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La lipase pancréatique apparentée de type 2 du cobaye (GPLRP2) hydrolyse une grande variété de substrats lipidiques. Elle montre cependant une sélectivité selon l’organisation supramoléculaire du substrat et la présence de surfactants comme les sels biliaires (NaTDC). Nous avons utilisé la spectroscopie infrarouge (FTIR) pour étudier les interactions entres les phospholipides (DPPC), les surfactants et la GPLRP2 dans des conditions expérimentales proches de celles du tractus digestif. Pour étudier l’étape d’adsorption indépendamment de l’hydrolyse, un variant inactif de GPLRP2 (S152G) a été produit. Diverses dispersions aqueuses de phospholipides ont été préparées : des vésicules multilamellaires (MLV), unilamellaires (LUV) et des micelles mixtes DPPC-surfactant. GPLRP2 hydrolyse le DPPC présent dans des micelles mixtes DPPC-NaTDC mais n’a aucune activité sur le DPPC en phase lamellaire ou présent dans des micelles DPPC-Triton X100. L’analyse par FTIR de l’interaction de GPLRP2 S152G avec le système DPPC-NaTDC montre des changements importants dans le désordre conformationnel et la mobilité des chaînes acyles, la déshydratation de l’interface, l’orientation des têtes polaires et leurs liaisons hydrogène. Aucun effet n’est observé avec les MLV, les LUV ou le système DPPC-Triton X100. Il y a ainsi une reconnaissance spécifique du DPPC dans les micelles mixtes avec les sels biliaires, en accord avec l’activité enzymatique de GPLRP2. Les changements du spectre IR pendant l’hydrolyse du DPPC par la GPLRP2 ont été suivis. Certaines caractéristiques attribuées à la formation de produits de lipolyse peuvent être utilisées pour une étude quantitative de la lipolyse par FTIR. / Guinea pig pancreatic lipase-related protein type 2 (GPLRP2) hydrolyzes a large set of lipid substrates, but displays however some selectivity depending on the supramolecular structure of substrate and the presence of surfactants like bile salts (NaTDC). We used Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy to study the interactions between phospholipids (DPPC), surfactants and GPLRP2 under conditions close to those of the GI tract. To study the adsorption step independently from hydrolysis, a GPLRP2 inactive variant (S152G) was produced. Various phospholipid dispersions were prepared: multilamellar (MLV) and large unilamellar vesicles (LUV) and mixed micelles with surfactants. GPLRP2 was found to hydrolyze DPPC present in mixed DPPC-NaTDC micelles but was inactive on DPPC vesicles and DPPC-Triton X100 micelles. FTIR analysis of GPLRP2 S152G interaction with the DPPC-NaTDC system showed a decrease in the conformational disorder and mobility of the acyl chains, a dehydratation of the interface, and changes in the orientation and H-bonding of DPPC polar head-groups. These effects were not observed with MLV, LUV and DPPC-Triton X100 micelles, thus indicating a specific recognition of DPPC in mixed phospholipid-bile salt micelles, in agreement with phospholipase activity measurements. Changes in the IR spectra during DPPC hydrolysis by GPLRP2 were monitored. Specific spectral features were associated to the production of lipolysis products and could be used for quantifying phospholipid lipolysis by FTIR.

We have carried out structural studies on bovine pancreatic phospholipase A2 (BPLA2) and two proteins involved in molybdenum cofactor (Moco) biosynthesis pathway. In addition, molecular-dynamics simulations and other analyses have been performed to corroborate the findings obtained from the crystal structures. Crystal structures of the three active-site mutants (H48N, D49N and D49K) of BPLA2 were determined to understand the mechanism by which the mutant H48N is able to catalyze the reaction of phospholipid hydrolysis and to see the effect of the loss of Ca 2+ ion in the active site of D49N and D49K mutants. We found that Asp49 could possibly play the role of a general base instead of His48 in the case of the H48N mutant. In the case of D49N and D49K mutants, the active site of the enzyme is perturbed, whereas the overall tertiary structure of these mutants is intact. In addition, a total of 24 invariant water molecules were identified in all of the crystal structures of BPLA2 available in its archive, PDB. Out of these, four water molecules are essential for the catalytic activity, whereas, the remaining water molecules play a role in the stability of the enzyme. In addition, structural studies on two proteins MoaC and MogA involved in Moco biosynthesis pathway have been carried out. For the first time, crystal structure of MoaC bound with GTP molecule has been reported. The gene id TTHA0341, which is mentioned as MoaB in the CMR database, was annotated as MogA based the comparative analysis of sequences and structures (with the present work and the structures available in the literature). The role of N-and C-termini of MoaB and MogA proteins were proposed that these residues might stabilize the substrate and/or product molecule in the active site. In addition, the residues involved in the oligomerization are compared with MD simulations. The molecular docking studies show that MoaB proteins show more preference to GTP than ATP. The comparison of the two active (MPT and AMP-binding) sites revealed that MPT-binding site is preferred over AMP-binding site for nucleotide binding.

