Submitted by Daniella Sodre (daniella.sodre@ufpe.br) on 2015-04-17T15:34:56Z No. of bitstreams: 2 TESE Wagner Oliveira.pdf: 1211878 bytes, checksum: 2511da52ea7b930ceb06c98d5e740455 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-17T15:34:56Z (GMT). No. of bitstreams: 2 TESE Wagner Oliveira.pdf: 1211878 bytes, checksum: 2511da52ea7b930ceb06c98d5e740455 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2013-02-26 / FACEPE; CNPq / Os estafilococos fazem parte da microflora da pele e mucosa humana e podem se comportam como patógenos oportunistas. Staphylococcus aureus é a espécie responsável por grande número de infecções principalmente em ambiente hospitalar devido à diversidade de fatores de virulência que abriga. Staphylococcus Coagulase Negativo (SCN) vem se destacando como patógeno principalmente associado a colonização de biomateriais utilizados em procedimentos médicos. Como agravante essas bactérias têm capacidade de adquirir mecanismos de resistência aos antimicrobianos. Neste trabalho analisamos mecanismos de patogenicidade (produção de biofilme e presença de genes toxigênicos) e resistência à meticilina (classificação do cassete SCCmec e produção de PBP2a) em Staphylococcus spp. de infecções nosocomiais de um hospital universitário da cidade de Recife, Pernambuco, Brasil. A maioria das amostras de S. aureus e SCN revelaram-se icaAD positivas e produtoras de biofilme no meio Agar Vermelho Congo-AVC. O loco hlgCB que codifica a γ-toxina foi encontrado em 42/45 (93,9%) S. aureus e 24/49 (49%) SCN; lukSF que codifica a leucocidina de Panton-Valentine-PVL, em 13/45 (28,9%) S. aureus e 06/49 (12%) SCN; e tst que codifica a toxina da síndrome do choque tóxico-TSST-1, foi encontrada em três das 45 amostras de S. aureus e uma das 49 amostras de SCN analisadas. Sessenta e oito dos 84 isolados analisados foram classificados nos seguintes tipos de SCCmec: SCCmec tipo II (17%), SCCmec tipo III (26%), SCCmec tipo IV (34,5%) e SCCmec tipo V (3,5%); em 19% dos isolados o tipo do SCCmec não foi determinado e nomeados como SCCmec Não Definido (ND). 61% da população estudada revelou-se resistente à oxacilina e 39% sensível nos testes de Concentração Inibitória Mínima (CIM) e MHA suplementado com oxacilina e a presença da PBP2a foi detectada por Western blot com antissoro anti-PBP2a em 76% dos isolados. Em conclusão foram encontrados os genes da γ-toxina e da leucocidina de Panton-Valentine e do gene do choque tóxico em SCN. A presença de genes toxigênicos e genes associados epidemiologicamente com cepas da comunidade, em cepas nosocomiais de SCN, sugere transferência horizontal de genes e representa um importante incremento do potencial patogênico dos SCN no ambiente hospitalar. Foi demonstrado que a presença dos genes icaAD não está diretamente associada a formação de biofilme em testes fenotípicos (AVC e PCT), embora o meio AVC seja mais eficaz nessa determinação que o teste em PCT, principalmente se otimizado pela substituição de componentes na sua formulação (meios básicos e fonte de açúcar) e no inóculo (suplementação com glicose e NaCl). A diversidade de elementos SCCmec e a ocorrência de linhagens clonais associadas epidemiologicamente com a comunidade em ambiente hospitalar sugere que isolados de SCN podem atuar como reservatórios de elementos SCCmec contribuindo para emergência de novos clones meticilina resistentes e corrobora com a dissolução da classificação de cepas comunitárias e nosocomiais.

