Purified S6/H4 kinase (Mr 60,000) requires autophosphorylation for activation. A rabbit anti-S6/H4 kinase peptide (SVIDPVPAPVGDSHVDGAAK) antibody recognized both the S6/H4 kinase holoenzyme and catalytic domain. Immunoreactivity with p60 kinase protein, and S6/H4 kinase activity were precisely correlated in fractions obtained from ion exchange chromatography of P1798 lymphosarcoma extracts. An enzyme which catalyzed the MgATP-dependent phosphorylation and activation of S6/H4 kinase coeluted with immunoreactivity from Mono 5, but not Mono Q chromatography. Since S6/H4 kinase is homologous with rac-activated PAK65, the observation that phosphorylation is also required for activation suggests a complex mechanism for in vivo activation of the S6/H4 kinase.

La kinase Cdk8 est impliquée dans la régulation de la transcription. Pourtant, cette protéine est retrouvée sur la chromatine lors de la réplication dans le modèle d'extrait d'œufs de xénope, où la transcription n'est pas active. Mon projet de thèse avait pour but de caractériser les fonctions de Cdk8 sur la chromatine en cours de réplication.Les résultats de ma thèse montrent que Cdk8 est impliquée dans la réplication de l'ADN. Le recrutement de Cdk8 sur la chromatine est concomitant avec le recrutement de certaines protéines du complexe de pré-réplication, bien qu'elle ne soit pas accumulée au niveau des foyers de réplication.Cependant, la déplétion de Cdk8 induit des défauts de réplication de l'ADN.Ces défauts ne sont pas induits par une collision entre le réplisome et la machinerie transcriptionnelle. En effet, l'ARN polymérase II, engagée sur la chromatine mais inactive en condition normale, est moins abondante sur la chromatine en absence de Cdk8.La déplétion de Cdk8 conduit à la diminution du recrutement des complexes de pré-réplication et des complexes de pré-initiation de la réplication. Cette diminution conduit à une baisse du taux de réplication sans activation du checkpoint intra-S. L'ensemble de mes résultats montrent que Cdk8 est nécessaire à une réplication normale de l'ADN. Plusieurs mécanismes semblent être mis en jeu, à savoir, un défaut de recrutement de la machinerie de réplication, l'accumulation de la protéine Adenomatous polyposis coli (APC) sur l'ADN ainsi que des modifications post-traductionnelles des histones. / The Cdk8 kinase is involved intranscriptional regulation.This protein is found on chromatin during DNA replication in xenopus egg extract model when transcription is not active. My PhD project was to characterize Cdk8 functions on chromatin during replication.My results show that Cdk8 is involved in DNA replication.Cdk8 is not found at replication foci , but its recruitment on chromatin occurs at the same time as several components of the pre-replication complex.Moreover, Cdk8 depletion leads to DNA replication defects.These defects are not induced by collision between the replisome and transcriptional regulators (RNA polymerase II and transcription factors). Indeed, RNA polymerase II, which is on chromatin in an inactive form under normal conditions, is less abundant on chromatin in absence of Cdk8.Cdk8 depletion leads to a decrease in pre-replication complexes and pre-initiation complexes recruitment. This decrease induces a reduction in DNA replication rate without activating the intra-S checkpoint.My data show that Cdk8 is necessary for proper DNA replication. It seems that Cdk8 depletion involves several mechanisms : altered replication machinery recruitment, presence of Adenomatous Polyposis Coli (APC) protein on DNA, and post-traductional modifications of histones.