Hintergrund: Der Phospholipase A2 Rezeptor 1 (PLA2R1) ist ein Typ 1 Transmembranrezeptor, welcher der Mannose-Rezeptor-Familie zugeordnet werden kann. Die Bedeutung von PLA2R1 für physiologische und pathologische Vorgänge ist noch weitestgehend unbekannt. Jedoch wird die Regulation wichtiger zellulärer Prozesse, wie Proliferation, Apoptose/ Seneszenz, Adhäsion, Migration/ Invasion und Inflammation im Zusammenhang mit dem Rezeptor diskutiert. Darüber hinaus ist eine Änderung der PLA2R1-Expression bei der Entstehung verschiedenster Krebserkrankung nachweisbar. Hierbei wird der Rezeptor einerseits mit einer pro-onkogenen und pro-migratorischen Wirkung in Verbindung gebracht. Andererseits ist ein tumorsuppressiver Effekt von PLA2R1 und eine Induktion der mitochondrialen Apoptose in Tumorzellen beschrieben. Zudem ist die Expression von PLA2R1 durch epigenetische Mechanismen kontrolliert und eine Promotor-Hypermethylierung ist assoziiert mit einer Repression der Rezeptor-Expression in der Prostatakarzinom (PCa)-Zelllinie LNCaP und der pädiatrischen, akuten lymphoblastischen Leukämie (ALL)-Zelllinie Jurkat. Vorangegangene Arbeiten zeigten eine Hypermethylierung innerhalb eines definierten Bereiches des PLA2R1-Promotors bei adulten Patienten mit akuter myeloischer Leukämie und Myelodysplastischem Syndrom (MDS) sowie eine Korrelation der PLA2R1-Promotormethylierung mit dem Krankheitsstadium und der Klassifizierung nach dem Internationalen Prognostischen Scoring System (IPSS). Fragestellung/ Hypothese: Das Ziel der vorliegenden Arbeit war einerseits die Untersuchung der Funktion von PLA2R1 in den PCa-Zelllinien LNCaP und PC-3. Während in LNCaP die Rezeptor-Expression durch Promotor-Hypermethylierung unterdrückt ist, kann in PC-3-Zellen eine Hochregulation von PLA2R1 im Vergleich zu normalen Prostataepithelzellen nachgewiesen werden. Durch in vitro Transfektionsexperimente sollte der Effekt einer Re-expression von PLA2R1 in LNCaP-Zellen sowie die Auswirkungen einer Reduktion der PLA2R1-Expression in PC-3-Zellen untersucht werden. Der Einfluss der veränderten PLA2R1-Expressionslevel auf wichtige Zellparameter wurde evaluiert. Die in vitro Daten der PCa-Zelllinien wurden mit den in vivo Ergebnissen des Tumorwachstums von transfizierten LNCaP- und PC-3-Zellen in Xenograft-Mausmodellen verglichen. Andererseits sollte basierend auf den Ergebnissen von adulten Patienten mit AML- und MDS-Diagnose und der dabei festgestellten Hypermethylierung des Rezeptor-Promotors der Methylierungsstatus des Rezeptors bei der pädiatrischen ALL untersucht werden. Überdies sollte die Eignung der PLA2R1-Methylierungsanalyse als sensitiver Biomarker für die Therapiekontrolle, Überwachung der minimalen Resterkrankung (MRD) und Risikostratifizierung der pädiatrischen ALL evaluiert werden. Die Funktion des Rezeptors im Kontext der pädiatrischen ALL wurde durch eine transfektionsbasierte Re-expression von PLA2R1 in der Jurkat-ALL-Zelllinie untersucht. Durch in vitro Experimente wurden die Auswirkungen der verschiedenen PLA2R1-Expressionslevel auf Proliferation und Apoptose/ Nekrose in transfizierten Jurkat-Zellen analysiert. Material und Methoden: Durch Transfektion mit einem PLA2R1-Expressionsvektor konnte eine stabile Überexpression des Rezeptors in LNCaP- (LNCaP-PLA2R1) und Jurkat-Zellen (Jurkat-PLA2R1) erreicht und die Ergebnisse mit Kontrollvektor-transfizierten LNCaP- (LNCaP-Ctrl) und Jurkat-Zellen (Jurkat-Ctrl) verglichen werden. Mittels CRISPR/Cas9-Knockdown konnte eine Verminderung der PLA2R1-Expression in PC-3-Zellen (PC-3-KD) im Vergleich zu Kontrollvektor-transfizierten PC-3-Zellen (PC-3-Ctrl) erreicht werden. Genexpressionsanalysen wurden mittels quantitativer PCR nach reverser Transkription (RT-qPCR) durchgeführt und die Proteinsynthese des Rezeptors durch Western Blot Analyse überprüft. In vitro sollten die Auswirkungen der differenziellen PLA2R1-Expression der transfizierten Zellen auf wichtige proliferative und metastatische Zellparameter untersucht werden. Die Zellviabilität/ Proliferation wurde mittels WST-1 Assay für adhärente Zellen und Zellwachstumskurven-Analyse mit Trypanblau-Färbung bei Suspensionszellen analysiert. Zellmotilität und Proliferation wurden bei transfizierten PCa-Zelllinien mithilfe des Wundheilungsassays beurteilt. Apoptose konnte durch Wasserstoffperoxid stimuliert und mittels Caspase-Glo® 3/7 Assay und RealTime-Glo™ Annexin V Apoptosis and Necrosis Assay für transfizierte PCa-Zelllinien sowie durchflusszytometrische Analysen nach Annexin-V-FLUOS/ Hoechst 33258 Färbung für transfizierte Jurkat-Zellen untersucht werden. Die klonogene Überlebensrate und das Koloniewachstum der transfizierten PCa-Zelllinien sollten mithilfe des klonogenen Assays analysiert werden. In einer in vivo Pilotstudie wurde der Effekt von PLA2R1 auf das Tumorwachstum mittels Xenograft-Mausmodellen (männliche SCID/beige Mäuse) durch subkutane Injektion der transfizierten LNCaP- (n = 5) und PC-3-Zellen (n = 9) überprüft. Die PLA2R1-Promotormethylierung als sensitiver Biomarker für die pädiatrische ALL wurde durch Isolation und Bisulfit-Behandlung der genomischen DNA von Knochenmark (KM)-Aspiraten