Regulation of penicillin-binding protein Pbp2a in Streptococcus pneumoniae Streptococcus pneumoniae is an extracellular human pathogen that encodes a unique eukaryotic-type Ser/Thr protein kinase StkP in its genome. This enzyme is involved in other cellular processes, such as cell division and cell wall synthesis, through phosphorylation with its substrates. A transmembrane protein MacP has been identified as a substrate of StkP. It is an activator of penicillin-binding protein PBP2a, which is involved in the synthesis of peptidoglycan with its transpeptidase and transglycosylase activities. We found that MacP is phosphorylated by the protein kinase StkP at positions T32 and T56. We confirmed that proteins MacP and PBP2a interact with each other and that phosphoablative and phosphomimetic mutations of the major phosphorylated residues of the MacP protein do not affect the interaction with PBP2a and do not fundamentally affect the function of MacP in vivo. Furthermore, we showed that the ∆macP mutation is synthethically lethal with the ∆pbp1a mutation, confirming that MacP is an activator of the PBP2a protein. MacP is located in the cell septum and interacts with a number of S. pneumoniae cell division proteins. Keywords: Streptococcus pneumoniae, cell division, MacP, PBP2a, phosphorylation

Submitted by Priscila Nascimento (pnascimento@icict.fiocruz.br) on 2012-12-13T12:38:59Z No. of bitstreams: 1 marne-chagas.pdf: 1100888 bytes, checksum: 7a199f01e03cd65e615b7c57af7901f0 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-12-13T12:38:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 marne-chagas.pdf: 1100888 bytes, checksum: 7a199f01e03cd65e615b7c57af7901f0 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / O surgimento de resistência a antimicrobianos em bactérias está se agravando ano após ano, constituindo-se um problema de saúde pública em hospitais e centros de tratamento ao redor do mundo. No Brasil, a resistência a meticilina em Staphylococcus aureus(MRSA) chega a 29 % dos casos detectados anualmente. Atualmente, a metodologia convencional para a identificação de MRSA pode levar 48 horas, portanto, este trabalho tem por objetivo o desenvolvimento de um teste para diagnóstico rápido baseado na tecnologia de imunocromatografia de fluxo lateral usando um anticorpo específico contra a proteína PBP2a, a qual confere resistência ao Staphylococcus aureus, permitindo a identificação em minutos, a partir de colônias isoladas. O anticorpo monoclonalanti-PBP2a foi purificado e empregado em um processo de conjugação a microesferas de látex coloridas para a implementação do teste rápido. Os resultados iniciais demonstraram a capacidade do anticorpo de reconhecer a PBP2a em amostras de MRSA, porém foram observados problemas de inespecificidade que deverão ser solucionados para dar confiabilidade ao teste proposto. / The emergence of antibiotic resistance in bacteria is getting worse year after year, becoming a public health problem in hospitals and treatment centers around the world. In Brazil, methicillin resistance in Staphylococcus aureus(MRSA) reaches 29% of cases detected annually. Currently, the conventional methodology for identification of MRSA may take 48 hours of lengthyphenotypical tests, so this work aims at developing a rapid diagnostic test based onthe lateral flow immunochromatography protocol using a specific antibody against the protein PBP2a, which confers the methicillin-resistance phenotype to Staphylococcus aureus, allowing a prompt identification from isolated colonies. The monoclonal antibody anti-PBP2a was purified and used in a process of conjugation to colored latex microspheres for the implementation of the rapid test. Initial results demonstrated the ability of the antibody to recognize the PBP2a in samples of MRSA, but inespecificity issues will have to be solved to improve reliability of the test proposed.

The aim of the thesis was to develop an immunoassay for the detection of dangerous bacterial pathogen, methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). MRSA infections cause global problems in health facilities which provide acute and follow-up care in inpatient and outpatient parts. That is why early and rapid diagnosis and targeted thereapies are very important for the subjects. E. coli was purified using the QIAquick PCR kit Purificatin isolated bacterial constructs, which were subsequently purified and dialyzed. The recombinant protein PBP2a in different concentrations was applied to a nitrocellulose membrane in the form of lines. Furthermore was performed optimized blot-line method for the detection of specific antibodies against the recombinant antigen PBP2a in the classes IgG, IgA and IgM. Several different concentrations of the conjugate Goat Anti-human IgG-AP, Goat Anti-human IgA-AP or Goat anti-Human IgM-AP were used for the detection. The color intensity of each line of the strip was evaluated with Immunoblot software. The measured values were used to determine diagnostic sensitivity, specificity and overall diagnostic match. Further testing of precision was carried out under repeatability conditions (intra-assay) and reproducibility (inter-assay). Precision of the method was expressed by coefficient of variation. As the most suitable for the manufacture of a IgG kit was determined the concentration of the antigen PBP2a from 0.30 mg/ml to 0.45 mg/ml and the concentration of IgG conjugate from 1:1500 to 1:1800. For class IgA as the most appropriate antigen was determined concentration PBP2a from 0.40 mg/ml to 0.52 mg/ml and conjugate concentrations of IgA from 1:500 to 1:1000. The coefficient of variation under repeatability conditions for the entire range of the IgG class is 10.09 %, and for IgA is 8.91 %. Variation coefficient reproducibility conditions for the entire range of the IgG class is 9.23 % and for IgA is 9.60 %. Precision of the method under conditions of repeatability and reproducibility for classes IgG and IgA meets the criteria for the manufacture of a diagnostic kit. Titration results showed that particular batch of cards made of nitrocellulose membrane coated with antigen PBP2a must always be verified on the panel of reference samples and the values of concentrations (for both antigen and conjugate) should be set according to the needs, but differently for the class of immunoglobulins IgG and IgA.

