The requirements of food packages are to ensure food safety and quality, to minimize spoilage, and to provide an easy way to store and handle food. To meet these demands for fibre-based food packages, barrier coatings are generally used to regulate the amount of gases entering a package, as some gases are detrimental to food quality. Oxygen, for example, initiates lipid oxidation in fatty foods. Bakery products may also be sensitive to oxygen. This thesis focused on mass transport of oxygen in order to gain deeper knowledge in the performance of barrier coatings and to develop means to optimize the performance of barrier coatings. This experimental study along with computer modelling characterized the structure of barrier materials with respect to the mass transport process.This project was performed as part of the multidisciplinary industrial graduate school VIPP (www.kau.se/en/vipp) - Values Created in Fibre Based Processes and Products – at Karlstad University, with the financial support from the Knowledge Foundation, Sweden, and Stora Enso. / <p>Artikel 2 "The influence of clay orientation..." ingick som manuskript i avhandlingen, då med titeln: "Influence of clay orientation in dispersion barrier coatings on oxygen permeation". Nu publicerad.</p>

A permeabilidade ao ar (Ka) pode ser utilizada para avaliar alterações que ocorrem na estrutura do solo em virtude de diferentes sistemas de manejo. Este estudo testou a hipótese de que o menor revolvimento do solo sob sistema plantio direto resulta na formação de poros contínuos e melhor condição de aeração no solo. O objetivo do estudo foi avaliar, por meio da Ka, porosidade de aeração (a) e índices de continuidade de poros (K1 e N), a aeração em um Latossolo Vermelho submetido ao preparo do solo convencional (PC) e plantio direto (PD). Amostras de solo indeformadas foram coletadas em cada sistema nas profundidades de 0-0,10 e 0,10-0,20 m em área experimental do Instituto Agronômico do Paraná IAPAR, no município de Ponta Grossa, Paraná. A Ka foi medida pelo método da carga decrescente em seis potenciais mátricos, -2, -6, -10, -30, -70 e -100 kPa. A macroporosidade e a Ka foi maior no PC nas duas camadas avaliadas. A continuidade de poros avaliada pela razão entre Ka e a (K1) foi similar entre os sistemas na camada superficial e foi maior para o PC em subsuperfície. O índice de continuidade N, referente ao coeficiente angular da relação log-log entre Ka e a foi diferente quando determinado para cada amostra individualmente (n=6) e quando obtido com todas as observações (n=120). Os dois métodos revelaram poros mais contínuos no PC em superfície. Na camada de 0,10-0,20 m o primeiro (n=6) não indicou diferença de continuidade de poros entre os sistemas, enquanto o segundo (n=120) resultou em uma maior continuidade de poros nesta profundidade no PD. / Air permeability (Ka) can be used for assessing soil structure changes due tillage systems. This study tested the hypothesis that the less soil disturbance under no-tillage result in continuous pores and better soil aeration conditions. The objective of this study was to evaluate a Rhodic Hapludox aeration dynamics, by measuring Ka, air-filled porosity (ea) and pore continuity indices (K1 and N), under conventional tillage (CT) and no-tillage (NT). Undisturbed soil cores were collected in each systems at depths of 0-0,10 and 0,10-0,20 m in Parana Agronomic Institute research farm - IAPAR, in Ponta Grossa, Paraná. Ka was determined using falling pressure method in six soil water potentials, -2, -6, -10, -30, -70 e -100 kPa. The soil macroporosity and Ka was higher in CT in both depths. The pore continuity assessment by ratio between Ka and ea (K1) was similar between the systems in the top layer and was higher at CT at depth of 0,10-0,20 m. The continuity index N, relative to the slope from the log-log relationship between Ka and ea was different when calculated for each core individually (n=6) or obtained including all data for each tillage (n=120). The two methods revealed a more continuous pores in CT in the top layer. At depth of 0,10-0,20 m the first (n=6) did not indicate pore continuity difference between the systems, while the second resulted in better pore continuity in NT at this depth.