Le variant d'histone CENP-A est le facteur responsable de la détermination épigéné- tique du centromère. Il permet le recrutement de nombreuses protéines centromériques, et constitue ainsi la brique fondatrice du kinétochore. Il possède un domaine amino-terminal non structuré dont la fonction précise reste encore à élucider, bien qu'il soit déjà établi chez certaines espèces que ce domaine est requis pour le bon fonctionnement du cen- tromère et conséquemment le bon déroulement de la mitose. Nous avons construit des lignées cellulaires humaines exprimant stablement diverses formes mutantes de CENP-A, qui nous ont permis de réaliser des expériences de pseudogénétique en supprimant l'ex- pression de la protéine CENP-A endogène. Nous observons une augmentation drastique du taux de défauts de ségrégation des chromosomes et de cellules plurinucléées dans des cellules exprimant uniquement le domaine globulaire de CENP-A, ce qui est en accord avec les données de la littérature et confirme l'importance du domaine amino-terminal. Un phénotype similaire est observé dans des cellules exprimant une protéine CENP-A entière mais dont le domaine amino-terminal n'est pas phosphorylable. Nos résultats montrent l'implication de la phosphorylation de la sérine de CENP-A dans le bon déroulement de la mitose, et suggèrent que la fonction mitotique du domaine amino-terminal est centrée sur cette seule phosphorylation. / The histone variant CENP-A is the epigenetic factor responsible for centromere deter- mination. It allows the recruitment of a handful of centromeric proteins, and thus acts as the primary foundation for the kinetochore. It comprises an unstructured amino-terminal domain to which no precise function has yet been assigned, although it is established in some species that the mere presence of that domain is required for proper centromere func- tion and thus successful completion of mitosis. We have established several human cell lines stably expressing GFP-tagged CENP-A constructs, allowing us to perform pseudoge- netic experiments by siRNA-mediated silencing of the endogenous CENP-A. Our results show a dramatic increase of mitotic defects and plurinuclear cells when cells express only the globular domain of CENP-A; this is in accordance with the litterature and confirms the importance of the amino-terminal tail. More importantly, a similar increase of mitotic defects is observed when cells express a full-length, but non-phosphatable, CENP-A. Our results show the involvement of the phosphatable serine 7 of CENP-A in the successful completion of mitosis, and may suggest that the role of the whole amino-terminal tail of CENP-A could be reduced to this single phosphorylation event.

La protéine FADD (Fas associated death domain) est l’adaptateur clé de la voie de signalisation apoptotique dépendante des récepteurs de mort de la famille du TNF (tumor necrosis factor). Au cours des dix dernières années, il est apparu évident qu’au-delà de son rôle majeur dans la mort cellulaire, FADD est impliqué dans d’autres processus biologiques comme le développement embryonnaire, la réponse immunitaire innée ou encore la progression du cycle cellulaire. De même, il est devenu clair que la localisation subcellulaire de FADD est déterminante pour sa fonction. Identifier les voies de régulation de l’expression de la protéine est donc d’une importance capitale. En 2008, notre équipe a mis en évidence, dans un modèle murin de la thyroϊde, un nouveau mécanisme de régulation de l’expression de la protéine via la sécrétion. En parallèle, le laboratoire a rapporté que la présence de FADD dans le sérum de patients cancéreux était corrélée à l’agressivité des tumeurs et l’inflammation. (Tourneur et al, 2012). L’objectif de ce travail de thèse était de comprendre le mécanisme par lequel FADD était sécrété, et de déterminer, le cas échéant, les modalités de sa régulation. Un troisième objectif est apparu au cours de la thèse : identifier de nouveaux modes de régulation de l’expression de FADD. Au moyen d’une lignée modèle humaine, nous avons montré que l’expression de la protéine humaine pouvait être régulée via une voie non-conventionnelle de sécrétion, tout comme dans le modèle murin. En parallèle de la caractérisation de cette sécrétion, nous avons montré que celle-ci pouvait être régulée par la kinase anti-apoptotique CK2 (casein kinase 2). Enfin, nous montrons que la CK2 régule la localisation nucléaire de FADD via une phosphorylation dépendante de la sous-unité régulatrice de la kinase et que la CK2 pourrait interagir directement avec FADD. Ces résultats constituent la première démonstration de la régulation de FADD par sécrétion par des cellules humaines et les premiers à rapporter un nouveau mode de régulation de la localisation subcellulaire de FADD par la CK2. Les conséquences de ces résultats en regard des fonctions connus de FADD sont discutées / The FADD protein (Fas associated death domain) is the key adaptor molecule of the apoptotic signaling pathway triggered by death receptors of the TNF (Tumor necrosis factor) superfamily. During the last decade, it became obvious that, in addition to its major role in cell death, the protein was also involved in other biological processes like the embryonic development, the immune response or even cell cycle progression. Evidence also showed that the protein sub-cellular localization was a key determinant to its functions. Therefore, the identification of underlying regulatory mechanisms dictating FADD expression was of significant importance. In 2008 our laboratory identified, in a thyroid murine model, a new mechanism controlling FADD expression, namely via secretion. We discovered that the loss of FADD expression from tumor cells, by secretion, could be correlated to cancer aggressiveness as well as inflammation (Tourneur 2012). The goal of this thesis work was to apprehend the mechanism by which FADD was secreted and determine, in that case, the modalities of this regulation. A third objective of this work was to identify new potential regulatory pathways of FADD expression. By means of a human cell line model, we showed that, similarly to the mouse model, the expression of human FADD could be regulated via unconventional secretion. In parallel to the characterization of the secretory process itself, we demonstrated that secretion could be negatively regulated by the anti-apoptotic kinase CK2 (casein kinase 2). Finally, we showed that CK2 could regulate FADD nuclear localization via a regulatory sub-unit-dependent phosphorylation and that FADD and CK2 could directly interact. These results are the first to demonstrate that human FADD expression could be regulated via secretion and that FADD sub-cellular localization could be modulated by CK2. The consequences of such regulation with regards to known FADD functions are discussed