und Leukozyten des peripheren Blutes (PB) von ALL-diagnostizierten Kindern (n = 44) sowie einer anschließenden Analyse mittels digitaler PCR (dPCR) evaluiert. Die Ergebnisse konnten mit dem Methylierungsstatus einer gesunden Kontrollgruppe (n = 20) verglichen werden. Ergebnisse und Schlussfolgerungen: In LNCaP-PLA2R1 und Jurkat-PLA2R1 konnte im Gegensatz zu den dazugehörigen Kontrollzellen eine stabile Überexpression des Rezeptors auf Ebene der Genexpression und Proteinsynthese detektiert werden. Bei PC-3-KD-Zellen war eine Reduktion der PLA2R1-Genexpression und eine Repression der Proteinsynthese unterhalb der Nachweisgrenze des Western Blot Assays zu verzeichnen, während PC-3-Ctrl-Zellen eine Genexpression und Proteinsynthese des Rezeptors zeigten. Die Zellviabilität/ Proliferation und Motilität war signifikant erhöht in LNCaP-PLA2R1 und PC-3-Ctrl im Vergleich zu LNCaP-Ctrl- und PC-3-KD-Zellen. Demgegenüber war eine Verminderung von Apoptose und Koloniewachstum in LNCaP-PLA2R1 und PC-3-Ctrl-Zellen nachweisbar. Durch Genexpressionsanalysen konnte eine Induktion der Expression von Fibronektin 1 (FN1), TWIST Homolog 1 (TWIST1) und Cyclin-abhängige Kinase 6 (CDK6) in LNCaP-PLA2R1-Zellen identifiziert werden. In vivo schien die PLA2R1-abhängige negative Regulation des Koloniewachstums die pro-onkogenen Eigenschaften des Rezeptors zu überwiegen. Dies resultierte in einem verminderten Tumorwachstum von LNCaP-PLA2R1 und einer tumorsuppressiven Rolle des Rezeptors in dieser PCa-Zelllinie. Im Gegensatz dazu zeigten PC-3-Ctrl-Zellen ein schnelleres Tumorwachstum im Xenograft-Mausmodell, was für einen pro-onkogenen Effekt der endogenen PLA2R1-Expression in PC-3-Zellen sprechen würde. Der differenzielle Einfluss von PLA2R1 auf die Regulierung des Tumorzellwachstums könnte im Zusammenhang mit der veränderten Expression von FN1, TWIST1 und CDK6 stehen, jedoch sind weiterführende Experimente nötig, um die Beteiligung dieser Gene in der PLA2R1-Signaltransduktion zu untersuchen. Die Analyse der Zellwachstumskurve der transfizierten Jurkat-Zellen zeigte eine Abnahme der Proliferationsrate und eine Zunahme des Anteils an toten Zellen bei Jurkat-PLA2R1 im Vergleich zu Jurkat-Ctrl-Zellen. Durchflusszytometrische Analysen bestätigten eine Abnahme des Anteils gesunder sowie eine vermehrte Repräsentation von apoptotischen und nekrotischen Jurkat-PLA2R1-Zellen im Vergleich zur Kontrolle, was einen tumorsuppressiven Einfluss des Rezeptors bei der pädiatrischen ALL suggeriert. Die Funktion von PLA2R1 als Tumorsuppressor steht im Einklang mit der festgestellten Hypermethylierung des Rezeptor-Promotors in KM-Aspiraten und PB-Proben von pädiatrischen Patienten mit prä-B und common ALL zum Zeitpunkt der Diagnose der primären Krebserkrankung und des ALL-Rezidives im Vergleich zu der Kontrollgruppe. Der parallele Abfall der PLA2R1-Promotormethylierung und der relativen Blastenzahl im Verlauf der ALL-Induktionstherapie sowie eine signifikante, positive Korrelation beider Größen in KM- und PB-Proben ließen auf die leukämischen Blasten als Quelle der Hypermethylierung des PLA2R1-Promotors schließen. Überdies wiesen Hochrisikopatienten der pädiatrischen ALL eine signifikant höhere PLA2R1-Promotormethylierung am Tag 15 der ALL-Induktionstherapie auf im Vergleich zu Patienten mit einem geringeren Risiko. Zusammenfassend deuteten die in vitro und in vivo Daten auf eine wichtige Funktion des Rezeptors bei der Regulation von Proliferation und Apoptose bei der pädiatrischen ALL hin. Die Analyse der PLA2R1-Promotormethylierung könnte als sensitiver Biomarker zu einer verbesserten ALL-Therapiekontrolle, MRD-Überwachung und Risikostratifizierung während der ALL-Induktionstherapie beitragen.:Inhaltsverzeichnis 1 Zusammenfassung 4 2 Abstract 8 3 Einführung in die Thematik 11 4 Publikation 1: “Diverse Effects of Phospholipase A2 Receptor Expression on LNCaP and PC-3 Prostate Cancer Cell Growth in vitro and in vivo” 24 5 Publikation 2: “Methylation of the Phospholipase A2 Receptor 1 Promoter Region in Childhood B Cell Acute Lymphoblastic Leukaemia” 25 6 Diskussion und Ausblick 26 7 Literaturverzeichnis 32 8 Danksagung 41 9 Anlagen 42 / Background: The phospholipase A2 receptor 1 (PLA2R1) is a type I transmembrane receptor and a member of the mannose receptor family. Physiological and pathophysiological functions of PLA2R1 are still not completely understood. However, PLA2R1 expression is discussed to have an impact on proliferation, apoptosis/ senescence, adhesion, migration/ invasion as well as inflammatory cell responses and divergent PLA2R1 expression is detectable in different types of cancer compared to corresponding normal tissues. In this context, receptor expression is linked to both a pro-oncogenic/ pro-migratory and a tumour-suppressive/ pro-apoptotic impact in different cancer cells. Moreover, PLA2R1 expression is controlled by epigenetic mechanisms and hypermethylation of the PLA2R1 promoter is associated with silenced expression of the receptor in the prostate carcinoma (PCa) cell line LNCaP and the paediatric, acute lymphocytic leukaemia (ALL) cell line Jurkat. Previous work revealed a defined