O estudo das propriedades físico-químicas é essencial na fase de otimização e desenvolvimento de substâncias bioativas. A lipofilia e a estabilidade química de candidatos a fármacos são extremamente importantes e devem ser determinadas nas fases iniciais da descoberta de fármacos. A determinação da lipofilia dos compostos bioativos foi feita utilizando Membrana Artificial Imobilizada (IAM) para obtenção do logKw. Já a bioanálise qualitativa da estabilidade química de algumas substâncias em meio de cultura foi estudada utilizando um sistema RP-HPLC-MS com fonte de ionização eletrospray e analisador ion trap. Estruturas químicas de dipeptidil nitrilas foram sintetizadas pelo grupo tendo como alvo a inibição de cisteíno proteases a fim de combater a Doença de Chagas e alguns tipos de carcinomas. O trabalho foi realizado a fim de expandir as análises para uma série de derivados do NEQ0409 de forma que foi estabelecido um mapa com aumento da lipofilia de acordo com as modificações estruturais nas substâncias. Desta maneira foi possível obter uma relação estrutura-propriedade (SPR), além da análise do perfil de degradação e/ou estabilidade de algumas das substâncias de interesse, demonstrando que as substâncias analisadas apresentam potencial para continuarem na fase de desenvolvimento. / The study of physicochemical properties is essential in the optimization and development phases of bioactive substances. The lipophilicity and chemical stability of drug candidates are extremely important and should be determined in the initial steps of the drug discovery program. Therefore, the determination of the lipophilicity of the bioactive compounds was done using immobilized artificial membrane (IAM) to obtain logKw. Furthermore, the qualitative bioanalysis of the chemical stability of some substances in culture medium was studied using a RP-HPLC-MS system with electrotropray ionization source and ion trap analyzer. A series of dipeptidyl nitriles was synthesized by the group aiming to inhibit cysteine proteases as an alternative therapeutic approach for Chagas disease and some types of carcinomas. The work was carried out to expand the analyses for a series of derivatives of NEQ0409, so that a map of dipeptidyl nitriles with higher lipophilic characteristics was established according to the substituents of the new compounds. In this way, it was possible to obtain a structure-property relationship (SPR), besides the analysis of the degradation and/or stability profile of some of the substances of interest. All-in-all, these results suggest that dipeptidyl nitrile derivatives are potential candidates for further development.

A utilização de diferentes soluções irrigantes no preparo dos canais radiculares tem como finalidade a lubrificação, desinfecção, limpeza com a remoção de smear layer, visando o sucesso do tratamento endodôntico. O objetivo do presente estudo foi avaliar in vitro a ação dos géis de EDTA 24% e clorexidina 2%, na permeabilidade dentinária e na remoção da smear layer de canais instrumentados pela técnica Free Tip Preparation, utilizando a análise pelo método de coloração histoquímica e a microscopia eletrônica de varredura. Foram utilizados 46 pré-molares inferiores separados em 2 grupos experimentais (n=20) e controles positivo e negativo (n=3). Os espécimes dos grupos experimentais foram instrumentados com os géis avaliados. Após o término do preparo dos canais, o grupo 1(EDTA) foi irrigado com 5ml de NaOCl 1%, seguido de 5ml de solução fisiológica 0,9%; e o grupo 2(clorexidina) recebeu irrigação final com 10ml de solução fisiológica 0,9%. A seguir, 15 dentes de cada grupo receberam preparo para coloração histoquímica e avaliação da permeabilidade dentinária, utilizando o software de digitalização de imagem Axion Vision (v.4.8.2). Os 5 dentes restantes receberam preparo para análise com auxilio da microscopia eletrônica de varredura sendo que apenas 3 foram avaliados nos terços apical, médio e cervical. Os resultados mostraram que a utilização do gel de EDTA 24% foi capaz de aumentar a permeabilidade dentinária em todos os terços avaliados, e apresentou maior capacidade de limpeza, apresentando paredes dentinárias livres de smear layer e com túbulos dentinários abertos, o que não ocorreu com o gel de clorexidina 2%. / The use of different irrigating solutions in root canal preparation is intended for the lubrication, disinfection, cleaning to removal of smear layer, aiming at the success of endodontic treatment. The aim of this study was to evaluate the action of 24% EDTA gel and 2% Chlorhexidine gel in dentin permeability and smear layer removal from root canals instrumented by the Free Tip Preparation Technique, using the analysis with histochemical staining and scanning electron microscopy. We used 46 pre-molars separated into two experimental groups (n = 20) and positive and negative controls (n = 3). The specimens of experimental groups were instrumented with the gels. After the preparation, the group 1(EDTA) received irrigation with 5 ml of 1% NaOCl, followed by 5 ml 0.9% saline solution and the group 2(clorexidina) received final irrigation with 10 ml of 0.9% saline solution. Next, 15 teeth from each group were prepared for histochemical staining and evaluation of dentin permeability using the image scanning software Axion Vision (v.4.8.2). The five remaining teeth were prepared for analysis with scanning electron microscopy and only 3 were assessed in apical, middle and cervical. The results showed that using 24% EDTA gel was able to increase the permeability of dentin in all thirds evaluated, and showed greater cleaning ability, with dentinal walls free of smear layer and open dentinal tubules, which did not occur with 2% chlorhexidine gel.

