Orientador : Celina R.O. Camargo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-07-14T06:15:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bruno_MariaEmiliaCesar_M.pdf: 5595926 bytes, checksum: a38a98ee6c8ef1b7b9ed616774148388 (MD5) Previous issue date: 1989 / Resumo: A necessidade de utilização de condicionadores de massa na produção industrial de biscoitos semidoces duros advém do uso de farinhas de trigo com características tecnológicas inadequadas ao processamento. Esses aditivos são normalmente usados para enfraquecer o glúten, tornando a massa adequada ás etapas de laminação, formação e cozimento. No Brasil, esses problemas vêm sendo solucionados através da adição de agentes redutores como os sulfitos e derivados, especialmente o bissulfito de sódio. Entretanto, o uso desses aditivos em produtos de panificação não é permitido pela legislação brasileira de alimentos. O objetivo deste trabalho foi estudar a possibi1idade de se utilizarem proteases comerciais de origem fungica ou bacteriana como aditivos naturais em substituição ao bissulfito de sódio. Foram selecionados os parâmetros reológicos resistência à extensão e resistência máxima, determinados no extensógrafo Brabender, como indicadores da proteólise na massa. A protease bacteriana estudada apresentou uma ação mais eficaz do que a fungica na hidrólise do glúten nas condições analisadas. A influência da concentração da enzima, tempo de ação, pH e temperatura na atividade da protease bacteriana nas massas de biscoito foi avaliada através de testes extensográficos. Messe estudo, foram estabelecidas as condições de processamento de bicoitos em laboratório, que foram posteriormente adaptadas às condições industriais para a produção de biscoitos tipo "Maizena". Os resultados dos testes de laboratório e industriais mostraram ser tecnologicamente viável a produção de biscoitos com protease bacteriana com caracteristicas físicas e sensoriais similares àquelas tradicionalmente obtidas com bissulfito de sódio. / Abstract: The necessity of the use of dough conditioners in the industrial production of hard semi sweet cookies is a. consequence of the uti1ization of wheat flours with technological characteristics inadequate to the processing. These additives are normally used to weaken the gluten, rendering the dough adequate to the laminating, forming and baking stages. In Brazil, these problems have been solved through the addition of reducing agents such as sulfites and derivates, especial1y sodium bi sulfate. However, the use of these additives in baking products is not permitted by Brazilian food legislation. The aim of this work was to study the possibility of using commercial proteases from fungal or bacterial sources as natural additives in substitution for sodium bisulfite. The rheological parameters resistance to extension and maximum resistance, measured with the aid of the Brabender extensigraph, were selected as indicators of dough proteolysis. The bacterial protease studied showed a more effective- action than the fungal one in the hydrolysis of the gluten under the analyzed conditions. The influence of enzyme concentration, duration of action, pH and temperature on the activity of the bacterial protease in cookie doughs was determined by means of extensigraphic tests. In this study, laboratory processing conditions were established, which were afterwards adapted to the industrial conditions of production of "Maizena" type cookies. The results of the laboratory and industrial tests have shown it to foe technological1y feasible to produce cookies with the use of bacterial proteases presenting physical and sensory characteristics similar to those traditionally obtained with the sodium bisulfite. / Mestrado / Mestre em Tecnologia de Alimentos

Orientador: Ariene G. F. Van Dender / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-07-24T02:07:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_AdrianaTorres_M.pdf: 8802763 bytes, checksum: 4ea01aaac5ae90f433d9b7a9bc51e201 (MD5) Previous issue date: 1998 / Resumo: A maturação do queijo é um processo complexo envolvendo a formação de variedades de componentes de aroma e sabor por diferentes vias, bem como uma mudança nas propriedades físicas e estruturais da matriz protéica. No queijo Prato este processo corresponde a um período de aproximadamente 40 dias. Este produto tipicamente brasileiro vem sofrendo uma descaracterização progressiva devido principalmente a alterações no processo de cura, visando diminuir os custos. Diante de tal problema a alternativa mais viável consiste na aceleração da maturação, e dentre os métodos empregados, a adição de enzimas proteolíticas é o de