hypermethylated region of the PLA2R1 promoter in adult patients with acute leukaemia and myelodysplastic syndrome (MDS). PLA2R1 promoter methylation correlated with disease stage and International Prognostic Scoring System (IPSS) classification. Aim: The aim of the present study was to evaluate the function of PLA2R1 in PCa cell lines LNCaP and PC-3. The receptor expression is silenced in LNCaP but upregulated in PC-3 cells compared to normal prostate epithelial cells. A pilot in vivo study addressed the effects of PLA2R1 in mice xenografted with transfected LNCaP and PC-3 cells. Based on previous findings of PLA2R1 promoter hypermethylation in adult ALL and MDS patients, the aim of the present study was to analyse the methylation status of the PLA2R1 promoter in paediatric ALL patients compared to healthy individuals. PLA2R1 methylation analysis was evaluated as sensitive biomarker for ALL treatment response, minimal residual disease (MRD) monitoring, and risk stratification. The impact of the receptor in childhood ALL was investigated by transfection-based re-expression of PLA2R1 in the paediatric ALL cell line Jurkat and the effect of different PLA2R1 expression levels on proliferation and apoptosis/ necrosis was analysed in in vitro experiments. Material and Methods: Stable PLA2R1 overexpression was achieved by transfection of LNCaP (LNCaP-PLA2R1) and Jurkat cells (Jurkat-PLA2R1) with a PLA2R1 plasmid vector. Results were compared to control vector transfected LNCaP (LNCaP-Ctrl) and Jurkat cells (Jurkat-Ctrl). Alternatively, PLA2R1 was knocked down using CRISPR/Cas9 in PC-3 cells (PC-3-KD) and compared to the corresponding control-transfected cells (PC-3-Ctrl). Gene expression analysis was conducted by quantitative reverse transcription PCR (RT-qPCR). PLA2R1 protein synthesis was analysed by western blot. The impact of the differential PLA2R1 expression on proliferative and metastatic parameters of transfected cancer cells was investigated in vitro. Cell viability/ proliferation was assessed by means of WST-1 Assay for adherent cells and via cell growth curve analysis after trypan blue staining for suspension cells. Cell motility and proliferation of transfected PCa cell lines were estimated by wound healing assay. Hydrogen peroxide-stimulated apoptosis was analysed by Caspase-Glo® 3/7 Assay and RealTime-Glo™ Annexin V Apoptosis and Necrosis Assay for transfected PCa cell lines and flow cytometric analysis after Annexin-V-FLUOS/ Hoechst 33258 staining for transfected Jurkat cells. Colony formation of transfected PCa cell lines was evaluated by clonogenic assay. A pilot in vivo study addressed the effects of PLA2R1 in mice xenografted with transfected LNCaP (n = 5) and PC-3 cells (n = 9). Evaluating PLA2R1 promoter methylation as sensitive biomarker for paediatric ALL, genomic DNA was isolated from bone marrow (BM) and peripheral blood (PB) of 44 paediatric ALL patients. After bisulfite treatment of isolated DNA samples, PLA2R1 methylation was analysed using digital PCR and compared to 20 healthy controls. Results and Conclusions: PLA2R1 gene expression and protein synthesis were detectable in LNCaP-PLA2R1, PC-3-Ctrl, and Jurkat-PLA2R1 cells but not in LNCaP-Ctrl and Jurkat-Ctrl cells. In PC-3-KD cells, PLA2R1 gene expression was significantly reduced compared to PC-3-Ctrl and PLA2R1 protein synthesis of PC-3-KD cells was below the limit of detection of western blot analysis. Cell viability/proliferation and motility were significantly increased in LNCaP-PLA2R1 and PC-3-Ctrl compared to LNCaP-Ctrl and PC-3-KD cells, respectively. However, levels of apoptosis and clonogenicity were reduced in LNCaP-PLA2R1 and PC-3-Ctrl cells. Gene expression analysis revealed an up-regulation of fibronectin 1 (FN1), TWIST homolog 1 (TWIST1), and cyclin-dependent kinase 6 (CDK6) in LNCaP-PLA2R1 compared to control cells. In LNCaP xenografts, PLA2R1-dependent regulation of clonogenicity appeared to outweigh the receptor’s pro-oncogenic properties, resulting in decreased tumour growth, supporting the tumour-suppressive role of PLA2R1. Alternatively, PC-3-Ctrl xenografts exhibited faster tumour growth compared to PC-3-KD cells, suggesting a pro-oncogenic effect of endogenous PLA2R1 expression. The differential growth-regulatory effects of PLA2R1 may be mediated by FN1, TWIST1, and CDK6 expression, although further investigation is required. Cell growth curve analyses of transfected Jurkat cells revealed a decreased proliferation and increased cell death of Jurkat-PLA2R1 compared to Jurkat-Ctrl cells. Flow cytometry confirmed the reduced fraction of healthy cells and an increase of the apoptotic and necrotic fractions in Jurkat-PLA2R1 cells compared to control cells, suggesting a tumour-suppressive effect of the receptor in paediatric ALL. PLA2R1’s tumour-suppressive function is in accordance with hypermethylation of the receptor promoter in BM aspirates and PB samples of paediatric patients diagnosed with pre-B and common ALL as well as in patients with disease relapse in comparison to healthy controls. PLA2R1 methylation decreased along with leukaemic blast cell reduction during ALL