Infecções por Plasmodium sp. podem levar a um quadro respiratório grave, com complicações pulmonares denominadas lesão pulmonar aguda e síndrome do desconforto respiratório agudo (LPA/SDRA). Inflamação aguda, lesão do endotélio alveolar e do parênquima pulmonar, disfunção e aumento da permeabilidade da barreira alvéolo-capilar e, consequente, formação de edema, caracterizam esta síndrome. O modelo experimental, que utiliza o parasita murino Plasmodium berghei ANKA e camundongos da linhagem DBA/2, é empregado no estudo de mediadores imunológicos e fatores que propiciam o estabelecimento das lesões pulmonares associados à LPA/SDRA. Diversos estímulos podem atuar diretamente no aumento da permeabilidade endotelial por meio da desestabilização dos microtúbulos, rearranjo dos microfilamentos de actina e contração das células endoteliais, via sinalização de Rho-GTPases, causando disfunção da barreira endotelial. Desta forma, este trabalho tem como objetivo avaliar as alterações do citoesqueleto em células endoteliais primárias pulmonares de camundongos DBA/2 (CEPP-DBA/2), as vias de sinalização das principais Rho-GTPases e o estresse oxidativo, causados pela presença de eritrócitos parasitados com esquizontes de P. berghei ANKA (EP-PbA). As CEPP-DBA/2 foram estimuladas com TNF, VEGF ou IFN&#947;, em diferentes tempos de exposição, seguido da incubação com EP-PbA. Assim, foram realizados ensaios de imunofluorescência para análise do rearranjo de microfilamentos de actina e da desestabilização de microtúbulos. As vias de sinalização das Rho-GTPases foram avaliadas por Western blot, para as expressões proteicas de RhoA, Cdc42 e MLC. Além disso, ensaio fluorométrico foi realizado para detectar a produção de espécies reativas de oxigênio, resultantes do estímulo com eritrócitos parasitados. CEPP-DBA/2 estimuladas por EP-PbA, VEGF, TNF ou IFN&#947;, em associação ou não, apresentaram alterações morfológicas nos microfilamentos de actina e aumento dos espaços interendoteliais. Imagens de imunofluorescência também mostram desestabilização de microtúbulos e desfosforilação de FAK, causadas por EP-PbA. Os ensaios de permeabilidade validam que os eritrócitos parasitados com formas maduras de P. berghei induziram aumento da permeabilidade microvascular nas CEPP-DBA/2. Além disso, estas células, estimuladas com EP-PbA, demonstraram elevada produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), o que pode estar contribuindo com o desenvolvimento de estresse oxidativo e com a injúria endotelial, assim como, com o aumento da permeabilidade vascular. O mais interessante é que estas alterações endoteliais podem estar relacionadas ao aumento da razão RhoA/Cdc42, da expressão proteica de MLC fosforilada e do sinal de ativação de RhoA. Em conjunto, estes resultados mostram envolvimento dos eritrócitos parasitados com esquizontes de Plasmodium berghei ANKA na desorganização do citoesqueleto e na disfunção da barreira alvéolo-capilar, via RhoA/Rho-kinase, o que pode estar contribuindo com a patogênese da LPA/SDRA associada à malária. / Infections by Plasmodium sp. can lead to a serious respiratory condition with pulmonary complications, named acute lung injury and acute respiratory distress syndrome (ALI/ARDS). Acute inflammation, alveolar endothelium and lung parenchyma injuries, dysfunction and increased permeability of the pulmonary alveolar-capillary barrier and consequent formation of edema characterize this syndrome. Several stimuli can directly increase endothelial permeability through actin microfilaments rearrangement, via Rho- GTPases signaling, leading to endothelial barrier dysfunction. DBA/2 mice infected with Plasmodium berghei ANKA develop ALI/ARDS similar to that observed in humans. The purpose of this research was to assess cytoskeletal changes in DBA/2 mice primary microvascular lung endothelial cells (PMLEC), verify