Submitted by Priscila Nascimento (pnascimento@icict.fiocruz.br) on 2012-11-28T19:21:24Z No. of bitstreams: 1 rodrigo-muller.pdf: 1238864 bytes, checksum: 6c267fda3ccb992508b5424e77147783 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-28T19:21:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 rodrigo-muller.pdf: 1238864 bytes, checksum: 6c267fda3ccb992508b5424e77147783 (MD5) Previous issue date: 2009 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / As infecções causadas por Staphylococcus aureusresistentes à meticilina (MRSA) são temidas em virtude da dificuldade de seu tratamentoe da elevada morbidade associada. A PBP2a (penicillin binding protein 2a), enzima responsável pela síntese da parede celular em MRSA, apresenta baixíssima afinidade porbeta-lactâmicos. Pelo fato de a PBP2a estar localizada na superfície externa, a mesma seria acessível ao sistema imune. Durante as infecções causadas por MRSA, pouco se sabe se o hospedeiro infectado ou colonizado desenvolve anticorpos anti-PBP2a e se osmesmos seriam protetores ou não. O presente projeto tem por finalidade avaliar a presença e níveis de anticorpos anti-PBP2a em um grupo de 56 pacientes colonizados por MRSA e investigar se estes anticorpos seriam protetores ou não. Os resultados gerados permitiram observar que 71% das amostras analisadas apresentaram anticorposanti-PBP2a pelo teste ELISA. Estas amostras foram submetidas à Western blot paraconfirmação, demonstrando que 46% das amostras possuíram anticorpos anti-PBP2a. Após estes resultados, as amostras positivas foram submetidas à purificação para avaliar a cinética de crescimento de MRSA. Foi observado que houve ligeira redução do crescimento bacteriano entre amostras de soro com anticorpos MRSA comparadas comas de soro com anticorpos anti-MSSA (PBP2a negativos). Por conseguinte avaliamos a curva de crescimento de MRSA em presença de imunoglobulinas purificadas de soro de pacientes colonizados por MRSA, (quantificação bacteriana). Observamos que houve uma redução drástica do crescimento bacteriano em presença destas imunoglobulinas. Os resultados obtidos indicaram que: (i) pacientes colonizados por MRSA podem produzir anticorpos anti-PBP2a e (ii) estes anticorpos podem conferir proteção contra MRSA. Estes dados parecem indicar que uma potencial vacina anti-PBP2apoderia ser efetiva para prevenção de infecções causadas por MRSA, como também para o emprego de imunoterapia passiva para o tratamento de pacientesinfectados por este patógeno. / Infections caused by methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) are feared because of the difficulty of their treatment and the high associated morbidity. The PBP2a (penicillin binding protein 2a), the enzyme responsible for cell wall synthesis in MRSA, presents low affinity for beta-lactams. Because of the PBP2a is located on the external surface, it would be accessible to the immune system. During the MRSA infections, little is known whether the infected orcolonized host can produce antibodies anti-PBP2a and whether these antibodies would be protective or not. This project aims to assess the presence and levels of anti-PBP2a in a group of 56 patients colonized by MRSA and investigate whether these antibodies wouldbe protective or not. The results showed that 71% of the samples presented anti-PBP2aantibodies in ELISA. These samples which were subjected to Western blot for confirmation, it was demonstrated that 46% of the samples presented antibodies anti-PBP2a. After these results, the positive samples were subjected to purification to assess the MRSA growth kinetics. It was observed that there was a slight reduction in bacterial growth between serum samples with antibodies and MRSA compared to those of the serum with anti-MSSA (PBP2a negative). Therefore, the curve of growth ofMRSA was evaluated in the presence of purified immunoglobulins from the serumof patients colonized by MRSA (bacterial quantification). We observed that there was a drastic reduction in bacterial growth in the presence of immunoglobulins, thus demonstrating that these antibodies could have a protective action. These results indicated that: (i) MRSA colonized patients can produce antibodies against PBP2a and (ii) these antibodies can be protective against MRSA. These data suggest that a potential vaccine anti-PBP2a could be effective for prevention of infections caused byMRSA and for the use of passive immunotherapy in the treatment of patients infectedby this pathogen.