Secretion is a fundamental process of bacterial microorganisms. It is responsible for diverse functions such as cell-to-cell communication, nutritional up-take, environmental adaptation, physiological responses, and evasion of the immune system of a host. To accomplish the task of secretion, bacteria have evolved multi-protein complexes, known as secretion apparatuses, which span the bacterial membranes serving as a conduit between the interior of bacteria and the extracellular milieu. Francisella tularensis is a Gram negative bacterium capable of growth inside macrophages. Francisella tularensis causes a rare but severe disease known as tularemia. The Francisella pathogenicity island (FPI) is a circa 30-kb genetic region that harbours genes of unknown function implicated in virulence of this organism. Although many of the FPI-encoded protein products do not appear to have any known homologues, some of the FPI proteins show similarity to proteins involved in type VI secretion (T6S) of other bacteria. T6S systems are newly described bacterial virulence factors evolutionarily related to bacteriophages. We have tested the hypothesis the FPI encodes a secretion system. The FPI-encoded secretion system secretes a novel protein, IglC, into the extracellular milieu during broth growth. Systematic deletion mutagenesis determined the contribution of individual FPI genes to intramacrophage growth and secretion. We further characterized the secretion system by determining the subcellular localization of each FPI protein in the bacterial cell. An interaction between two inner membrane proteins, PdpB and DotU, was observed by co-immunoprecipitation, and the stability of PdpB requires DotU. Similarly, an interaction of IglA and IglB was demonstrated. Biochemical and fluorescence microscopy evidence suggest IglC is secreted into macrophages during intracellular localization of bacteria. Finally, a model of the FPI-encoded secretion system is presented. Our experiments provide biochemical, genetic and microscopy evidence that the FPI encodes a secretion system. The analysis of FPI-encoded secretion provides novel insights that may help us understand the role of FPI-encoded secretion in Francisella intracellular growth and virulence.

Francisella tularensis is a highly virulent, intracellular pathogen that causes the disease tularaemia. Francisella species contain a cluster of genes referred to as the Francisella pathogenicity island (FPI). Several genes contained in the FPI encode proteins needed for the intracellular growth and virulence of Francisella tularensis. Pathogenicity determinant protein A (PdpA), encoded by the pdpA gene, is located within the FPI and has been associated with the virulence of Francisella species. The experiments outlined in this dissertation examine the properties of PdpA protein expression and localization as well as the phenotypes of non-polar F. novicida pdpA mutants. Monoclonal antibody detection of PdpA showed that it is a soluble protein that is upregulated in iron-limiting conditions and undetectable in an mglA or mglB mutant background. Deletion of pdpA resulted in a strain that was highly attenuated for virulence in chicken embryos and mice. The ΔpdpA strain was capable of a small amount of intracellular replication but, unlike wild-type F. novicida, remained associated with the lysosomal marker LAMP-1, suggesting that PdpA is necessary for progression from the early phagosome phase of infection. Infection of macrophages with the ΔpdpA mutant generated a host-cell mRNA profile distinct from that generated by infection with wild type F. novicida. The transcriptional response of the host macrophage indicates that PdpA functions directly or indirectly to suppress macrophage ability to signal via growth factors, cytokines and adhesion ligands. Experiments were designed to mutagenize a putative F-box domain within the amino terminus of PdpA. Deletion of amino acids 112-227 created a strain which was impaired in intracellular replication and exhibited severely reduced virulence. However, alanine mutagenesis of key conserved leucine residues required for the interaction of F-box domains with host proteins had no observed effect on bacterial growth in macrophages and did not affect virulence in chicken embryos or mice. Mono and polyubiquitinated proteins associated with both the wild type F. novicida and ΔpdpA bacterial strains early during the infection of J774A.1 macrophages. After 1 hour of infection the wild type strain developed a more intimate association with mono and polyubiquitinated proteins whereas the ΔpdpA strain did not. Inhibition of the host cell proteasome during infection did not affect the intracellular growth of wild type F. novicida. PdpA research concludes by examining the secretion patterns of F. novicida. PdpA was not detected as a surface exposed protein using biotinylation whereas IglA, IglB and IglC were found to be surface exposed in both wild type and ΔpdpA backgrounds. These observations suggest that PdpA is not involved in the assembly or function of the Francisella secretion system. FLAG tagged PdpA protein could not be detected in the TCA precipitated supernatant of broth grown cultures or in the immunoprecipitated cytosol of infected macrophages suggesting that PdpA is not a secreted protein.

Diss. (sammanfattning) Uppsala : Sveriges lantbruksuniv., 2002. / Härtill 4 uppsatser.