the signaling pathways of the Rho- GTPases and analyze the oxidative stress on these cells in the presence of P. berghei ANKA-infected red blood cells (PbA-iRBC). PMLEC were stimulated by TNF, VEGF or IFN&#947; followed by incubation with PbA-iRBC. Immunofluorescence assays were performed to analyze actin microfilaments rearrangement and microtubules destabilization. Western blot for RhoA, Cdc42 and MLC proteins were conducted to assess alterations in signaling pathways of Rho-GTPases. In addition, a fluorimetric assay was performed to detect the production of reactive oxygen species resulting from PbA-iRBC stimulus. P. berghei ANKA, VEGF, TNF and IFN&#947; stimuli, in association or not, caused morphological disturbances in actin microfilaments of PMLEC and an increase of intercellular spaces. Moreover, immunofluorescence images showed microtubules destabilization and FAK dephosphorylation in these cells, caused by PbA-iRBC. The permeability assay showed that PbA-iRBC induced an increase of microvascular permeability in PMLEC. In addition, PMLEC stimulated by PbA-iRBC, showed elevated production of ROS, which may be contributing to oxidative stress and increasing the damage of endothelial cells, as well as an increase of vascular permeability. Interestingly, these endothelial changes may be related to the increased RhoA/Cdc42 protein expressions ratio, augmented protein expression of phosphorylated MLC and RhoA activation signal. Taken together, these data demonstrate the involvement of P. berghei ANKA-infected red blood cells in cytoskeleton disorganization and alveolar-capillary barrier dysfunction, through of RhoA / Rho-kinase signaling pathway, which may contribute to ALI/ARDS pathogenesis.

Ácidos graxos livres (FFA) são importantes mediadores do transporte de prótons através de membranas. Porém, pouco se sabe sobre a influência estrutural tanto dos FFA como do ambiente lipídico na translocação de prótons através de membranas. Tanto os efeitos do comprimento da cadeia e número de insaturações dos FFA como a composição da membrana foram analisados por medidas elétricas em bicamadas lipídicas planas. Condutância a prótons (GH+) e condutância de vazamento (Gleak) foram calculadas a partir de medidas de voltagem em circuito aberto e de corrente de curto-circuito obtidas através de um eletrômetro ou um amplificador de patch-clamp (modo de voltage-clamp). Nossos resultados mostram que FFA com cis-insaturações causam um efeito mais pronunciado no transporte de próton quando comparados com FFA saturados ou trans-insaturação. Colesterol e cardiolipina diminuem Gleak de membranas. Cardiolipina também diminui GH+. Esses efeitos indicam uma dupla modulação do transporte de prótons: pelo mecanismo de flip-flop dos FFA e por uma via difusional simples adicional. / Free fatty acids (FFA) are important mediatiors of proton transport across membranes. However, little is known about the structural influence of both FFA and the membrane environment have in proton translocation across phospholipid membranes and by which means this influence is brought about. Both the effects of FFA chain length and insaturation and membrane composition on proton transport have been addressed in this study by electrical measurements in planar lipid bilayers. Proton conductance (GH+) and leak conductance (Gleak) were calculated from open-circuit voltage and short-circuit current measurements obtained using either an electrometer or a patch-clamp amplifier (voltage-clamp mode). We found that cis-unsaturated FFA caused a more pronounced effect on proton transport as compared to saturated or trans-unsaturated FFA. Cholesterol and cardiolipin decreased Gleak. Cardiolipin also decreased GH+. These effects indicate a dual modulation of protein-independent proton transport by FFA through flip-flop and by an additional simple diffusional pathway.