mais fácil aplicação prática. Neste trabalho, foram avaliados os parâmetros tecnológicos de fabricação e as variáveis envolvidas na cura do queijo tipo Prato obtido pela adição de enzimas proteolíticas. Foram estudados paralelamente queijos fabricados pelo método tradicional e obtidos com três concentrações de enzima (25, 15 e 10 mg/kg leite) adicionadas à massa antes da pré prensagem. A avaliação da proteólise foi efetuada pelos teores de Nitrogênio (N) solúvel a pH 4,6 e em ácido tricloroacético (TCA) 12%, pela determinação da concentração de tiro sina e triptofano, por reação colorimétrica com ácido trinitrobenzeno sulfônico (TNBS) e ninidrina-cádmio e por eletroforese nos queijos com 1, 7, 14,21,28 e 40 dias de maturação. Os atributos de textura e sensoriais também foram avaliados. O uso da enzima Neutrase® acelerou a proteólise do queijo Prato. Os queijos fabricados pelo método modificado apresentaram já no primeiro dia de maturação e durante todo período da mesma, um índice de extensão (% NS-pH 4,6/NT) e de profundidade (% NS TCA 12%/NT) significativamente maiores do que aqueles fabricados pelo método tradicional, nos processos com adição de 25, 15 e 10 mg enzima/kg leite. Os queijos modificados do processo A (25mg enzima/kg leite) apresentaram um índice de extensão aos 7 dias (17,32%) mais elevado do que o correspondente com 30 dias conforme descrito na literatura (14,0 - 14,5%), ao passo que no processo B (15mg enzima/kg leite) o valor obtido para os queijos com um dia (16,02%) já foi maior. No processo C (10mg enzima/kg leite) um valor próximo (15,61%) àquele correspondente a 30 dias na literatura foi alcançado com 14 dias de maturação. A adição de enzima Neutrase® à massa dos queijos modificados não acarretou perdas no rendimento. Nos processos A e B houve um decréscimo do índice de firmeza até o 210 dia de maturação, correspondendo à primeira fase da maturação onde a quebra da ?S1-caseína promoveu um amolecimento da massa. A região analisada (periferia e centro) influenciou a textura dos queijos. O índice de firmeza nas fatias retiradas da região mediana foi menor do que aquele obtido nas fatias da ponta do queijo. O perfil eletroforético dos queijos mostrou que a adição de enzimas levou a diferenças quantitativas nas frações protéicas dos queijos modificados quando comparados aos tradicionais. Houve uma maior degradação das frações ?S1 e ?-caseínas, com acúmulo maior de alguns produtos de degradação destas duas frações nos queijos modificados. A degradação da fração ?-caseína nos queijos modificados foi maior do que a da ?S1-caseina / Abstract: The ripening process of cheese is a very complex process that involves the development in many different ways of a great variety of flavor compounds that affect the aroma and taste of the finished product. Throughout the ripening process, the protein content undergoes a considerable number of changes that influence its physical and structural properties. The ripening of Prato cheese is completed after about 40 days. In recent times, however, this typically Brazilian product has gradually lost some of its main characteristics due to changes introduced in the ageing procedure by many cheese plants to reduce production costs. In view of the need to incorporate the economic aspects of cheesemaking, the most viable alterative consists in accelerating the ripening process. From a technological standpoint, the addition of proteolytic enzymes is the technique that offers the greatest facility to be implemented in practice. The present research project aimed at evaluating the technological manufacturing parameters and the variables involved in the ageing of Prato cheese obtained with the incorporation of a proteolytic enzyme (Neutrase®). Parallel experiments were conducted to study cheese made without enzyme (traditional method) and cheeses made with the incorporation of three different enzyme concentrations (25, 15 and 10 mg enzyme/kg milk) in the raw curd prior to the pre-pressing stage (modified method). Proteolysis after 1, 7, 14, 21, 28 and 40 days ripening was evaluated by determining: 1) the content of soluble Nitrogen (N) at pH 4,6; 2) the content of soluble nitrogen in a 12% trichloroacetic acid solution; 3) the concentration of tyrosin and tryptophane. Additional methods to determine proteolysis included colorimetric reactions with trinitrobenzene sulphonic acid (TNBS) and ninidrin-cadmium, respectively. Finally, proteolysis was also determined by electrophoresis. The texture and sensorial attributes were also evaluated. The use of Neutrase® accelerated proteolysis in Prato cheese. As for the modified experiments (25, 15 and 10 mg enzyme/kg