L’intégrase (IN) du VIH-1 est une enzyme clé du cycle viral du VIH-1 puisque celle-ci catalyse l’insertion stable du génome viral dans celui de la cellule infectée. D’autre part, l’IN participe également à de nombreuses étapes du cycle viral (transcription inverse, import du complexe de préintégration, bourgeonnement…). L’étape d’intégration elle-même fait intervenir de nombreux partenaires cellulaires et viraux interagissant avec l’IN. Certains sont connus et étudiés (LEDGF/P75, TNPO3…), mais il est très probable qu’un très grand nombre de ces partenaires soient encore méconnus malgré leur importance. Depuis quelque année, le rôle des modifications post-traductionnelles de l’IN a commencé à être étudié. En effet plusieurs études montrent que la régulation de l’activité de l’IN pourrait se faire via de telles modifications. Mon travail de thèse s’est orienté sur trois questions autour de ces deux aspects. -Nous avons identifié plusieurs phosphorylations de l’IN par spectrométrie de masse et mis en évidence le rôle essentiel de la phopshorylation de la sérine 24 pour l’infection virale. -Le rôle de la kinase cellulaire GCN2 a été étudié. Nous avons pu montrer un effet restrictif de la protéine sur le cycle viral amenant à un arrêt de la traduction à un temps court après l’infection au VIH-1. L’interaction entre GCN2 et l’IN a été mise en évidence. L’étude du domaine d’interaction entre l’IN et GCN2 a permis la caractérisation d’un résidu essentiel de l’IN, le E85. -L’impact du facteur de réparation RAD51 sur la réplication virale a été étudié. Nous avons montré un effet inhibiteur de cette protéine. Ce travail a permis l’identification d’une molécule chimique RS-1 capable d’inhiber l’intégration dans les cellules infectées via la stimulation de RAD51. / The integrase (IN) of HIV-1 is a key enzyme of the viral cycle of HIV-1 since it catalyzes the stable integration of the viral genome into that of the infected cell. Furthermore, the IN also participates in many steps of the viral cycle (reverse transcription, import of preintegration complex, budding ...). The integration step itself involves many cellular and viral partners interacting with IN. Some of them are studied (LEDGF/p75, TNPO3 ...) but it is very likely that many of these partners are still unknown despite their importance. Recently, the role of post-translational modifications of the IN began to be studied. In fact several studies show that the regulation of the activity of IN could be done through such modifications.My thesis work focused on three issues: -We identified several phosphorylations of IN by mass spectrometry and identified the crucial role of serine 24 to viral infection. -The role of GCN2 cellular kinase was studied. We have shown a restrictive effect of the protein on the viral cycle leading to a translation stop in first hours following infection with HIV-1. The study of the interaction domain between IN and GCN2 allowed the characterization of a critical residue of IN, the E85. -The impact of RAD51 repair factor on viral replication was investigated. We have shown an inhibitory effect of this protein. This work allowed the identification of a chemical molecule RS-1 able to inhibit integration in infected cells through RAD51 stimulation.