Esta tese de Doutorado apresenta três estudos in vitro independentes. Na parte 1, avaliou-se a permeabilidade dentinária após tratamentos dessensibilizantes de consultório e a resistência destes à ciclagem erosiva-abrasiva de 5 dias; na parte 2, avaliou-se a permeabilidade dentinária após aplicação de cremes dentais dessensibilizantes e/ou anti-erosivos durante uma ciclagem erosiva-abrasiva de 5 dias; e na parte 3, avaliou-se a perda de superfície dentinária resultante da utilização dos cremes dentais dessensibilizantes e/ou anti-erosivos em um modelo de ciclagem erosiva-abrasiva inicial. Nas partes 1 e 2 os túbulos dentinários dos espécimes de dentina foram abertos com solução de EDTA e a permeabilidade máxima inicial foi analisada (considerada 100%). Na parte 1, os tratamentos dessensibilizantes de consultório foram realizados e a permeabilidade dentinária reavaliada (%Lp-após tratamento). Em ambos estudos, os espécimes passaram por uma ciclagem erosivaabrasiva de 5 dias. Cada dia consistiu em 4 imersões em ácido cítrico (2 min, 1%, pH ~2,6), com exposição à saliva humana clarificada por 60 min entre os desafios erosivos. Trinta minutos após o primeiro e último desafios erosivos, os espécimes foram escovados em máquina de escovação (2 N, 45 ciclos) totalizando 2 minutos de exposição às suspensões formadas por creme dental e saliva humana. Na parte 1, foi utilizado um creme dental fluoretado convencional para todos os grupos e na parte 2, cremes dentais de acordo com cada grupo. Ao final dos 5 dias de ciclagem, a permeabilidade dentinária final (%Lp-após ciclagem) foi avaliada. Os mesmos cremes dentais testados na parte 2 também foram testados quanto à perda de superfície (PS) na parte 3. Para isso, os espécimes tiveram duas partes das superfícies protegidas com uma fita adesiva de forma a deixar uma área central exposta e, então, foram submetidos a 5 ciclos de erosão-abrasão iniciais. Em cada ciclo os espécimes foram imersos em saliva artificial (60 minutos; pH 7), e em ácido cítrico (3 minutos; 1%; pH 3,6). Então, os espécimes foram escovados em máquina de escovação (2 N; 25 ciclos) com as suspensões formadas pela mistura dos cremes dentais com saliva artificial, totalizando 2 minutos de exposição às suspensões. Para cada estudo, os dados de %Lp e PS foram estatisticamente analisados. Parte 1: Os grupos NUPRO e Gluma Desensitizer foram os únicos que apresentaram menor %Lp quando comparados com controle negativo (p=0,026 e p=0,022; respectivamente), em ambos os tempos analisados. Parte 2: Os cremes dentais Regenerate e Sensodyne Pronamel apresentaram menor %Lp em comparação com o grupo controle negativo (p<0,05). Parte 3: Os grupos apresentaram diferentes graus de PS independente da indicação comercial, sendo o Elmex Erosion Protection, o único grupo com baixa PS que se diferenciou do controle positivo (p=0,031). Pode-se concluir que os tratamentos de consultório NUPRO e Gluma Desensitizer e os cremes dentais Regenerate e Sensodyne Pronamel foram os melhores em diminuir a %Lp, no modelo estudado. Em relação à PS, em um modelo de ciclagem erosiva-abrasiva inicial, os cremes dentais apresentaram diferentes graus de PS, independente da indicação comercial, tendo o Elmex Erosion Protection mostrado o resultado mais promissor. / This PhD thesis presents three independent in vitro studies. At part 1, dentine permeability was evaluated after in-office desensitizing treatments and their resistance to an erosive-abrasive cycling of 5 days; at part 2, dentine permeability was evaluated after application of desensitizing and/or anti-erosive toothpastes during an erosive-abrasive cycling of 5-day; and at part 3, dentine surface loss resulting from the use of desensitizing and/or anti-erosive toothpastes in an initial erosive-abrasive cycling model was evaluated. At parts 1 and 2 the dentinal tubules were opened with EDTA solution and the initial maximum permeability was analyzed (considered 100%). At part 1, the in-office desensitizing treatments were performed and the dentine permeability was reevaluated (%Lp-after treatment). In both studies, the specimens underwent a 5-day erosive-abrasive cycling. Each day consisted of 4 immersions in citric acid (2 minutes, 1%, pH ~ 2.6), and exposure to clarified human saliva for 60 minutes between the erosive