induction treatment and significant positive correlations between PLA2R1 methylation and leukaemic blast cell numbers of BM and PB samples were observable. Therefore, our data suggests that leukaemic blasts are the origin of PLA2R1 hypermethylation in BM and PB samples. Moreover, high risk paediatric ALL patients exhibited increased levels of PLA2R1 promoter methylation compared to non-high risk groups on day 15 of ALL induction treatment. Collected data indicates that PLA2R1 promoter methylation quantitation can be used as biomarker for ALL induction treatment control, risk stratification, and early detection of ALL relapse.:Inhaltsverzeichnis 1 Zusammenfassung 4 2 Abstract 8 3 Einführung in die Thematik 11 4 Publikation 1: “Diverse Effects of Phospholipase A2 Receptor Expression on LNCaP and PC-3 Prostate Cancer Cell Growth in vitro and in vivo” 24 5 Publikation 2: “Methylation of the Phospholipase A2 Receptor 1 Promoter Region in Childhood B Cell Acute Lymphoblastic Leukaemia” 25 6 Diskussion und Ausblick 26 7 Literaturverzeichnis 32 8 Danksagung 41 9 Anlagen 42

Les canaux potassiques à deux domaines pore sont impliqués dans un grand nombre de mécanismes physiopathologiques. Lors de ma thèse je me suis intéressé à la sous famille TREK dont les membres, TREK-1, TREK-2 et TRAAK jouent un rôle dans la nociception, la dépression et la neuroprotection. Leur activité est finement régulée par des stimuli physicochimiques (Température, étirement, pH), pharmacologiques (anesthésiques volatils, fluxétine,…) et physiologiques (GPCR). Lors de ma thèse je me suis intéressé à deux nouveaux modes de régulation de ces canaux ainsi qu'à leur diversité combinatoire. Tout d'abord j'ai mis en évidence que la phospholipase D2, en interagissant avec TREK1, produit un microenvironnement riche en acide phosphatique qui va potentialiser le canal. Cette régulation explique comment un second messager peut spécifiquement réguler un canal ainsi que la sensibilité de TREK-1 à l'alcool. La seconde étude a porté sur l'hétérodimérisation des membres de la sous-famille TREK. Nous avons mis en évidence grâce à des techniques en molécule unique que les sous-unités TREK-1, TREK-2 et TRAAK peuvent hétérodimériser entre elles. Elles forment ainsi des canaux avec de nouvelles propriétés comme une sensibilité particulière au pH. Enfin j'ai étudié le mécanisme d'action d'une toxine, la mycolactone, sur le canal TRAAK. Nous avons montré que cette toxine est impliquée dans le l'hyperpolarisation des fibres nociceptives induisant une analgésie. Cela étant dû à l'activation du canal TRAAK via le récepteur à l'angiotensine II de type 2. La seconde partie du projet a consisté à caractériser la voie de signalisation non canonique induite par la mycolactone / Two pore potassium channel play a key role in the answers of cells of intra and extracellular signals. I have focus my PhD on the study of sub family TREK (TREK-1, TREK-2 and TRAAK). They involved in the nociception, the depression and the neuroprotection. The activity of this channels is finely tuned by several stimuli i) physicals agents like temperature and mechanical stree, ii) chemicals agents like intra and extracellular pH and phospholipids, iii) pharmacological agents like volatile anesthetics, and iv) neurotransmitters via the G protein–coupled receptor. During my PhD I have worked on two new regulation of this channel and are capacity to make heterodimer. In a first time I discovers that TREK-1 interacted with the phospholipase D2 that permit the local production of phosphatidic acid (PA). This made a PA rich microenvironment, this last will tonicaly potentiate the basal activity of the channel. This mechanism explain have a second massager can specifically regulate a channel and how TREK-1 is sensitive to ethanol. In a second time I have work on the heteromerisation of the sub family TREK. With the single molecule technics we have shown that TREK-1, TREK-2 and TRAAK can heterodimerize. This mechanism increase the functional diversity of the family. To finish I have study the action of the toxin mycolacton on the TRAAK channel. We have shown that the mycolacton induce the hyperpolarization of nociceptive nerfs. This is due to the activation of TRAAK channel by the toxin via the angiotensin 2 receptor type II. Next I have shown that the mycolacton induce a non-canonical pathway. This is independent of G-proteins and spatially restricted by a direct interaction between TRAAK and AT2R