milk), the cheeses showed, from the very first day of the ripening process on and throughout the rest of the ripening period, extension (% NS-pH 4,6/NT) and depth (% NS TCA 12%/NT) indexes significantly higher in comparison to the values produced by the traditional cheeses manufactured without the addition of enzyme. The modified cheeses of process A (25 mg enzyme/kg milk) presented after 7 days ripening an extension index (17,32%) which was higher than the corresponding index figure obtained for cheese after 30 days ripening described in literature (14,0 - 14,5%). On the other band, the cheeses of process B (15 mg enzyme/kg milk) exceeded (16,02%) the figure referred to in literature (14,0 - 14,5 % after 30 days) already after only 1 day ripening. As for Process C (10 mg enzyme/kg milk), a value quite close (15,61%) to the one referred to in literature for 30 days (14,0 - 14,5%) was reached after 14 days. The incorporation of the enzyme Neutrase® in the curd of modified cheeses did not bring about any losses in terms of cheese yield. Processes A and B showed a decrease ofthe firmness index up to the 21st day ofthe ripening process. This time span of 21 days corresponds to the first stage ofthe breakdown process of ?S1-casein which causes softening of the curd. The texture of the cheeses varied according to the areas submitted to analysis (peripheral and core). The firmness values produced by slices taken from the central part of the cheeses were smaller than those produced by slices taken from the edges. The electrophoretic profile of the cheeses clearly showed that the incorporation of enzymes brought about quantitative differences relative to the protein fractions of the modified cheeses in comparison to the values obtained for the traditional product. A more intense breakdown of the ?S1 and ?-casein fractions is observed, evidenced by higher concentrations of some degradation products of these two fractions found in modified cheeses. The degradation of the ?-casein fraction in the modified cheeses was more intense than the breakdown of ?S1-casein. / Mestrado / Mestre em Tecnologia de Alimentos

Orientador: Samir Tufic Arbex / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-07-20T10:23:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_LurdesCatarinada_M.pdf: 1166757 bytes, checksum: 249a8d277676388a24f33b7cb92b15d3 (MD5) Previous issue date: 1984 / Resumo: Não informado / Abstract: Not informed. / Mestrado / Mestre em Odontologia

Orientado: Samir Tufic Arbex / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-07-16T13:38:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Busato_MaraSilviaSaldini_M.pdf: 1388590 bytes, checksum: 749c054286b5fb42a673d377b55c9919 (MD5) Previous issue date: 1985 / Resumo: Não informado / Abstract: Not informed. / Mestrado / Bases Farmacologicas para a Terapeutica Medicamentosa / Mestre em Odontologia

Orientador : Antonio C. M. Paiva / Tese (doutorado) - Universidade de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-18T02:06:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tahin_QuivoSchwartzburd_D.pdf: 3845427 bytes, checksum: 227dc9a5b3a817c33678150a3b0aec65 (MD5) Previous issue date: 1968 / Resumo: A composição de aminoácidos da pepsina caracteriza-se pelo grande número de resíduos dicarboxílicos e de resíduos com cadeias laterais apolares, e de raros resíduos básicos. Devido a isso, e à presença de uma fosfoserina, a enzima apresenta ponto isoelétrico menor do que 1,08. A atividade enzímica da pespsina (tanto a proteolítica como a peptidásica, como a esterásica) dá-se otimamente em pHs ácidos. A proteólise péptica de substratos nativos dá-se em pHs ótimos mais baixos do que os da proteólise péptica de substratos desnaturados e também mais baixos do que os verificados para a hidrólise péptica de peptídeos sintéticos ou de ésteres sintéticos. Uma das hipóteses para explicar a necessidade dos baixos pHs para a melhor ação catalítica da pepsina baseia-se na possível atração eletrostática entre a enzima, que em meio ácido se comportaria como um ânion, e o substrato protéico, que em meio ácido se comportaria como um cátion (pois geralmente o ponto isoelétrico dos substratos é acima de 4,0). Outra hipótese é a de que o passo limitante da proteólise péptica seria a desnaturação do substrato, favorecida pelo pH ácido. Estudamos neste trabalho o efeito do pH e da temperatura sobre a cinética da ação da pepsina sobre a ovalbumina nativa ou previamente desnaturada por ácido... Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: Not informed. / Doutorado / Doutor em Ciências Biológicas