challenges. Thirty minutes after the first and the last erosive challenge, the specimens were brushed in a brushing machine (2 N, 45 cycles) totalizing 2 minutes of exposure to the slurries formed by the mixture of toothpaste and human saliva. At part 1, a regular fluoride toothpaste was used for all groups and at part 2, the toothpastes were used according to each group. After the 5 days of cycling, the final dentine permeability (%Lp-after cycling) was evaluated. The same toothpastes tested at part 2 were also analyzed for surface loss (SL) at part 3. For this, the specimens had two parts of the surfaces protected with an adhesive tape leaving a central area exposed, and then were submitted to 5 cycles of initial erosion-abrasion. In each cycle, the specimens were immersed in artificial saliva (60 minutes, pH 7) and in citric acid (3 minutes, 1%, pH 3.6). Then, the specimens were brushed in a brushing machine (2 N, 25 cycles) with the slurries formed by the mixture of the toothpastes with artificial saliva, also totalizing 2 minutes of exposure to the slurries. For each study, the data of %Lp and SL were statistically analyzed. Part 1: The groups NUPRO and Gluma Desensitizer were the only ones that presented lower %Lp when compared to the negative control (p=0.026 and p=0.022, respectively), at both periods analyzed. Part 2: Regenerate and Sensodyne Pronamel toothpastes presented lower %Lp compared to the negative control group (p<0.05). Part 3: The groups showed different degrees of SL regardless of the claim of the toothpaste. Elmex Erosion Protection was the only group with low SL that differed from the positive control (p=0.031). It can be concluded that the in-office treatments NUPRO and Gluma Desensitizer, and the toothpastes Regenerate and Sensodyne Pronamel were able to significantly reduce the %Lp, in the model studied. Considering the SL, analyzed with an initial erosive-abrasive cycling model, toothpastes presented different degrees of SL, regardless of their claim, and Elmex Erosion Protection showed the most promising results.

Tamarindus indica L. é um componente natural amplamente consumido por humanos, apresentando propriedade antiinflamatória, antidiabética e antihepatotóxica. Além disso, como nós demonstramos previamente, o extrato apresenta atividade hipolipêmica e antioxidante. Neste trabalho, nós demonstramos o efeito do extrato de T. indica sobre mitocôndrias isoladas de fígado de rato. Na presença de Ca2+, o extrato causou um inchamento osmótico mitocondrial concentração-dependente, associado ao aumento da velocidade basal (V4), dissipação do potencial de membrana e liberação do Ca2+ pré-acumulado, os quais foram inibidos por ciclosporina A (CsA) e assim atribuídos a transição de permeabilidade da membrana mitocondrial (TPMM). A indução do inchamento osmótico mitocondrial foi prevenida por EGTA e vermelho de rutênio, indicando a dependência da TPMM de Ca2+. A oxidação de proteínas tiol mitocondrial, um mecanismo bem estabelecido como causador da TPMM, foi detectado. Entretanto, nenhuma alteração significante foi observada no estado redox de GSH. A oxidação de NAD(P)H e o acúmulo de espécies reativas de oxigênio produzidas pela mitocôndria foram observadas, em ambos os casos, foram prevenidas por CsA e/ou EGTA, indicando que são conseqüências da TPMM induzida pelo extrato de T. indica. Portanto, sem aparente envolvimento do estresse oxidativo no processo, sugerindo uma interação direta de compostos do extrato com grupos tiólicos de proteínas da membrana. O extrato de T. indica induziu uma depleção de ATP associada à TPMM, mostrando assim potencial para causar a morte celular por apoptose ou necrose, resultante da indução da TPMM por si ou pela depleção do ATP via TPMM. In vitro, o extrato apresentou capacidade scavenger de radicais livres, verificado pelo ensaio do DPPH, radical superóxido e radical hidroxil; e ainda foi capaz de diminuir a lipoperoxidação mitocondrial. Além disso, em baixas concentrações, o extrato mostrou uma propriedade quelante de Fe2+. / Tamarindus indica L. is a natural dietary component widely consumed by humans, presenting well established anti-inflammatory, anti-diabetic and anti-hepatotoxic properties. In addition, as we have previously demonstrated, extract presents hypolipemic and antioxidant