PAPI-1 island. My PhD work was aimed to identifying the regulators of this pilPAPI-1 locus. This work showed that this locus is weakly expressed but may be induced by the addition of capric acid. Using a random mutagenesis approach, i have shown that there are at least two genes of unknown function (present in PAPI-1) necessary for activation of the locus pilPAPI-1 and the transfer of the island : RL103, which would encode a Ribbon Helix Helix-like transcriptional regulator and RL102, which would encode a partitioning chromosome protein. Using a transcriptomic approach with microarrays, I demonstrated that these two regulators are also involved in the activation of the expression of more than 35% of PAPI-1 genes. Taken together, these results show that Cpr and RL102 are two activators of the PAPI-1 transfer of PA14 and show the first example of a Ribbon-Helix-Helix transcriptional regulator involved in the transfer of an ICE.

En agriculture, les ravages causés par les champignons pathogènes sont les plus répandus et les plus dommageables. Au cours du développement parasite, ils présentent un besoin en méthionine et cystéine. Notre étude vise à mieux comprendre le rôle clé de la méthionine dans la physiologie du champignon phytopathogène Magnaporthe grisea. Nous sous sommes focalisés sur deux mutants de délétion obtenus par remplacement de gène : le mutant du gène codant pour la méthionine synthase (mutant ΔMS) et celui du facteur de transcription MgMetR (mutant ΔMgMetR). Une étude globale a été entreprise pour chacun des mutants en utilisant les techniques de transcriptome et de métabolome. Les signatures métaboliques des mutants ont été déterminées par HPLC. Le mutant ΔMS est caractérisé par une accumulation d’homocystéine et de SAM et le mutant ΔMgMetR présente une réduction drastique de son taux de glutathion. L’analyse en transcriptome du mutant ΔMS montre un nombre important de gènes différentiellement exprimés. Plusieurs voies métaboliques se sont vues affectées dans le mutant ΔMS : le métabolisme des folates, la biosynthèse des acides aminés et l’homéostasie du fer ont fait l’objet d’une étude particulière. Les premières analyses bioinformatiques du transcriptome du mutant ΔMgMetR ont confirmé le rôle de MgMetR dans le contrôle de l’expression des gènes de la voie d’assimilation du sulfate. L’ensemble de ces résultats a permis de mettre en évidence de nouvelles connections métaboliques et ainsi, facilite la compréhension du métabolisme du champignon phytopathogène M. grisea afin de trouver de nouvelles voies d’étude pour la protection des cultures. / Filamentous fungi cause devastating diseases in agricultural crops. Recent studies highlighted a need for methionine and cysteine during the infectious process. Our goal is to understand the role of methionine biosynthesis in the plant pathogenic model Magnaporthe grisea. To this end, we focused our study on two null mutants for the genes encoding methionine synthase which catalyzes the last step for methionine biosynthesis (ΔMS), and the sulphur regulator MgMetR which controls sulphate assimilation pathway (ΔMgMetR). A global analysis was carried out for each mutant by using transcriptomic and targeted metabolomic approaches. Metabolic signatures were determined by HPLC. ΔMS mutant was characterized by an increase in homocysteine and S-adenosylmethionine levels whereas ΔMgMetR mutant displayed a drastic reduction in glutathione content. Microarray analyses of ΔMS mutant highlighted an important molecular perturbation since 507 to 1565 genes were differentially expressed in ΔMS mutant compared to the wild type strain depending on our experimental conditions (from starvation to excess of methionine). Our analyses focused on different metabolic pathways: folate metabolism, amino acid biosynthesis and iron homeostasis which were subject to molecular and biochemical validations. Microarray analyses of ΔMgMetR mutant confirmed the transcriptional control of the expression of the genes involved in sulphate acquisition and assimilation. The set of results obtained during this work gets insight into new metabolic interplays between methionine biosynthesis and M. grisea general metabolism and reveals new research areas for antifungal molecules with the aim of crop protection.