Submitted by Daniella Sodre (daniella.sodre@ufpe.br) on 2015-03-18T14:02:34Z No. of bitstreams: 2 TESE Jéssica do Nascimento.pdf: 8406202 bytes, checksum: 3044ddac08c83d542d9985dca68d8798 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-18T14:02:34Z (GMT). No. of bitstreams: 2 TESE Jéssica do Nascimento.pdf: 8406202 bytes, checksum: 3044ddac08c83d542d9985dca68d8798 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2014-04-25 / Rede Nanobiotecnologia-CAPES / Os peptídeos antimicrobianos (PAMs) e os peptídeos anticongelantes (PACs) constituem uma nova classe de agentes antimicrobianos que desempenham sua função através da desestabilização das membranas, levando à morte do microrganismo. Este fato tem direcionado vários estudos para a compreensão dos mecanismos de ação destes peptídeos. Por outro lado, um dos principais problemas na utilização dos PAMs como princípio ativo é devido a eles serem compostos lábeis, podendo ser facilmente degradados. O desenvolvimento de um sistema de liberação controlada (SLC), como por exemplo, lipossomas capazes de carrear esses PAMs, seria uma alternativa promissora para o uso desses peptídeos como agentes antimicrobianos. Desta forma, nesta tese utilizamos diferentes técnicas espectroscópicas (voltametria cíclica, impedância, ressonância de plásmons de superfície, espalhamento de luz e fluorescência) para elucidar os mecanismos de ação dos PAMs MagaininaI, LL-37, Clavanina A e Clavanina X e do PAC Pa-MAP usando modelos de membranas e estudamos um SLC revestido com o copolímero em bloco Synperonic. Todos os PAMs estudados apresentaram grande capacidade para desestabilizar membranas, demonstrando o potencial desses peptídeos como agentes antimicrobianos. O Pa-MAP apresentou a habilidade em desestabilizar as membranas lipídicas no primeiro minuto de exposição, atuando através do modelo carpete, sendo este mecanismo descrito pela primeira vez para este PAC. Foi mostrado, também pela primeira vez, um possível SLC para PAMs utilizando vesículas lipídicas revestidas com o copolímero Synperonic. A importância do copolímero tribloco para estabilizar lipossomas foi demonstrada, uma vez que os lipossomas sem o revestimento foram instáveis, devido à formação de poros pelo peptídeo, o que não foi observado para os lipossomas revestidos. Os resultados obtidos fornecem contribuições importantes para a compreensão da interação peptídeomembrana através de parâmetros eletroquímicos, dielétricos, ópticos e morfológicos, além de poder contribuir para o desenvolvimento de novos sistemas de liberação de drogas para peptídeos antimicrobianos baseados em lipossomas.

Ureases (EC 3.5.1.5) são enzimas dependentes de níquel que catalisam a hidrólise da uréia para formar amônia e dióxido de carbono. Elas têm sido isoladas de uma ampla variedade de organismos incluindo plantas, fungos e bactérias, porém não são sintetizadas por animais. As sementes de Canavalia ensiformis são ricas em isoformas de urease, tal como a Canatoxina (CNTX) e JBU (jackbean urease, do inglês). A CNTX é uma proteína neurotóxica, causando diversos efeitos biológicos após injeção por via intraperitoneal em ratos e camundongos, entre eles, atividades pró- inflamatórias e indutora de agregação plaquetária, convulsões, e finalmente, morte dos animais. A CNTX também apresenta efeitos inseticida e antifúngico, potencialmente relevantes para a defesa da planta de origem. Após anos de estudos com a CNTX, verificou-se que JBU também compartilha essas atividades biológicas, como efeitos inseticida e fungitóxico, ativação de plaquetas e de células inflamatórias, incluindo letalidade em ratos e camundongos (por via intravenosa). Na busca pelo mecanismo de ação inseticida, identificou-se um fragmento da urease com efeito letal em insetos, denominado Jaburetox (Jbtx). Indícios da interação desses polipeptídeos com membranas lipídicas nos levou a estudar de que forma esse fenômeno ocorre. Fragmentos do Jbtx originados de mutações sítio-dirigidas foram testados a fim de investigar a relação estrutura X função. Foram usados neste estudo, além de JBU e Jbtx, a porção amino-terminal do Jbtx isolada, chamada de Jbtx N-ter, a sua região carboxi-terminal, ou Jbtx C-ter, e ainda o peptídeo com a região do grampo beta removida, ou Jbtx Δ-β. Por meio de ensaios com lipossomos, foi possível certificar-se que todas as proteínas ligam-se e interagem com as vesículas de maneira muito similar. A capacidade das moléculas de inserção em bicamadas lipídicas foi confirmada através da técnica de planar lipid bilayer, determinando-se as propriedades biofísicas dos canais formados, e sugerindo que o peptídeo Jbtx representa a principal região da JBU capaz de interagir com membranas biológica. Os resultados