activities. We show here the effects of T. indica extract on isolated rat liver mitochondria. In the presence of Ca2+, the extract caused mitochondrial concentration-dependent swelling, associated to, resting respiration increase (V4), membrane potential dissipation and release of pre-accumulated Ca2+, inhibited by cyclosporine A (CsA) and thus ascribable to mitochondrial permeability transition (MPT). This swelling induction was prevented by EGTA and ruthenium red, indicating strict dependence of MPT on Ca2+. Oxidation of mitochondrial membrane protein thiols, a well established mechanism causing MPT was detected. However, no significant change was observed in the GSH redox state, and the NADPH oxidation and accumulation of mitochondria-generated reactive oxygen species that was observed, were prevented by CsA and/or EGTA, indicating that they are consequence of the MPT induced by T. indica extract. Therefore, no apparent oxidative stress condition is involved as cause of this process suggesting that direct interaction with membrane protein thiol groups of the compounds responsible for MPT induction occurs. T. indica extract led to MPTassociated ATP depletion, thus showing the potential to cause cell death by apoptosis or necrosis resulting from MPT induction per se or from ATP depletion by MPT. In vitro, the extract presented free radical scavenging ability, as assessed by the 2,2-diphenyl-1- picrylhydrazyl (DPPH), superoxide radicals and radical hydroxyl assays, and led to decreased lipid peroxidation in mitochondria, as assessed by the thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) assay. In addition, the extract showed an iron chelanting property in low concentrations.

L’épithélium intestinal, siège de l’absorption des (micro)-nutriments est aussi le premier système de défense de l’organisme. Un déséquilibre dans l’homéostasie peut être à l’origine d’une réaction inflammatoire associée à des défauts de la barrière intestinale et de la fonction immunitaire, ainsi qu’une malabsorption des nutriments, comme rencontré dans les MICI (Maladies Inflammatoires Chroniques de l’Intestin), dans les stratégies de fortification en micronutriments et les pathologies non transmissibles (obésité). Il est donc important de trouver des moyens d’action, via l’alimentation par exemple, pour prévenir ou au minima réduire, les conséquences nutritionnelles et pathologiques de l’inflammation intestinale, et de comprendre les mécanismes impliqués. Parmi les modèles d’études de l’intestin, les modèles in vitro de culture cellulaire sont de plus en plus utilisés et permettent d'évaluer les mécanismes moléculaires d'une manière simple et reproductible et de réduire l'expérimentation animale.Dans ce contexte et dans le but d’étudier l’interaction de composés bioactifs de l’alimentation avec l’intestin en état d’inflammation, le premier objectif de ce travail de thèse a été la mise au point d’un modèle in vitro d’intestin enflammé associant en co-culture deux lignées intestinales humaines : les Caco-2 TC7 (entérocytes) et HT29-MTX (cellules caliciformes) et une lignée immunitaire de macrophages (THP1). Plusieurs marqueurs d’inflammation ont été évalués et nous avons pu montrer que le modèle de tri-culture répondait à un stimulus inflammatoire (LPS/IFNγ), par une augmentation de la production de cytokines pro-inflammatoires (TNF-α, IL6 et IL8) et d’enzymes (INOS et COX2) ainsi que l’expression de leurs gènes. Par ailleurs, une augmentation de la perméabilité épithéliale via une altération des jonctions serrées (TJs) a également pu être mise en évidence ainsi qu’une surproduction de mucus, lesquels sont des caractéristiques reconnus d’inflammation.Le deuxième objectif était d’étudier l’interaction de la β-cryptoxanthine (BCX), caroténoïde des agrumes, lipophile et anti-oxydant, avec le modèle enflammé. Nous avons utilisé pour solubiliser la BCX deux types de micelles (artificielles et physiologiques) et étudié les marqueurs d’inflammation. Bien qu’il semble d’après les résultats préliminaires que les micelles de BCX montrent une tendance à diminuer la production de certaines cytokines (IL6 et IL8), le rôle des constituants des micelles (Tween 40 ou sels biliaires/phospholipides) dans ce phénomène observé et dans la perméabilité épithéliale reste à