A novel molecular mechanism of autophosphorylation-dependent activation of the ser/thr S6/H4 kinase isolated from human placenta is described. Phosphopeptide mapping of the enzyme was used to determine the rate and extent of site-specific autophosphorylation. These data were correlated to phosphotransferase activity of the protein kinase. The results indicated that a sequential phosphorylation of two sites in the catalytic domain is required for maximum activation. Kinetic analysis determined that site 1 is modified by an intramolecular phosphorylation, and site 2 is modified by an intermolecular phosphorylation. On the basis of these data a model is proposed in which autophosphorylation of the pseudosubstrate domain and on a serine residue in subdomain VIII are both required for maximum activation of the S6/H4 kinase.

L'inflammation est un processus déclenché suite à la détection de pathogènes et de dommages tissulaires. Elle conduit à la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires par les cellules immunitaires innées ainsi qu'au déclenchement de la pyroptose, mort cellulaire pro-inflammatoire. NLRP3 est une protéine senseur de stress cellulaire régulant le déclenchement de ces processus via la formation d'une plateforme multiprotéique appelée inflammasome. L'activation non contrôllée de NLRP3 conduit au développement d'une maladie auto-inflammatoire appelée CAPS (Cryopyrin associated periodic syndrome). De plus, l'inflammasome est impliqué dans le développement et la sévérité des symptômes de nombreuses maladies multifactorielles (diabète de type 2, athérosclérose, maladie de Parkinson et d'Alzheimer, sclérose en plaques, cancers...). Les mécanismes régulant l'activation de NLRP3 ne sont pas encore compris, mais les modifications post-traductionnelles de NLRP3 sont impliquées dans ce processus. Notre laboratoire a identifié différents sites d'ubiquitination et de phosphorylation sur NLRP3 par des approches biochimiques. Via la création de lignées cellulaires NLRP3 knock out reconstituées pour exprimer NLRP3 muté sur les résidus précédemment identifiés et de souris NLRP3 knock-in par la technique de CRISPR/Cas9, le travail de thèse a consisté en l'étude de l'impact fonctionnel de ces modifications. Ces résultats montrent que les substitutions de deux lysines identifiées comme étant ubiquitinées conduisent à une dérégulation de l’activation de l'inflammasome NLRP3 dans les cellules primaires. Un nouveau point de contrôle de l'activation de NLRP3 a ainsi pu être mis en lumière. / Inflammation is triggered after the sensing of pathogens or tissue damages. This process leads to the secretion of pro-inflammatory cytokines by innate immune cells and to the triggering of a pro-inflammatory form of cell death called pyroptosis. NLRP3 protein is a sensor of cellular stress and regulates the triggering of these events through the formation of a multiproteic platform called inflammasome. NLRP3 activation has to be tightly controlled as its deregulation leads to the development of an auto-inflammatory disease called CAPS (Cryopyrin associated periodic syndrome). Moreover, NLRP3 inflammasome is associated with the development and the severity of numerous multifactorial diseases (type 2 diabetes, atherosclerosis, Parkinson’s disease, Alzheimer’s disease, multiple sclerosis, cancers…). The mechanisms involved in the regulation of NLRP3 activation are not fully understood. Recently, post-translational modifications of NLRP3 were shown to be important for the regulation of NLRP3 activation. Our lab has identified several phosphorylation and ubiquitination sites on this protein through biochemical studies. This phD work aims to identify the functional impact of these modifications. Thus, the generation of reconstituted cell lines expressing NLRP3 mutated on the previously identified residues and the generation of NLRP3 knock in mice via CRISPR/Cas9 technology were performed. The results show that substitution of two lysine residues previously identified as ubiquitinated leads to the deregulation of NLRP3 inflammasome activation in primary cells. This work highlights a new point of control in NLRP3 activation.