Orientador: Antonio Carlos Monteiro / Banca: Odair Aparecido Fernandes / Banca: Luis Garrigós Leite / Resumo: A broca da cana Diatraea saccharalis (Fabricius, 1794) (Lepidoptera: Crambidae) é responsável por grandes prejuízos na cultura da cana-deaçúcar. O controle tem como alvo principal somente a fase de lagarta. No entanto, a eficiência pode ser maior atingindo fases do ciclo da praga mais expostas aos agentes de controle. O objetivo deste estudo foi avaliar a patogenicidade de Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorok. Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. e Isaria farinosa (Holmsk.) Fr. para ovos, lagartas, pupas e adultos de D. saccharalis e avaliar, através da análise de parâmetros biológicos, os efeitos no ciclo de vida da praga. Ovos postos no período de 24 horas, lagartas com 15 dias de desenvolvimento, pupas recém formadas e adultos com 24 horas de vida foram inoculados com os fungos nas concentrações de 108, 107 e 106 conídios mL-1. A viabilidade dos ovos foi afetada significativamente no tratamento com 108 con. mL-1 de M. anisopliae, mas as lagartas sobreviventes não foram afetadas em nenhum outro parâmetro avaliado. M. anisopliae e B. bassiana causaram mortalidade de lagartas principalmente nas concentrações de 108 e 107 con. mL-1, enquanto a viabilidade pupal e o peso de pupas fêmeas formadas a partir de lagartas tratadas foram reduzidos apenas pelos tratamentos com 108 e 107 con. mL-1 de M. anisopliae, respectivamente. I. farinosa não se mostrou patogênico para as fases de ovo e lagarta de D. saccharalis. O tratamento com 108 con. mL-1 de M. anisopliae e B. bassiana produziu 52,0 e 42,0% de mortalidade de pupas, respectivamente, afetando também a viabilidade de pupas e a longevidade de adultos emergidos. A fecundidade destes adultos foi severamente afetada por I. farinosa na concentração 108 con. mL-1 e pelos outros fungos em todas as concentrações avaliadas. Verificou-se grande mortalidade de adultos tratados com todas as concentrações de M. anisopliae... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The sugarcane borer Diatraea saccharalis (Fabricius, 1794) (Lepidoptera: Crambidae) is responsible for high losses in sugarcane. The larval stage is the main target of control. However, the efficiency can be higher by reaching different and more exposed stages with more exposure to the control agents. The aim of this study was to evaluate the pathogenicity of Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorok. Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. and Isaria farinosa (Holmsk.) Fr. to eggs, larvae, pupae and adults of D. saccharalis and to evaluate the effects on pest lifecycle. Eggs with 24 hours, larvae with 15 days of development, newly formed pupae and adults with 24 hours of life were inoculated with fungi at concentrations of 108, 107 and 106 conidia mL-1. The eggs viability was significantly affected in the treatment with 108 con. mL-1 of M. anisopliae, but the survival larvae were not affected in any of the analyzed parameters. M. anisopliae and B. bassiana caused larval mortality mainly at concentrations of 108 and 107 con. mL-1, while pupae viability and female pupal weight formed from treated larvae were reduced only by treatments with 108 and 107 con. mL-1 of M. anisopliae, respectively. I. farinosa wasn't pathogenic to eggs and larvae of D. saccharalis. The treatment with 108 con. mL-1 of M. anisopliae and B. bassiana produced 52.0 and 42.0% pupae mortality respectively, also affecting the pupal viability and the longevity of adults. The fecundity of these adults was severely affected by I. farinosa in the concentration of 108 con. mL-1 and by other fungi in all evaluated concentrations. High mortality of treated adults with all concentrations of M. anisopliae and with 107 con. mL-1 was observed. The longevity and fecundity were not affected by the fungi, and the eggs viability laid by treated females was significantly reduced by treatment with 106 and 108 con. mL-1 of B. bassiana... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Submitted by FLÁVIA CAMPOS FREITAS VIEIRA (flavia.camposfv@yahoo.com.br) on 2018-06-28T14:09:18Z No. of bitstreams: 1 Tese_Flávia_Vieira_2018.pdf: 8871588 bytes, checksum: e1ee1b7f2e2e7170f04d44c1a1e76d6a (MD5) / Approved for entry into archive by Neli Silvia Pereira null (nelisps@fcav.unesp.br) on 2018-06-29T18:42:12Z (GMT) No. of bitstreams: 1 vieira_fcf_dr_jabo.pdf: 8871588 bytes, checksum: e1ee1b7f2e2e7170f04d44c1a1e76d6a (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-29T18:42:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 vieira_fcf_dr_jabo.pdf: 8871588 bytes, checksum: e1ee1b7f2e2e7170f04d44c1a1e76d6a (MD5) Previous issue date: 2018-06-04 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Os citros são um grupo de espécies vegetais, com alto potencial produtivo, porém, acometido por várias doenças. Do gênero de bactérias Xanthomonas, três espécies são patogênicas a citros: Xanthomonas citri subsp. citri, agente causal do cancro cítrico, uma das doenças de maior preocupação da citricultura; X. fuscans subsp. aurantifolii tipos B e C, que causam a cancrose; e X. alfalfae subsp. citrumelonis, responsável por causar a mancha bacteriana dos citros. Diante disso, o objetivo desse trabalho foi a análise e descrição, em nível