clarifier par la suite. / The intestinal epithelium, main place of the absorption of (micro)-nutrients is also the first body's defense system. An imbalance in homeostasis can lead to an inflammatory reaction associated with defects in the intestinal barrier and immune function as well as malabsorption of nutrients, as seen in IBD (Inflammatory Bowel Diseases), in micronutrient fortification strategies and noncommunicable diseases (obesity). It is therefore important to find ways of action, for example through diet, to prevent or at least reduce the nutritional and pathological consequences of intestinal inflammation, and to understand the mechanisms involved. Among intestinal models, in vitro cell culture models are increasingly used and allow to evaluate the molecular mechanisms in a simple and reproducible way and to reduce animal experimentation.In this context and in order to study the interaction of dietary bioactive compounds with the intestine in state of inflammation, the first objective of this work was the development of an in vitro model of inflamed intestine combining in co-culture two human intestinal cell lines: Caco-2 TC7 (enterocytes) and HT29-MTX (goblet cells) and an immune cell line of macrophages (THP1). Several inflammation markers were evaluated and we were able to show that the tri-culture model responded to an inflammatory stimulus (LPS / IFNγ), by increasing the production of pro-inflammatory cytokines (TNF-α, IL6 and IL8) and enzymes (INOS and COX2) as well as the expression of their genes. In addition, an increase of epithelial permeability via tight junctions (TJs) alteration has also been demonstrated, as well as overproduction of mucus, which are recognized inflammation characteristics.The second objective was to study the interaction of β-cryptoxanthin (BCX), a lipophilic and antioxidant carotenoid of citrus, with the inflamed model. To solubilize BCX, we used two types of micelles (artificial and physiological) and studied markers of inflammation. Although it appears from the preliminary results that BCX micelles show a tendency to decrease the production of some cytokines (IL6 and IL8), the role of micelle constituents (Tween 40 or bile salts / phospholipids) in the phenomenon observed and in the epithelial permeability remains to be therefore clarified.

Atrionatriuretisches Peptid (ANP) moduliert die Barrierenfunktion in endothelialen Monolayers; jedoch sind die Mechanismen noch unklar. Wir überprüften die Hypothese, inwiefern die ANP-Wirkung auf die Permeabilität (P) abhängig ist von einem veränderlichen Gleichgewicht der Nukleotide cyclic GMP (cGMP) und cyclic AMP (cAMP), und hierbei der C-ANP-Rezeptor ein funktionelle Bedeutung aufweist. Die ANP-Wirkung wurde hierbei in koronaren (CEC) and aortalen Endothelzellen (AEC) im Vergleich untersucht. Die endotheliale Makromolekülpermeabilität (P) wurde aus dem Übertritt von Trypanblaugelabelten Albumin über das Monolayer ermittelt. Wir erfassten neben der Permeabilität den zellulären Gehalt von cGMP und cAMP, mit und ohne Pertussitoxin (PT), mit dem Proteinkinase G -Inhibitor KT 5823 und mit beiden Substanzen in Kombination. Dann wiederholten wir die gesamte Versuchsserie mit dem ANP-Derivat C-ANP, das selektiv nur an den C-ANP-Rezeptor bindet. Ergebnisse: In CEC verursachte ANP (100nM) eine Abnahme der P (48%+/-7%, mean +/- SD, N=6, p / Atrial natriuretic peptide (ANP) improves the barrier function in primary cultures of endothelial monolayers; however, the mechanism is unclear. We tested the hypothesis that the ANP-induced alteration in endothelial permeability is related to an altered balance between cyclic GMP (cGMP) and cyclic AMP (cAMP) via functional involvement of the C-ANP-receptor in coronary endothelial (CEC) and aortic endothelial (AEC) cells. Endothelial macromolecule permeability (P) was determined by passage of trypan-blue-labeled albumin across rat coronary and porc aortic endothelial monolayers. We measured permeability, as well as cGMP and cAMP, with or without pertussis toxin (PT), the protein kinase G inhibitor KT 5823, and both in combination. Next, we repeated this entire series, giving the truncated ANP-derivate C-ANP, which binds only to the C-ANP-receptor. We found: In CEC ANP (100nM) caused a decrease in P (48%+/-7%, mean +/- SD, N=6, p