Les arrestines sont connues pour leurs rôles dans la désensibilisation et l'endocytose des récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs). Au fil des ans, plusieurs partenaires de ces protéines adaptatrices ont été identifiés, notamment diverses molécules impliquées dans la signalisation, incluant les kinases ERK, JNK, Akt, Raf et Src. Ainsi, les arrestines interagissent avec plusieurs kinases, mais seulement avec deux phosphatases, PPA2 et MKP7. Récemment, notre laboratoire a démontré une nouvelle interaction entre les arrestines non-visuelles et la phosphatase Shp2. En effet, des essais in vitro et in cellulo ont montré une interaction directe entre les deux protéines peuvent interagir ensembles et ce directement. Or, nous en sommes venus à nous demander si les arrestines peuvent être phosphorylées sur leurs résidus tyrosine et si cette modification pourrait être régulée par des partenaires connus, soient Src et Shp2. Il a déjà été montré que l'arrestine 2 peut être phosphorylée sur un résidu tyrosine qui lui est unique et que cette modification expliquerait peut-être les différences de modulation entre les arrestines non-visuelles. Par contre, il n'existe encore aucune preuve que l'arrestine 3 puisse aussi être phosphorylée. D'abord, nous démontrons pour la première fois que l'arrestine 3, tout comme l'arrestine 2, est phosphorylée sur des résidus tyrosines et que cette modification peut être amenée par l'activité de Src. Ensuite, un double mutant ponctuel de l'arrestine 3 a été construit afin de cibler les tyrosines régulées. Il semble que les tyrosines 380 et 404 de l'arrestine 3, soient d'importants sites de phosphorylation. Ce nouveau mutant de l'arrestine 3 représente un excellent outil afin de déterminer le rôle de la phosphorylation des tyrosines de l'arrestine 3. Aussi, puisque ces deux tyrosines sont absentes de la séquence de l'arrestine 2, leur phosphorylation pourrait être à la base des différences fonctionnelles entre les arrestines 2 et 3. De plus, nous faisons la démonstration, en conditions de surexpression en cellules, que l'activité de Shp2 peut mener à la déphosphorylation des arrestines non-visuelles. Dès lors, nos études montrent d'abord que, tout comme son homologue, l'arrestine 3 peut être phosphorylée sur ses tyrosines. De plus, cette phosphorylation est non seulement régulée par la phosphatase Shp2, mais représente également un nouveau mécanisme potentiel de régulation des multiples fonctions des arrestines.

NOTCH1 est un récepteur transmembranaire qui, suite à la liaison de son ligand, subit une série de clivages protéolytiques libérant un fragment intracellulaire actif NIC1. Une fois libéré, NIC1 transloque au noyau où il s’associe à des cofacteurs transcriptionnels tels CSL et MAML1 afin d’initier la transcription de gènes cibles dont HES1. La voie Notch joue un rôle dans différents processus cellulaires, dont la prolifération, la mort cellulaire et la différenciation cellulaire. En conséquence, une mauvaise régulation ou une perte d’activité de cette voie de signalisation mène à des maladies humaines telles que des pathologies du développement et le cancer. De ce fait, la voie Notch est grandement régulée à divers niveaux. Entre autres, NIC1 subit des modifications post-traductionnelles qui régulent sa stabilité et par conséquent influence la durée du signal NOTCH1. L’activité transcriptionnelle de NIC1 est également régulée via le recrutement coordonné de cofacteurs transcriptionnels. Malgré tout, très peu de choses sont connues quant aux modifications post-traductionnelles pouvant moduler spécifiquement l’activité du complexe transcriptionnel formé par NIC1. De plus, les études jusqu’à présent n’ont pas permis d’identifier tous les partenaires d’interaction se retrouvant dans le complexe transcriptionnel NIC1/CSL/MAML1 et pouvant moduler son activité. Ainsi, l’objectif de cette étude était d’établir un système permettant l’identification de nouveaux partenaires transcriptionnels de NIC1. Nous avons exprimé une forme tronquée et constitutivement clivée de Notch1 et, suivant des analyses par spectrométrie de masse, nos résultats suggèrent l’interaction possible de NIC1 avec des membres du complexe médiateur et d’autres protéines impliquées dans la régulation génique. Nous avons également exprimé un NIC1-GFP et nos travaux ont permis de montrer qu’il était principalement localisé au noyau, où il s’associe à l’ARN polymérase II, et qu’il est dégradé par le protéasome. Suivant des analyses par spectrométrie de masse, nos résultats suggèrent l’interaction possible de NIC1 avec plusieurs régulateurs transcriptionnels et des protéines impliqués dans l’ubiquitination/Sumoylation. Bref, les analyses protéomiques sont un bon système d’exploitation pour l’identification de nouveaux partenaires d’interaction de NIC1. Ainsi, notre étude permettra une meilleure compréhension de la signalisation Notch d’apparence simple, mais plutôt complexe.

published_or_final_version / abstract / Surgery / Master / Master of Philosophy