anatômico e ultraestrutural, dos processos de infecção de bactérias do gênero Xanthomonas, causadoras de doenças em citros, a correlação do fenótipo da interação XfaC-citros com o transcriptoma e a análise dos fatores de virulência das estirpes estudadas. O processo de infecção das estirpes Xac306, Xac636, Xac828, Xacm1510, XfaC1632 e XfaC1630 em lima ácida ‘Galego’ e/ou laranja doce ‘Hamlin’, foi avaliado em diferentes períodos de infecção, pelas técnicas de microscopia de luz e eletrônicas de varredura e transmissão. As seguintes características relacionadas a virulência das estirpes foram avaliadas: formação in vitro de biofilme, produção de goma, motilidade “swimming” e auto agregação celular. Os resultados mostraram que Xac306 é a estirpe mais agressiva dentre as demais, visto pelos sintomas e pela intensidade das alterações anatômicas no tecido de ‘Hamlin’ e ‘Galego’. O processo de infecção em lima ácida ‘Galego’ foi semelhante em todas as estirpes de Xanthomonas estudadas, pois induziram hiperplasia e hipertrofia, porém, em diferentes intensidades, sendo que as alterações provocadas pelas estirpes Xac828 e Xacm1510 não resultaram no rompimento da epiderme; todas as estirpes produziram goma, envolvendo as bactérias e favorecendo a colonização no ambiente intercelular. A microscopia de luz permitiu identificar alterações na anatomia de lima ácida ‘Galego’ infectada e a diferença de susceptibilidade entre as variedades de citros inoculadas com Xac306 e estirpes de XfaC. As microscopias eletrônicas de varredura e transmissão permitiram a identificação de aspectos em comum às estirpes, independente da variedade cítrica. A HR induzida por estirpes de XfaC foi caracterizada pela microscopia eletrônica de transmissão. Com a análise de microscopia, não foi possível estabelecer uma relação direta entre os testes de formação in vitro de biofilme, produção de goma e motilidade “swimming” das estirpes. A análise dos dados de transcriptoma revelou que a resposta de defesa de laranja ‘Hamlin’ contra XfaC foi uma resposta rápida e eficiente que levou a indução de HR, que em última instância, conteve a infecção pela morte celular programada no local da infecção. Esse trabalho ampliou o conhecimento da área sobre o comportamento de diferentes estirpes de Xanthomonas causadoras de doenças em citros, fornecendo informações sobre sua interação com o hospedeiro suscetível e a resposta de defesa de XfaC em interação incompatível. / Citrus are a diverse group of plant species, with high yield potential, but affected by several diseases. The bacteria genus Xanthomonas has three species pathogenic to citrus: Xanthomonas citri subsp. citri, causal agent of citrus canker, one of the most important diseases of citrus crop; X. fuscans subsp. aurantifolii types B and C, causing citrus cancrosis; and X. alfalfae subsp. citrumelonis, which causes citrus bacterial spot. Therefore, the goal of this work was to analyze and describe, at the anatomical and ultrastructural level the infectious processes of Xanthomonas causing diseases in citrus, the correlation of the XfaC-citrus interaction phenotype with the transcriptome and the comparative analysis of virulence related factors, in order to elucidate morphophysiological traits of host-pathogen interaction. The infection process of Xac306, Xac636, Xac828, Xacm1510, XfaC1632 and XfaC1630 strains in 'Galego' Mexican lime and 'Hamlin' sweet orange were evaluated at different points of infection by light microscopy and scanning and transmission electron microscopy. The following virulence related characteristics of the strains were evaluated: in vitro biofilm formation, gum production, swimming motility and cellular auto aggregation. The results showed that Xac306 is the most aggressive strain among the others, due to the intensity of the symptoms and anatomical alterations in 'Hamlin' and 'Galego' tissue. The infection process in the susceptible host ('Galego' Mexican lime) was similar for all Xanthomonas strains studied, since they induced hyperplasia and hypertrophy, however in different intensities, and the alterations caused by Xac828 and Xacm1510 strains did not result in epidermis rupture; all strains produce gum, involving bacteria and assisting colonization in the intercellular environment. Light microscopy was able to identify anatomical alterations in 'Galego' Mexican lime infected tissue and the susceptibility differences between citrus varieties inoculated with Xac306 and XfaC strains. The scanning and transmission electron microscopies was able to identify common traits to the strains, regardless of the citrus variety. The HR induced by XfaC strains was characterized by transmission electron microscopy. We could not stablish a direct relation between the in vitro biofilm formation, gum production and "swimming" motility of the strains with the microscopy analysis. The transcriptome analysis revealed that 'Hamlin' defense response against XfaC is a quick and effective response that led to an HR induction, which ultimately contained the infection, by programmed cell death at the site of infection. This work expanded our knowledge about the behavior of different Xanthomonas strains causing citrus diseases, providing information on its interaction with the susceptible host and the defense response of XfaC in an incompatible interaction.

O herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1) é um dos principais agentes causadores de prejuízos econômicos em criações de bovinos. A vacinação tem sido amplamente utilizada para minimizar as perdas causadas por infecções pelo BoHV-1. Dentre as vacinas disponíveis, as vacinas desenvolvidas a partir de amostras virais recombinantes apresentam a vantagem de permitirem a diferenciação entre animais infectados e imunizados. Anteriormente, foi desenvolvida uma vacina recombinante diferencial com uma amostra de BoHV-1 brasileira baseada na deleção do gene que codifica a glicoproteína E (gE). No primeiro capítulo do presente trabalho, a segurança e imunogenicidade desta vacina recombinante inativada foi avaliada. Os experimentos de imunização, desafio e reativação da vacina diferencial em animais experimentalmente inoculados demonstraram que a vacina recombinante foi segura e eficiente ao minimizar ou mesmo prevenir os efeitos da infecção pelo BoHV-1. No segundo capítulo, a segurança da vacina gE- foi avaliada, através da imunização intramuscular (IM) de 22 vacas (14 BoHV-1 soronegativas e 8 soropositivas) prenhes. Foi observada soroconverão, mas não abortos e nem anormalidades fetais nos animais imunizados. Na segunda parte do mesmo estudo foi analizada a capacidade do vírus recombinante difundir-se em um rebanho bovino. Quatro terneiros foram inoculados pela rota intranasal (IN) com a amostra recombinante gE- e, posteriormente, adicionados a outros 16 animais com mesma idade e semelhante condição corporal durante 180 dias. Todos os animais foram monitorados diariamente em busca de sintomatologia clínica. Foi observada soroconversão apenas nos animais imunizados. Estes resultados indicam que, nas condições deste estudo, a amostra recombinante não causou nenhum dano nas vacas prenhes ou em seus terneiros e não foi capaz de difundir-se horizontalmente no rebanho. No terceiro capítulo foi avaliada a patogenicidade de uma amostra recombinante de BoHV-1 com deleção no gene Us9, utilizando coelhos como modelo experimental. Coelhos com quatro semanas de idade foram divididos em quatro grupos (A, B, C, D). Dois grupos (A e B) foram infectados via intranasal (IN) e dois (C e D) infectados via intraocular (IO). Em cada via de infecção, um grupo foi infectado com o vírus recombinante e o outro com o vírus selvagem (wt). Após a infecção IO, todos os animais, de ambos os grupos, desenvolveram intensa conjuntivite entre os dias 3 a 10 pós-inoculação (pi). Vírus infeccioso foi consistentemente isolado a partir dos suabes oculares entre os dias 1 a 10 pi chegando a um título máximo de 103,05 TCID50/mL. Nos grupos infectados pela via IN com BoHV-1 wt, 4/4 coelhos apresentaram sintomatologia característica da doença, tais como: pirexia, apatia, anorexia, tosse, secreção nasal severa (entre os dias 2 e 8 pi). Animais inoculados com o recombinante apresentaram apatia, anorexia e descarga nasal (entre os dias 3 e 7 pi). Vírus infeccioso foi isolado em diversos tecidos tanto nos animais inoculados com o vírus wt como recombinante. Ambos os vírus foram capazes de replicar nas mucosas. Análises histológicas dos tecidos dos animais demonstraram lesões em ambos os grupos. Este estudo apresentou que a proteína Us9 não tem um papel significante na patogenicidade in vivo. / Bovine herpesvirus type 1 (BoHV-1) is an the major cause of losses in cattle. Vaccination has been widely applied to minimize losses induced by BoHV-1 infections. Vacines developed from recombinant strains have the advantage of allow the differentiation between immunized and infected animals. Previously, a recombinant differential BoHV-1 vaccine based on a glycoprotein E deleted (gE) virus was developed. In the first chapter of the present work, the safety and immunogenicity of such recombinant, as a inactivate vaccine, was evaluated. The experiments showed that the DIVA vaccinne was safe and efficient in order to minimize or even prevent the clinical signs of the infection by BoHV- 1. In the second chapter of the present study, the safety of the gE- vaccine during pregnancy was evaluated by the intramuscular inoculation into 22 pregnant dams (14 BoHV-1 seronegative; 8 seropositive). Seroconversion was detected but no abortions, stillbirths or fetal abnormalities were seen after vaccination. In the second part of the same study, the potential of the gE- vaccine virus to spread among beef cattle under field conditions was examined. Four heifers were inoculated intranasally (IN) with the gE- vaccine and mixed with other 16 animals at the same age and body conditions, for 180 days. All animals were daily monitored for clinical signs.. Seroconversion