contribuem para a compreensão mais aprofundada dos mecanismos de ação de ureases e peptídeos derivados, assim como das relações estrutura x função implicadas nesses mecanismos. / Ureases (EC 3.5.1.5) are niquel dependent enzymes that hydrolyse urea into ammonium and carbon dioxide. They have been isolated from many organisms, including plants, fungi and bacteria, but are not synthesized by animals. Canavalia ensiformis seeds are source of urease isoforms, like Canatoxin (CNTX) and jackbean urease (JBU). CNTX is a neurotoxic protein, displaying several biological effects after intraperitoneal injection in rats or mice, including proinflammatory and platelet aggregation activity, and convulsions followed by death of the animals. CNTX also presents insecticidal and fungitoxic effects, which are probably relevant for defense mechanisms of the source plant. After some years of studies, it was found that JBU also share these biological activities, such as entomotoxic and antifungal effects, activation of platelets and inflammatory cells, including lethality in rats and mice (intravenously). In the search for the insecticidal mode of action, an urease fragment lethal to insects was identified and named Jaburetox (Jbtx). Evidence of the interaction of these polypeptides with lipid membranes led us to investigate how this phenomenom takes place. Site-directed mutagenesis to obtain Jbtx fragments was applied in the search for structure X function relationships. Besides JBU and Jbtx, a peptide corresponding to Jbtx’s amino-terminal half (Jbtx N-ter), a peptide corresponding to Jbtx’s carboxi-terminal half (Jbtx C-ter) and a mutant with deletion of a beta hairpin motif (Jbtx Δ-β) were used in the present study. Working with liposomes it was possible to verify that all proteins bind and interact with vesicles, in a similar way. The ability of these molecules to insert into lipid bilayers was confirmed through the planar lipid bilayer technique. The biophysical properties of the ion channels formed by each polypeptide were characterized, suggesting that Jbtx is the main region from JBU able to interact with lipid membranes. The results contribute to deepen our understanding of the modes of action of JBU and derived peptides, as well as of the structure X function relationships involved in these mechanisms.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2016. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2016-07-14T12:35:49Z No. of bitstreams: 1 2016_FlaviaMariaMedeirosGomes.pdf: 5082726 bytes, checksum: b4f9330a9dd76115f33d108006b4b10e (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2016-07-30T12:43:16Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_FlaviaMariaMedeirosGomes.pdf: 5082726 bytes, checksum: b4f9330a9dd76115f33d108006b4b10e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-30T12:43:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_FlaviaMariaMedeirosGomes.pdf: 5082726 bytes, checksum: b4f9330a9dd76115f33d108006b4b10e (MD5) / A Epilepsia do Lobo Temporal (ELT) é o subtipo mais prevalente de Epilepsia em adultos e sua relevância clínica deve-se à sua gravidade e alta porcentagem de pacientes resistentes aos fármacos antiepilépticos disponíveis atualmente. Há, portanto, uma necessidade pela busca de novas terapias farmacológicas capazes de controlar essa condição patológica de forma eficiente, assim como de compreender melhor as alterações causadas pelo funcionamento anormal das estruturas neuronais durante a Epilepsia. Nesse aspecto, os artrópodes peçonhentos representam uma fonte alternativa de compostos neuroativos selecionados pela evolução dessas espécies. A potencialidade farmacológica dessas moléculas reforça o interesse em compreender sua ação no sistema nervoso central, foco desse trabalho. O Laboratório de Neurofarmacologia isolou o peptídeo Neuropolybina a partir da peçonha da vespa Polybia paulista, e ele apresentou uma interessante atividade antiepiléptica em modelos agudos de crises epilépticas. Além disso, não apresentou efeitos adversos na exploração espontânea e na coordenação motora dos animais testados. Portanto, o objetivo foi avaliar a efetividade antiepiléptica da Neuropolybina em camundongos submetidos ao modelo crônico de Status Epilepticus (SE) induzido por pilocarpina. Esse modelo é amplamente utilizado na literatura e apresenta similaridades com achados histopatológicos e comportamentais observados em pacientes epilépticos em apenas algumas semanas, enquanto as mesmas alterações levam anos para se manifestar nos pacientes. A Comissão de Ética no Uso Animal (CEUA/UnB) aprovou todos os experimentos. Camundongos Swiss receberam a administração i.p. de