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L. pneumophila, der Erreger der Legionärskrankheit, kodiert für eine Vielzahl lipolytischer Enzyme. Bis zu 17 verschiedenen Proteinen kann aufgrund von Sequenzhomologien oder experimenteller Analyse phospholipolytische Eigenschaft zugeschrieben werden. Neben sekretierten Formen wird eine besonders aktive zell-assoziierte Variante exprimiert, die Phospholipase A/Lysophospholipase A PlaB. Wie bereits gezeigt werden konnte, kodiert das plaB Gen für die hauptsächliche membranständige Phospholipase A von L. pneumophila mit Enzymaktivitäten, die die Aktivität sekretierter Proteine um das 100-fache übersteigen. Da PlaB zu keiner der bisher beschriebenen Phospholipasen Homologien aufweist, wurden in dieser Arbeit durch gezielte Mutagenese die katalytisch wichtigen Aminosäuren identifiziert. Dies ergab, dass PlaB zwar eine für Lipasen und Proteasen typische katalytische Triade aus Serin, Asparat und Histidin ausbildet, die umliegenden Motive sich aber deutlich von bisher beschriebenen Enzymklassen unterscheiden. Somit stellt PlaB das erste näher charakterisierte Mitglied einer neuen Familie phospholipolytischer Enzyme dar. Im Weiteren konnten für die Substratspezifität wichtige Aminosäurereste identifiziert werden. Dabei stellte sich heraus, dass die Fähigkeit zur Hydrolyse von cholinkettentragenden Substraten besonders suszeptibel gegenüber Mutationen war. Da im Vergleich zu nicht-pneumophila Stämmen, wie z. B. L. spiritensis, nur L. pneumophila in der Lage war, diese Lipide in hohem Maße umzusetzen, kann die Eigenschaft von PlaB, Phosphatidylcholin (PC) zu hydrolysieren, einen Virulenzvorteil für L. pneumophila bedeuten. Die Hypothese konnte durch Hämolyse-experimente bestärkt werden. Hier zeigten sich Mutanten mit reduziertem Potential zur Hydrolyse von PC weniger zytotoxisch gegenüber humanen Erythrozyten. Das zell-zerstörende Potential von PlaB könnte somit eine enorme Auswirkung auf die Virulenzeigenschaften von L. pneumophila haben. Wie in der vorliegenden Arbeit untersucht, bestätigten in vitro Experimente, dass PlaB die hauptsächliche Aktivität während einer Makrophageninfektion darstellt, die Deletion des Gens aber keine Auswirkungen auf das Replikationspotential der Bakterien hat. Ganz im Gegenteil dazu waren plaB Insertionsmutanten bei der Infektion von Meerschweinchen in ihrer Vermehrungsfähigkeit in der Lunge als auch in der Verbreitung der Erreger zur Milz der Tiere reduziert. Um den Grund des Defektes näher zu erörtern, wurde in einem Screen auf 40 verschiedene Entzündungsmediatoren die Sekretion von IL-8, MCP-1, RANTES und TIMP-2 als PlaB-abhängig identifiziert. Somit repräsentiert die zell-assoziierte Phospholipase A, PlaB, von L. pneumophila eine neue Klasse lipolytischer Enzyme und kann durch Hydrolyse eines breiten Substratspektrums, insbesondere durch Hydrolyse von PC, die Vermehrung und Verbreitung des Erregers im Wirtsorganismus unterstützen. / L. pneumophila, the causative agent of Legionnaires’ disease (LD) expresses numerous lipolytic enzymes. According to sequence homology or determined lipolytic activities, up to 17 open reading frames of the L. pneumophila genome may encode functional phospholipases. In addition to secreted and/or injected lipolytic enzymes, it was shown that the pathogen expresses a highly active and membrane-bound phospholipase A/lysophospholipase A with hemolytic activity, designated PlaB. As PlaB does not belong to any established bacterial or eukaryotic protein family of lipolytic enzymes nor does it show sequence homology to conserved motifs harboring the catalytically important amino acids, we analyzed putative catalytic centers using site-directed mutagenesis. This study shows that PlaB exhibits a catalytic triad of serine, aspartate and histidine residues, most commonly found within lipolytic and proteolytic enzyme families. However, surrounding motifs differ significantly from described ones. Thus, PlaB is the first representative of a new class of lipolytic enzymes. In addition, we described amino acids important for substrate specificity, revealing that the ability to hydrolyze phosphatidylcholine (PC) is severely susceptible to various mutations. Since PlaB of non-pneumophila strains, such as L. spiritensis, express comparable activities against glycerol-containing lipids, but are reduced in their hydrolytic potential to cleave choline-containing substrates, PC-targeting activity could be an important contribution to the pathogenicity of L. pneumophila, the most common cause of LD. The hypothesis was underlined by reduced hemolytic potential of L. spiritensis PlaB and PC-hydrolysis impaired mutants of L. pneumophila PlaB and is in accordance with PC being the major lipid in the outer leaflet of eukaryotic membranes. The cell destructive properties of PlaB may enhance bacterial pathogenicity in multiple ways. As depicted within this study, PlaB represents the major lipolytic activity present throughout host cell infections; however, gene deletion mutants retained their ability to multiply within several host cell infection systems. On the contrary, the plaB mutant strain was inhibited in replicating in the lung and disseminating to other organs in a guinea pig infection model. To elucidate the impact of PlaB on Legionella virulence we investigated 40 inflammatory factors secreted by lung epithelial cells upon Legionella infection and observed that IL-8, MCP-1, RANTES and TIMP-2 are released in a PlaB-dependent manner. Thus, PlaB represents a new family of lipolytic enzymes which could, according to the lipolytic profile and especially the ability to hydrolyse PC, contribute to replication and dissemination properties of a pathogen within a host cell, e.g. amoeba, or even more complex organisms such as guinea pigs or humans.