was observed only in vaccinated heifers. These results indicate that, under the conditions of the present study, the gE vaccine virus did not cause any noticeable harmful effect on pregnant dams and on its offspring and did not spread horizontally among cattle. In the third chapter the pathogenicity of a US9 negative recombinant strain BoHV-1 using rabbits as an experimental model was avaluated. Rabbits four weeks old were divided in four groups (A, B, C, D) within four rabbits per group. Two groups were infected IN route and two via intraocular (IO). In each route, one group was infected by recombinant virus and the other infected by wild type (wt) virus. After IO infection, all rabbits developed intense conjunctivitis between days 3 to 10 pos infection (pi). Infective virus was consistently isolated from ocular swabs on days 1 to 10, reaching a maximum of 103.05 TCID50/mL. Animals infected in the IN rote with BoHV-1 wt, 4/4 rabbits showed characteristic signs of disease, which included pyrexia, apathy, anorexia, cough, severe nasal secretion between days 2 to 8. Rabbits inoculated with recombinant virus showed apathy, anorexia, nasal secretion (between days 3 and 7pi). Infectious virus was isolated in differents tissues as much as animals inoculated with wt and recombinant virus. Both virus were capable of replication in the mucosa nasal and ocular of the inoculated rabbits. Histopatological lesions were evident in both groups. In the present study showed which the US9 protein have not significantly in the pathogenicity in vivo.

E. coli Patogênicas Aviárias (APEC) são uma das causas de doenças extra-intestinais em aves, as quais trazem grande prejuízo econômico para o setor avícola mundial. Os avanços nas pesquisas vêm aumentando o entendimento dos mecanismos de patogenicidade das APEC, demonstrando a grande importância da interação dos diversos fatores de virulência na determinação da sua patogenicidade. Redes Neurais Artificiais (RNAs) têm mostrado ser uma poderosa ferramenta para uma vasta gama de aplicações. Neste trabalho, o foco na aplicação da RNA é na predição (0 a 10) da patogenicidade de amostras APEC. Em 489 isolados APEC foram analisados a presença de 38 genes associados a virulência, o Índice de Patogenicidade (IP) in vivo e a motilidade das amostras. Duas RNAs foram construídas utilizando o software Neuroshell Classifier 2.1 (Ward Systems Group, Inc., Frederick, MD, USA) em duas fases distintas: treinamento e validação. Utilizou-se como camada de entrada, informações sobre a presença ou ausência dos 38 genes de virulência e a motilidade de cada uma das amostras, com uma camada de saída formada pelo IP in vivo previamente determinado. As RNAs construídas apresentaram uma classificação correta acima de 90%, sendo que a rede 1 apresentou uma classificação de 91,62 e a rede 2 de 99,03%. A rede 2 obteve uma especificidade superior a 99,64% em todas as categorias e uma sensibilidade superior a 92,86%. Isso demonstra que o método aqui proposto, revelou ser uma ótima ferramenta de suporte às decisões de médico veterinário, descartando no futuro a inoculação de animais. / Avian Pathogenic Escherichia coli (APEC) are one of the causes of extraintestinal diseases in birds, and cause considerable economic losses to the poultry industry worldwide. Advances in research have increased understanding of pathogenic mechanisms of APEC, and have demonstrated the importance of the interaction of several virulence factors in determining their pathogenicity. Artificial Neural Networks (ANN) have shown to be a powerful tool for a wide range of applications. In this paper, the focus on neural network applications in the prediction (index of 0-10) of the pathogenicity of isolates APEC. In 489 APEC isolates were analyzed: 38 virulenceassociated genes, the Pathogenicity Index (PI) in vivo and motility of the strains. Two ANNs were constructed using the software Neuroshell Classifier 2.1 (Ward Systems Group, Inc., Frederick, MD, USA) in two distinct phases: training and validation. We used as input layer, information about the presence or absence of the 38 virulenceassociated genes and the motility of each of the samples, with an output layer formed by a previously-determined PI in vivo. The ANNs showed a correct classification of the PI above of 90%, being that the network 1 had a rating of 91.62% and the network 2 of 99.03%. The network 2 obtained a specificity of over 99.64% and sensitivity greater than 92.86% in all categories. This demonstrates that the method proposed here has proven to be a great decision support tool for the veterinarian, thereby dispensing the inoculation of animals in the future.