pilocarpina e após 10 minutos, manifestaram sinais do SE, que durou três horas (período agudo do modelo). No período de 15 dias após o SE (período latente), foi realizado um procedimento estereotáxico para implantar uma cânula-guia no ventrículo lateral e oito eletrodos profundos e corticais. Após os 15 dias, durante o período das crises recorrentes e espontâneas (CRE), os camundongos foram tratados por cinco dias consecutivos com administração i.c.v. de veículo, Neuropolybina (0,5 e 2,5 nmol) e Diazepam (4 mg.kg-1). Durante esse período, o comportamento, as CRE e a atividade epileptiforme foram monitoradas por filmagem e eletroencefalografia. Após o período de tratamento, os camundongos foram eutanasiados e as alterações morfológicas foram avaliadas por técnicas histológicas (Coloração de Nissl para neurônios) e Imunohistoquímica/imunofluorescência (GFAP para astrócitos e DAPI para núcleos celulares). Foi observada uma redução da duração das CRE após o tratamento com Neuropolybina. O número de neurônios viáveis nas regiões CA1 e CA3 da formação hipocampal dos tratados foi significativamente diferente dos doentes, e a presença de astrócitos não foi diferente quando comparada aos sadios, sugerindo que o peptídeo evitou a perda neuronal induzida pelo SE. O peptídeo produziu um efeito antiepiléptico e possui um potencial terapêutico no modelo de ELT. Ademais, ele pode ser usado como uma ferramenta na pesquisa em neurociência e no desenvolvimento de novos fármacos para o tratamento da Epilepsia. _______________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Temporal Lobe Epilepsy (TLE) is the most prevalent subtype of Epilepsy in adults and its clinical relevance is due to the gravity and the high percentage of patients resistant to antiepileptic drugs currently available. Thus, there is a need to seek new pharmacological therapies able to efficiently control this disease, as well as a better understanding of the changes caused by the abnormal functioning of neuronal structures during Epilepsy. In this aspect, venomous arthropods represent an alternative source of evolutionary selected neuroactive compounds. The pharmacological potentiality of these molecules reinforce the interest on its action on the central nervous system, focused by this work. The Neuropharmacology Laboratory previous isolated Neuropolybin from the Polybia paulista wasp venom and this peptide has demonstrated an interesting antiepileptic activity on acute models of seizures. Furthermore, Neuropolybin has not presented side effects on spontaneous exploration and motor coordination of the animals tested. Therefore, the aim was to evaluate the antiepileptic effectiveness of the peptide Neuropolybin in mice submitted to a chronic model of status epilepticus (SE) induced by pilocarpine. This model has been used frequently and presents similarities with histopathological and behavioral findings in epileptic patients in just a few weeks, while the same changes take years to manifest in patients. The Ethical Committee on Use of Animals (CEUA/UnB) approved all procedures. Swiss mice received an i.p. injection of pilocarpine and after 10 minutes, they manifested signs of SE for three hours (acute period of the model). Fifteen days after SE (latent period), a stereotaxic procedure was perfomed to implant a guide cannula in the lateral ventricle and eight deep and cortical electrodes. After 15 days, already during the spontaneous recurrent seizures (SRS), treatment was carried out during five consecutive days by i.c.v. injections with vehicle solution, Neuropolybin (0.5 and 2.5 nmol) or Diazepam (4 mg.kg-1). During this period, behavioral, SRS and epileptiform activity were monitored by video recording and electroencephalography. After the period of treatment, the animals were euthanized and morphological changes were evaluated by histological (Nissl stain for neurons) and immunohistochemistry and immunofluorescence (GFAP stain for astrocytes and DAPI stain for cells nuclei) techniques. There was a reduction in SRS duration with Neuropolybin treatment. The number of viable neurons in CA1 and CA3 regions of the hippocampus formation of treated mice was significantly different from that of epileptic mice after the treatment. The presence of astrocytes did not increase when compared to healthy animals, suggesting that the peptide minimized neuronal loss induced by SE. Neuropolybin thus exerts a promising antiepileptic effect and provides a therapeutic potential on this model of TLE. Nevertheless, the peptide may also be used as a tool in neuroscience research and as a framework in the design of novel drug agents for epilepsy treatment.