Das Bakterium Legionella pneumophila vermehrt sich in Alveolarmakrophagen und kann zu einer Pneumonie, der Legionärskrankheit, führen. Phospholipasen können zur bakteriellen Pathogenität beitragen, indem sie den Wirt durch Zerstörung von Lipidstrukuren schädigen, oder über die Generation von „second messengern“ immunmodulatorisch wirken. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die prominenteste zell-assoziierte und hämolytische Phospholipase A/Lysophospholipase A (PlaB) von L. pneumophila Corby charakterisiert und auf eine mögliche Virulenzassoziation hin untersucht. Die Bestimmung des Transkriptionsstartpunktes von plaB ermöglichte die Identifikation einer möglichen sigma70-Bindungsstelle. Die Transkriptionsrate ist relativ gering und nimmt zur stationären Phase hin ab, das Enzym ist vorwiegend exponentiell aktiv. Enzymatisch aktives PlaB-Protein ist zumindest zum Teil auf der oberflächenexponierten Seite der äußeren Membran lokalisiert. Der Transport des PlaB-Proteins ist nicht vom Tat-abhängigen Transport oder den Sekretionssystemen des Typ I, II oder IVB abhängig. Im Meerschweinchenmodell konnte eine Virulenzassoziation von PlaB nachgewiesen werden. PlaB-defiziente Bakterien zeigten eine geringere Replikationsrate in den Lungen und eine verminderte Kolonisierung der Milz. Vergleichende histologische Studien zeigten eine schwächer ausgeprägte Inflammation und Zerstörung der Lungen nach Infektion mit der plaB-Mutante. Somit handelt es sich bei PlaB um ein innerhalb der Spezies Legionella sehr weit verbreitetes Protein, welches in L. pneumophila Corby vorwiegend vor dem Eintritt in die stationäre Phase exprimiert wird. Enzymatisch aktives PlaB-Protein ist an der oberflächenexponierten Seite der äußeren Membran zu finden und spielt eine wichtige Rolle bei der Entstehung der Legionellen-Pneumonie. / The bacterium Legionella pneumophila replicates inside of alveolar macrophages and causes a severe pneumonia, the Legionnaires` disease. Bacterial phospholipases are well known virulence factors. Some cause cell lysis by pore formation, others generate second messengers and modulate the inflammatory response of the host. The aim of this work was to further characterize the major cell-associated hemolytic phospholipase A/lysophospholipase A activity (PlaB) of L. pneumophila Corby and to investigate a possible role of PlaB as virulence factor. Determination of the transcriptional start site of plaB allowed the identification of a possible sigma70-binding site. The transcription rate is relatively weak and decreases from exponential to stationary phase and enzymatic activity is most prominent in the exponential growth phases. Enzymatically active PlaB-protein is at least in parts localised on the surface-exposed side of the outer membrane. Studies with mutants of the Tat-dependent pathway and the type I, II, IVB secretion systems showed that these pathways are not involved in secretion of the PlaB-protein. Infection of guinea pigs revealed that PlaB plays an important role in proliferation of the bacteria in the lungs and dissemination to the spleen. Comparative histological studies revealed a less extensive inflammation and destruction of the lungs infected with the plaB-mutant strain. In summary, this work revealed that PlaB is a protein which is widespread within Legionella species. In L. pneumophila Corby, it is primarily expressed and active before stationary phase. Enzymatically active PlaB-protein is at least in parts located at the surface-exposed side of the outer membrane and contributes to the establishment of Legionnaires` disease.

Oxidativ modifizierte Phospholipide haben PAF-ähnliche Struktur und zeigen in vitro PAF-ähnliche Wirkung. Dabei handelt es sich hauptsächlich um fragmentierte Phosphatidylcholine, die eine lange Fettsäure- oder Alkylkette in sn-1 Stellung und einen kurzen Acylrest (C4-C9) mit oxidiertem C-Atom in sn-2 Stellung haben und als PAF-ähnliche Lipide bezeichnet werden. In der vorliegenden Arbeit wurden durch eine neue HPLC-Fluoreszenzmethode ein Vertreter dieser in vivo existierender PAF-ähnlichen Lipide im Plasma quantifiziert. Dieses fragmentierte Phosphatidylcholin (FPC) besitzt einen Palmitoylrest in sn-1 Position, sowie eine C3 oder C4 Kette in sn-2 Position und erfüllt damit die strukturelle Voraussetzungen für biologische Aktivität. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass FPC in biologisch aktiven Fraktionen enthalten war, deren biologische Aktivität jedoch nicht von PAF bewirkt wurde, sondern von PAF-ähnlichen Lipiden. Dies unterstützt die Vermutung, dass FPC biologische Aktivität zeigt. Im Plasma wird FPC von Lipoproteinen transportiert. Oxidativer Stress in biologischen Systemen, ausgelöst durch Tabakrauch, Organischämie/ Reperfusion, Vitamin E-Mangel oder Inkubation von Zellen mit H2O2, führte zu einer Erhöhung der FPC-Konzentration. Damit wurde gezeigt, dass die PAF-ähnlichen Lipide in vivo durch Radikal-induzierte Lipidperoxidation gebildet werden können. Trotz eines Konzentrationsanstiegs von FPC nach oxidativem Stress, kam es bei einer systemischen Inflammation, die von Radikal-bildenen Prozessen begleitet ist, jedoch nicht zu einer Anreicherung von FPC-ähnlichen Lipidperoxidationsprodukten. Ursache für die fehlende Anreicherung von oxidativ modifizierten Lipiden bei einer systemischen Inflammation könnte ihr rascher Abbau durch Phospholipasen, oder der Abbau von Vorstufen, bzw. die Substratrminderung, sein. / Oxidative modified phospholipids have PAF like structure and show in vitro PAF like activity. They consist of fragmented phosphatidylcholine with a long fatty acid or alkyl chain in sn-1 position and a short acylrest (C4-C9) with a oxidized C-atom in sn-2 position. According to their structure they are called PAF like lipids. In this paper one representative of these in vivo existing PAF like lipids are quantified in plasma by means of a new fluorescence HPLC method. These fragmented phosphatidylcholines consits of a palmitoylrest in sn-1 position and a C3 or C4 chain in sn-2 position and therefore they fullfill the strutural conditions to have biological activity. We further showed, that the biological active fractions contain FPC. The biological activity is not caused by PAF but by PAF like lipids. This fact supports the hypothesis that FPC are biological active. FPC is carried by lipoproteins in plasma. Oxidative stress caused by cigarette smoke, ischemia/ reperfusion, Vitamin E deficiency or incubation of cells with H2O2 leads to an increase of the concentration of FPC. Thereby it could be shown that PAF like lipids can be formed in vivo by means of radical induced lipidperoxidation. Many radical producing processes are involved in systemic inflammation. Despite of an increase of FPC's concentration after oxidative stress, there was no accumulation of FPC like lipidperoxidation products during systemic inflammation. One reason for the missing accumulation of oxidative modified lipids during systemic inflammation can be the fast degradation by phospholipases or the reduction of substrat.