A bactéria Escherichia coli é responsável por perdas econômicas significativas mundialmente, incluindo-se aquelas que ocorrem na produção avícola. O controle e a prevenção da colibacilose aviária são complexos, pois envolve a distinção de isolados que comumente habitam o trato gastrointestinal das aves daquelas consideradas patogênicas. Embora tenha sido assumido que a maioria dos isolados não possui potencial zoonótico, estudos recentes têm sugerido que isolados isoladas de humanos e de aves poderiam compartilhar o maquinário genético necessário para causar a doença no hospedeiro. Desta forma, os animais de produção poderiam atuar como reservatórios de estirpes potencialmente patogênicas para humanos. O objetivo deste trabalho foi realizar a caracterização molecular em grupos filogenéticos de E. coli isoladas de aves (APEC) e de humanos (UPEC) e propor um futuro acompanhamento da flutuação da patogenicidade dos isolados APEC em planteis avícolas. Foram selecionadas 450 isolados UPEC e 460 APEC para classificação em quatro grupos filogenéticos (A, B1, B2 e D) através de um protocolo de multiplex-PCR. Estes resultados foram comparados com a presença ou ausência de 38 genes associados à virulência e com o índice de patogenicidade in vivo estabelecido para cada isolado em estudo anterior. Em relação aos isolados APEC, 31,1% foram classificadas no grupo D, 25,2% no grupo B2, 24,1% no grupo B1 e 19,6% no grupo A. Entre os isolados UPEC, 53,6% das foram classificadas no grupo B2, 25,3% no grupo D, 15,1% no grupo A e apenas 6,0% no grupo B1. Os isolados virulentos geralmente classificam-se no grupo B2, porém algumas podem ser classificadas no grupo D. Enquanto que os isolados comensais em geral pertencem aos grupos A e B1. Observou-se associação entre determinados genes e os grupos filogenéticos, tanto para isolados APEC quanto UPEC. Observou-se diferença significativa entre os índices de patogenicidade conforme a fonte de isolamento, sendo que os isolados de lesões apresentaram os maiores índices. Também foi observada uma associação direta entre os índices de patogenicidade obtidos in vivo e os grupos filogenéticos. Os isolados do grupo B2 e D apresentaram maiores índices em relação aos isolados B1 e A. Uma vez que a distribuição dos isolados APEC nos grupos filogenéticos apresentou associação significativa com a patogenicidade, o multiplex-PCR torna-se uma importante ferramenta disponível para o screening da patogenicidade das amostras isoladas na cadeia avícola. / Escherichia coli is responsible for significant economic losses, including those occurring in poultry production. The control and prevention of avian colibacillosis are complex because it involves the distinction of pathogenic strains and those that are commonly found in the gastrointestinal tract flora of health birds. Although it has been assumed that most strains do not have zoonotic potential, recent studies have suggested that strains isolated from humans and poultry could share the genetic machinery needed to cause the disease in the host. Therefore, production animals could act as reservoirs of strains potentially pathogenic to humans. The aim of this study was to carry out the molecular characterization in phylogenetic groups of strains of E. coli isolated from poultry (APEC) and humans (UPEC), and to propose a future monitoring of the pathogenicity of APEC strains in poultry farms. A total of 450 UPEC and 460 APEC strains were selected for classification into four phylogenetic groups (A, B1, B2 and D) using a multiplex-PCR protocol. These results were compared with the presence or absence of 38 virulence-associated genes and the in vivo pathogenicity index established for each strain in a previous study. Regarding the APEC strains, 31.1% were classified in group D, 25.2% in group B2, 24.1% in group B1 and 19.6% in group A. Among the UPEC strains, 53.6% were classified in group B2, 25.3% in group D, 15.1% in group A and only 6.0% in group B1. Virulent strains are generally classified in group B2, but some may be classified in group D. While commensal isolates generally belong to groups A or B1. It was observed an association between certain genes and phylogenetic groups, both for APEC and UPEC strains. A significant difference was observed among pathogenicity indices according to the source of isolation, and the strains isolated from lesions presented the highest indices. A direct association between pathogenicity indices obtained in vivo and phylogenetic groups was also observed. Strains of groups B2 and D showed higher indices compared to strains from B1 and A. Since the distribution of APEC strains in phylogenetic groups showed a significant association with pathogenicity, multiplex-PCR becomes an important tool available for screening pathogenicity of the isolated samples in the poultry chain.