Ureases (EC 3.5.1.5) são enzimas dependentes de níquel que catalisam a hidrólise da uréia para formar amônia e dióxido de carbono. Elas têm sido isoladas de uma ampla variedade de organismos incluindo plantas, fungos e bactérias, porém não são sintetizadas por animais. As sementes de Canavalia ensiformis são ricas em isoformas de urease, tal como a Canatoxina (CNTX) e JBU (jackbean urease, do inglês). A CNTX é uma proteína neurotóxica, causando diversos efeitos biológicos após injeção por via intraperitoneal em ratos e camundongos, entre eles, atividades pró- inflamatórias e indutora de agregação plaquetária, convulsões, e finalmente, morte dos animais. A CNTX também apresenta efeitos inseticida e antifúngico, potencialmente relevantes para a defesa da planta de origem. Após anos de estudos com a CNTX, verificou-se que JBU também compartilha essas atividades biológicas, como efeitos inseticida e fungitóxico, ativação de plaquetas e de células inflamatórias, incluindo letalidade em ratos e camundongos (por via intravenosa). Na busca pelo mecanismo de ação inseticida, identificou-se um fragmento da urease com efeito letal em insetos, denominado Jaburetox (Jbtx). Indícios da interação desses polipeptídeos com membranas lipídicas nos levou a estudar de que forma esse fenômeno ocorre. Fragmentos do Jbtx originados de mutações sítio-dirigidas foram testados a fim de investigar a relação estrutura X função. Foram usados neste estudo, além de JBU e Jbtx, a porção amino-terminal do Jbtx isolada, chamada de Jbtx N-ter, a sua região carboxi-terminal, ou Jbtx C-ter, e ainda o peptídeo com a região do grampo beta removida, ou Jbtx Δ-β. Por meio de ensaios com lipossomos, foi possível certificar-se que todas as proteínas ligam-se e interagem com as vesículas de maneira muito similar. A capacidade das moléculas de inserção em bicamadas lipídicas foi confirmada através da técnica de planar lipid bilayer, determinando-se as propriedades biofísicas dos canais formados, e sugerindo que o peptídeo Jbtx representa a principal região da JBU capaz de interagir com membranas biológica. Os resultados contribuem para a compreensão mais aprofundada dos mecanismos de ação de ureases e peptídeos derivados, assim como das relações estrutura x função implicadas nesses mecanismos. / Ureases (EC 3.5.1.5) are niquel dependent enzymes that hydrolyse urea into ammonium and carbon dioxide. They have been isolated from many organisms, including plants, fungi and bacteria, but are not synthesized by animals. Canavalia ensiformis seeds are source of urease isoforms, like Canatoxin (CNTX) and jackbean urease (JBU). CNTX is a neurotoxic protein, displaying several biological effects after intraperitoneal injection in rats or mice, including proinflammatory and platelet aggregation activity, and convulsions followed by death of the animals. CNTX also presents insecticidal and fungitoxic effects, which are probably relevant for defense mechanisms of the source plant. After some years of studies, it was found that JBU also share these biological activities, such as entomotoxic and antifungal effects, activation of platelets and inflammatory cells, including lethality in rats and mice (intravenously). In the search for the insecticidal mode of action, an urease fragment lethal to insects was identified and named Jaburetox (Jbtx). Evidence of the interaction of these polypeptides with lipid membranes led us to investigate how this phenomenom takes place. Site-directed mutagenesis to obtain Jbtx fragments was applied in the search for structure X function relationships. Besides JBU and Jbtx, a peptide corresponding to Jbtx’s amino-terminal half (Jbtx N-ter), a peptide corresponding to Jbtx’s carboxi-terminal half (Jbtx C-ter) and a mutant with deletion of a beta hairpin motif (Jbtx Δ-β) were used in the present study. Working with liposomes it was possible to verify that all proteins bind and interact with vesicles, in a similar way. The ability of these molecules to insert into lipid bilayers was confirmed through the planar lipid bilayer technique. The biophysical properties of the ion channels formed by each polypeptide were characterized, suggesting that Jbtx is the main region from JBU able to interact with lipid membranes. The results contribute to deepen our understanding of the modes of action of JBU and derived peptides, as well as of the structure X function relationships involved in these mechanisms.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biologias, Programa de Pós Graduação em Biologia Animal, 2014. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2014-10-24T14:39:43Z No. of bitstreams: 1 2014_JulianadeCastroeSilva.pdf: 31898664 bytes, checksum: fa1b836c99956f9529ca104b3379326e (MD5) / Approved for entry into archive by Tania Milca Carvalho Malheiros(tania@bce.unb.br) on 2014-10-24T15:02:06Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_JulianadeCastroeSilva.pdf: 31898664 bytes, checksum: fa1b836c99956f9529ca104b3379326e (MD5) / Made available in DSpace on 2014-10-24T15:02:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_JulianadeCastroeSilva.pdf: 31898664 bytes, checksum: fa1b836c99956f9529ca104b3379326e (MD5) / A epilepsia é uma desordem associada a uma disfunção do Sistema Nervoso Central que, de acordo com a OMS, afeta 50 milhões de pessoas no mundo. E apesar da grande disponibilidade de fármacos, o