Legionella pneumophila ist ein fakultativ intrazellulär replizierendes Bakterium und der Erreger der Legionärskrankheit, einer schweren Pneumonie. Das Typ IVB Dot/Icm Proteinsekretionssystem und dessen Effektoren sind wesentlich an der Virulenz des Bakteriums beteiligt. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Charakterisierung der Patatin-ähnlichen Proteine von L. pneumophila - insbesondere von PatA, das vom Dot/Icm Sekretionssystem in Wirtszellen eingeschleußt wird. Im Rahmen dieser Arbeit wurden folgende Ergebnisse erzielt: Die 11 Patatin-ähnlichen Proteine von L. pneumophila zeigen hauptsächlich Lysophospholipase A-Aktivität. PatA besitzt außerdem Phosphatidylglyzerol-spezifische Phospholipase A-Aktivität. Serin-72, welches in ein G-X-S-X-G Lipasemotiv eingebettet ist, ist für die Aktivität des Proteins essentiell. PatA ist nach Expression in A549 Epithelzellen in der Zytoplasmamembran oder einer damit eng assoziierten Struktur lokalisiert, die lipolytische Aktivität ist hierfür nicht entscheidend. Die Deletion einer C-terminalen Proteinregion führt zum Verlust der membranständigen Lokalisation. Virulenzattenuierte L. pneumophila Mutanten bilden unter Präsenz von Amöben - im Gegensatz zu Wildtypstämmen - eine Koloniemorphologie aus, die Scattermorphologie genannt wurde. Auf Basis der Scattermorphologie wurde eine Transposon-mutagenisierte Legionella Klonbank auf Wirtszellkolonisationsdefekte überprüft. Dabei wurden 119 kolonisationsdefekte Mutanten isoliert und 70 neue putative Wirtszellkolonisationsgene, darunter zwei Gene Patatin-ähnliche Proteine (patD, patF), identifiziert. patD befindet sich in einem Operon mit bdhA, dem Gen einer putativen 2-Hydroxybutyrat-Dehydrogenase. Das Operon spielt eine Rolle im Poly-Beta-Hydroxybutyrat (PHB) Stoffwechsel des Bakteriums und wird für die Replikation in Wirtszellen benötigt. Die Studie liefert die ersten experimentell fundierten Ergebnisse, die die Bedeutung des PHB-Metabolismus für die Virulenz des Bakteriums belegen. / Legionella pneumophila is the causative agent of Legionnaires’ disease, a potentially fatal pneumonia. One mayor virulence determinant is the Dot/Icm Type IVB secretion system and its effector proteins. Aim of the present work was the characterization of patatin-like proteins of L. pneumophila, and in particular PatA, which is carried by the Dot/Icm secretion system into host cells. Within this work following results were obtained: The 11 patatin-like proteins of L. pneumophila possess majorly lysophospholipase A activity. L. pneumophila PatA additionally shows Phosphatidylglycerole-specific phospholipase A activity. Serin-72, which is embedded in an G-X-S-X-G lipase motiv is essential for the lipolytic activity of PatA. PatA locates to, or close to, the cytoplasmic membrane when expressed in A549 epithelial cells. The lipolytic activity of PatA is not required for membrane targeting and deletion of a C-terminal region abolishes proper targeting. Virulence attenuated L. pneumophila mutants, develop an easy recognizable phenotype during co-culture with A. castellanii on agar plates that was named „scatterphenotype“. On the basis of the scatterphenotype, a new assay was developed allowing screening of huge clone banks with respect to amoebae sensitivity, a marker for reduced virulence. Here, a collection of several thousand transposon mutagenized L. pneumophila clones was screened and a total of 119 amoebae sensitive mutants was isolated. Among those, 70 novel putative host cell colonization and virulence genes were identified including two members of the patatin-like protein family (patD, PatF). patD is cotranscribed with bdhA, therefore forming an operon. bdhA encodes a putative 3-hydroxybutyrate dehydrogenase. The operon is involved in the poly-beta-hydroxybutyrate (PHB) metabolism of L. pneumophila and is needed for replication in host cells. The study provides the first experimentally funded data showing the linkage of PHB metabolism and virulence of L. pneumophila.