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The native forest specie Cedrela fissilis Vell. had its population reduced because of the extraction of its wood. The worry of its extinction has been favoring researches related with the specie perpetuation, including those which involve seeds quality. However, there is little knowledge about the pathogens which could contribute to the low germination or other problems in adult individuals. This research has the objective to evaluate the physiological and sanitary quality of C. fissilis seeds, from different places of the south of Brazil. The vigor was evaluated with different tests, the sanitary with two methods of detection and transmission of fungi by seeds, pathogenicity of fungi isolated from the seeds and seeds treatment. The vigor tests showed that the seeds from different places had different physiological potentials. Both of detection methods were efficient to identify the most of the fungi found in the seeds. Some of the fungi were identified on high incidences and in both tests: Penicillium sp., Pestalotia sp., Phomopsis sp. and Rhizoctonia sp. This last one and Fusarium sp. were transmitted by seeds. One of the Rhizoctonia sp. isolates was pathogenic, causing roots rotting, and damping-off. The seeds treatment with garlic extract (Allium sativum) and physical treatment (70°C for 48 hours) could be use to reduce the fungi incidence or to eliminate these, respectively. For the treatment of inoculated and noninoculated seeds with Rhizoctonia sp., the combination of biological (Thichoderma spp.) and chemic treatments was efficient to reduce the incidence of most of fungi, including that which was inoculated in the seeds. / O cedro (Cedrela fissilis) é uma espécie florestal nativa, cuja população foi reduzida em função da extração de sua madeira. A preocupação com sua extinção vêm favorecendo pesquisas relacionadas à perpetuação da espécie, dentre estas, aquelas envolvendo a qualidade de suas sementes. Porém, pouco se sabe sobre patógenos que podem estar contribuindo para a baixa germinação de sementes, ou para problemas futuros em indivíduos já estabelecidos. Diante disto, este trabalho tem como objetivo geral avaliar a qualidade fisiológica e sanitária de sementes de cedro, procedentes de diferentes localidades dos estados do sul do Brasil. Avaliou-se o vigor destas sementes, através de diferentes testes; a qualidade sanitária, por dois métodos de detecção e teste de transmissão; a patogenicidade de fungos isolados de sementes; e o efeito de diferentes tratamentos. Os testes de vigor demonstraram que as sementes possuíam diferentes potenciais fisiológicos, dependendo da procedência. Ambos os testes de detecção utilizados, foram eficientes para a maioria dos fungos associados às sementes de cedro. Alguns fungos ocorreram em altas incidências, em ambos os testes: Penicillium sp., Pestalotia sp., Phomopsis sp. e Rhizoctonia sp., sendo este e Fusarium sp., os únicos transmitidos via sementes. A patogenicidade, realizada com isolados de Rhizoctonia sp. identificou um isolado patogênico, provocando apodrecimento de raízes e colo, e posterior tombamento. Os tratamentos de sementes com extrato de alho (Allium sativum) e tratamento físico (estufa a 70°C por 48 horas) são promissores para a redução da incidência de fungos ou mesmo erradicação de alguns deles, respectivamente. Tratamentos com sementes inoculadas e não-inoculadas com Rhizoctonia sp. demonstraram que a combinação de produto biológico, à base de Trichoderma spp. (Agrotrich Plus®), mais um fungicida protetor (Captan) é eficiente para redução de patógenos, incluindo àquele inoculado nas sementes.

O herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1) é um dos principais agentes causadores de prejuízos econômicos em criações de bovinos. A vacinação tem sido amplamente utilizada para minimizar as perdas causadas por infecções pelo BoHV-1. Dentre as vacinas disponíveis, as vacinas desenvolvidas a partir de amostras virais recombinantes apresentam a vantagem de permitirem a diferenciação entre animais infectados e imunizados. Anteriormente, foi desenvolvida uma vacina recombinante diferencial com uma amostra de BoHV-1 brasileira baseada na deleção do gene que codifica a glicoproteína E (gE). No primeiro capítulo do presente trabalho, a segurança e imunogenicidade desta vacina recombinante inativada foi avaliada. Os experimentos de imunização, desafio e reativação da vacina diferencial em animais experimentalmente inoculados demonstraram que a vacina recombinante foi segura e eficiente ao minimizar ou mesmo prevenir os efeitos da infecção pelo BoHV-1. No segundo capítulo, a segurança da vacina gE- foi avaliada, através da imunização intramuscular (IM) de 22 vacas (14 BoHV-1 soronegativas e 8 soropositivas) prenhes. Foi observada soroconverão, mas não abortos e nem anormalidades fetais nos animais imunizados. Na segunda parte do mesmo estudo foi analizada a capacidade do vírus recombinante difundir-se em um rebanho bovino. Quatro terneiros foram inoculados pela rota intranasal (IN) com a amostra recombinante gE- e, posteriormente, adicionados a outros 16 animais com mesma idade e semelhante condição corporal durante 180 dias. Todos os animais foram monitorados diariamente em busca de sintomatologia clínica. Foi observada soroconversão apenas nos animais imunizados. Estes resultados indicam que, nas condições deste estudo, a amostra recombinante não causou nenhum dano nas vacas prenhes ou em seus terneiros e não foi capaz de difundir-se horizontalmente no rebanho. No terceiro capítulo foi avaliada a patogenicidade de uma amostra recombinante de BoHV-1 com deleção no gene Us9, utilizando coelhos como modelo experimental. Coelhos com quatro semanas de idade foram divididos em quatro grupos (A, B, C, D). Dois grupos (A e B) foram infectados via intranasal (IN) e dois (C e D) infectados via intraocular (IO). Em cada via de infecção, um grupo foi infectado com o vírus recombinante e o outro com o vírus selvagem (wt). Após a infecção IO, todos os animais, de ambos os grupos, desenvolveram intensa conjuntivite entre os dias 3 a 10 pós-inoculação (pi). Vírus infeccioso foi consistentemente isolado a partir dos suabes oculares entre os dias 1 a 10 pi chegando a um título máximo de 103,05 TCID50/mL. Nos grupos infectados pela via IN com BoHV-1 wt, 4/4 coelhos apresentaram sintomatologia característica da doença, tais como: pirexia, apatia, anorexia, tosse, secreção nasal severa (entre os dias 2 e 8 pi). Animais inoculados com o recombinante apresentaram apatia, anorexia e descarga nasal (entre os dias 3 e 7 pi). Vírus infeccioso foi isolado em diversos tecidos tanto nos animais inoculados com o vírus wt como recombinante. Ambos os vírus foram capazes de replicar nas mucosas. Análises histológicas dos tecidos dos animais demonstraram lesões em ambos os grupos. Este estudo apresentou que a proteína Us9 não tem um papel significante na patogenicidade in vivo. / Bovine herpesvirus type 1 (BoHV-1) is an the major cause of losses in cattle. Vaccination has been widely applied to minimize losses induced by BoHV-1 infections. Vacines developed from recombinant strains have the advantage of allow the differentiation between immunized and infected animals. Previously, a recombinant differential BoHV-1 vaccine based on a glycoprotein E deleted (gE) virus was developed. In the first chapter of the present work, the safety and immunogenicity of such recombinant, as a inactivate vaccine, was evaluated. The experiments showed that the DIVA vaccinne was safe and efficient in order to minimize or even prevent the clinical signs of the infection by BoHV- 1. In the second chapter of the present study, the safety of the gE- vaccine during pregnancy was evaluated by the intramuscular inoculation into 22 pregnant dams (14 BoHV-1 seronegative; 8 seropositive). Seroconversion was detected but no abortions, stillbirths or fetal abnormalities were seen after vaccination. In the second part of the same study, the potential of the gE- vaccine virus to spread among beef cattle under field conditions was examined. Four heifers were inoculated intranasally (IN) with the gE- vaccine and mixed with other 16 animals at the same age and body conditions, for 180 days. All animals were daily monitored for clinical signs.. Seroconversion was observed only in vaccinated heifers. These results indicate that, under the conditions of the present study, the gE vaccine virus did not cause any noticeable harmful effect on pregnant dams and on its offspring and did not spread horizontally among cattle. In the third chapter the pathogenicity of a US9 negative recombinant strain BoHV-1 using rabbits as an experimental model was avaluated. Rabbits four weeks old were divided in four groups (A, B, C, D) within four rabbits per group. Two groups were infected IN route and two via intraocular (IO). In each route, one group was infected by recombinant virus and the other infected by wild type (wt) virus. After IO infection, all rabbits developed intense conjunctivitis between days 3 to 10 pos infection (pi). Infective virus was consistently isolated from ocular swabs on days 1 to 10, reaching a maximum of 103.05 TCID50/mL. Animals infected in the IN rote with BoHV-1 wt, 4/4 rabbits showed characteristic signs of disease, which included pyrexia, apathy, anorexia, cough, severe nasal secretion between days 2 to 8. Rabbits inoculated with recombinant virus showed apathy, anorexia, nasal secretion (between days 3 and 7pi). Infectious virus was isolated in differents tissues as much as animals inoculated with wt and recombinant virus. Both virus were capable of replication in the mucosa nasal and ocular of the inoculated rabbits. Histopatological lesions were evident in both groups. In the present study showed which the US9 protein have not significantly in the pathogenicity in vivo.