tratamento ainda e ineficaz para parte dos diversos fenômenos clínicos da epilepsia, sendo de grande importância a busca por novas alternativas que possam gerar medicamentos com maior eficácia e menos efeitos adversos. Recentemente, um promissor peptídeo antiepiléptico foi isolado da peçonha da vespa social Polybia paulista, denominado Neuropolybina. A fim de elucidar o mecanismo de ação e aprofundar o conhecimento da eficácia antiepiléptica com estudos eletroencefalograficos e comportamentais, esse peptídeo e um analogo, com modificações em sua seqüência, foram sintetizados (Aminotech Ltda). Para os testes de proteção contra crises induzidas quimicamente (PTZ, sc, 95 mg/kg; Pilo, ip, 250 mg/kg) camundongos Mus musculus (Swiss) foram submetidos a uma neurocirurgia para a implantação de uma canula-guia no ventrículo lateral direito e administração dos peptídeos via icv. Curvas de proteção foram obtidas a partir da utilização de três doses dos peptídeos (2,5, 1,25 e 0,4 nmol/animal para o peptídeo Neuropolybina e 3, 1,5 e 0,5 nmol/animal para o peptídeo modificado). Ambos compostos aumentaram o tempo de latência para o inicio das crises de maneira dose-dependente. Os peptídeos não protegeram contra as crises induzidas por pilocarpina em nenhuma das doses testadas. Para os testes eletroencefalograficos, ratos Wistar machos receberam a DE50 dos peptídeos e posteriormente o PTZ (sc, 105 mg/kg). Observou-­‐se que a latencia para a crise eletroencefalografica foi a mesma para a comportamental, e que o tratamento com Neuropolybina aumentou a latencia para a crise maxima, e ambos os peptideos reduziram a severidade das crises. Tambem foram feitos testes para verificar se os compostos seriam capazes de atravessar a barreira hematoencefalica, mas quando injetados ip não protegeram contras crises induzidas por PTZ. E ainda, na tentativa de elucidar o mecanismo de ação de tais compostos, ensaios de ligação a receptores de glutamato e GABA e de captação de glutamato foram realizados, mas não foram obtidos resultados significativos. Alem disso, a avaliação neurotoxica dos peptídeos no teste do campo aberto revelou que a maior dose de proteção contra crises não afeta o comportamento normal do animal, apenas a dose dez vezes maior. Na avaliação citotóxica os peptídeos não foram hemolíticos nas concentrações testadas (1, 5 a 50 nmol/poco) em eritrócitos de camundongos. Sendo assim, os peptídeos sintéticos testados apresentaram uma alta eficácia no modelo de epilepsia, com reduzidos efeitos adversos, corroborando os dados previamente obtidos e, portanto, representa uma ferramenta promissora para o desenvolvimento de novos fármacos neuroativos. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Epilepsy is a disorder associated with a dysfunction of the central nervous system which, according to the WHO, affects 50 million people worldwide. And despite the widespread availability of AEDs, the treatment is still ineffective for the several clinical phenomena of epilepsy, being of great importance the search for new alternatives that can generate drugs with fewer adverse effects. Recently a promising antiepileptic peptide was isolated from the venom of the social wasp Polybia paulista, named Neuropolybin. To elucidate the mechanism of action and increase knowledge of the antiepileptic efficacy with electroencephalographic and behavioral studies, this peptide and an analogue, with modifications in its sequence, were synthesized (Aminotech Ltda). For the protection tests against chemically induced seizures (PTZ, sc, 95 mg/kg; Pilo, ip, 250 mg/kg) mice underwent neurosurgery for the implantation of a guide cannula in the right ventricle for administration of peptides (icv). Protection curves were obtained byusing three doses of the peptides (2.5, 1.25 and 0.4 nmol/animal for Neuropolybin and 3, 1.5 and 0.5 nmol/animal for the modified peptide). Both compounds increased the latency to onset of seizures in a dose‐dependent manner. The peptides did not protect against pilocarpine induced seizures at any of the doses tested. For electroencephalographic recordings male Wistar rats received the ED50 of the peptides and then PTZ (sc, 105 mg/kg). It was noted that the latency for behavioral and electrographic seizures was the same, the Neuropolybin treatment increased the latency to the maximum seizure and both peptides reduced the severity of seizures. Tests were also performed to verify if the compounds would be able to cross the blood brain barrier but when injected systemically did not protect against PTZ‐induced seizures. Aditionally, in an attempt to elucidate the mechanism of action of these compounds binding assays of glutamate and GABA receptors and glutamate uptake were done but no significant results were obtained. Furthermore, the assessment of neurotoxicity of the peptides on the open field test revealed that the highest dose of protection against seizures does not affect the normal behavior of the animal, only the ten times higher dose. In cytotoxic evaluation peptides were not hemolytic at different concentrations (1.5 to 50 nmol/well) in erythrocytes of mice. Thus, the synthetic peptides tested showed high efficacy in the epilepsy model with reduced adverse effects, confirming the data previously obtained, and therefore Neuropolybin may represents a promising tool for the development of new neuroactive drugs.