Photodynamic therapy (PDT) is a treatment modality for cancer. It combines selective accumulation of chemical compounds, called photosensitizers (PS), with light to irreversibly damage cancer cells via oxidative stress. The main goal of this thesis was to study photosensitizers represented by a unique group of newly synthesized porphyrin derivatives with glycol chain substitution. Glycol-functionalized porphyrins containing one to four low molecular weight glycol chains that are linked via ether bonds to the meta-phenyl positions of meso-tetraphenylporphyrin (mTPP(EG)1-4) were compared with fluorinated (pTPPF(EG)4) and nonfluorinated (TPP(EG)4) derivatives having glycol chains in para-phenyl positions. The cellular uptake and photodynamic activity was significantly dependent on terminal groups of the glycol substituent. Hydroxy glycol porphyrins, in contrast with methoxy glycol porphyrins, exhibited efficient intracellular transport and high induction of apoptosis in tumor cell lines in vitro. After initial testing effective prototype hydroxy ethylene glycol derivatives were selected and analyzed in detail. Para derivatives pTPP(EG)4 and pTPPF(EG)4 accumulated mainly in lysosomes whereas meta derivatives mTPP(EG)1-4 in the endoplasmic reticulum (ER). Position of ethylene glycol chain on the...

O tratamento do câncer e de lesões pré-malignas é uma importante aplicação da terapia fotodinâmica. A base da técnica é o uso da luz associada a um fotossensibilizador, na presença de oxigênio, de forma a promover a formação de espécies reativas de oxigênio que culminam na morte celular. Esta técnica é altamente seletiva, e apresenta poucos efeitos colaterais. A efetividade da terapia pode ser avaliada com base na emissão de fluorescência do fotossensibilizador, uma vez que o grau de fotodegradação deste indica uma terapia mais ou menos efetiva. No caso de tumores, a reincidência de lesões, causada por células malignas remanescentes, é um problema importante e que pode piorar as condições clínicas de um paciente. Este estudo propõe, portanto, um modelo matemático baseado na aferição da fluorescência do fotossensibilizador in situ para previsão da extensão do dano promovido pela terapia fotodinâmica em tempo real. Esta aferição é feita em comparação com o parâmetro experimental de profundidade de necrose, de modo a avaliar se uma lesão pode ser completamente eliminada numa dada aplicação. O estudo utilizou fígados de ratos Wistar machos, saudáveis, como modelo inicial dada sua relativa homogeneidade óptica com relação a lesões tumorais, visando minimizar variáveis. Os fígados foram irradiados com diferentes intensidades (150, 250 e 350 mW/cm2) e com diferentes fluências (50-450 J/cm2) de luz com comprimento de onda de 630 nm, CW, para avaliação das necroses e da fluorescência (avaliada usando 532 nm para excitação). A primeira versão do modelo utilizou o conjunto de dados de 250 mW/cm2 para obtenção de um modelo inicial baseado na fotodegradação avaliada por fluorescência. Este modelo foi alterado com base em modificações biológicas observadas na literatura durante a terapia. Tais alterações estão relacionadas à modificação de aporte de oxigênio causada por vasoconstricção, pela farmacocinética do fotossensibilizador e pelas modificações nas propriedades ópticas intrínsecas ao tecido. Foi possível encontrar equivalência entre modelo e experimentação ao final das modificações propostas ao modelo inicial, embora tenha sido evidente o efeito da variação no fracionamento da fluência entregue sobre os resultados da previsão. Como forma de mostrar a capacidade do modelo não apenas para previsão da profundidade de necrose (e, portanto, da extensão do dano), mas também para avaliações de dosimetria, foi proposta uma situação hipotética onde se entrega a mesma fluência de luz com intensidades diferentes (variando linearmente). Este teste mostrou o potencial do modelo não apenas para avaliar a extensão do dano causado pela terapia em tempo real, mas também para estimar os resultados de protocolos clínicos não-testados e, portanto, para a proposta de melhorias a protocolos de terapia fotodinâmica. / Malignant and pre-malignant cancer lesions treatment is an important application of photodynamic therapy. It is based on the use of light associated to a photosensitizer, in the presence of oxygen, so that reactive oxygen species may be formed, resulting in cell death. This is a highly selective technique, and few side effects are reported. The therapy efficacy may be evaluated through the photosensitizer fluorescence emission, since its level of bleaching indicates a more or less effective therapy application. Concerning cancer, recurrent lesions, caused by remaining malignant cells, is an important problem which may cause the worsening of patient´s clinical condition. Therefore, this study proposes a mathematical model based on the assessment of photosensitizer fluorescence in situ for prediction of the damage extent caused by photodynamic therapy. This evaluation is performed by comparison with the experimental parameter of depth of necrosis, as to evaluate if a lesion can be completely eliminated during an application. This study used male Wistar rats healthy livers as an initial model due to its relative optical homogeneity when compared to tumor lesions, hence minimizing variables. Livers were irradiated using different light fluence rates (150, 250 and 350 mW/cm2) and fluences (50-450 J/cm2) with 630 nm wavelength, CW, to perform evaluation of fluorescence (wit 532 nm excitation) and depth of necrosis. A first model was obtained from the 250 mW/cm2 dataset, based on fluorescence-assessed photobleaching. Such model was modified according to literature observations on biological changes during therapy. Those changes are related to the oxygen arrival, promoted by vessels shutdown, by the photosensitizer pharmacokinetics and by the changes in the intrinsic optical properties of liver tissue. Correspondence between model and experimentation was achieved after the changes proposed to the initial model, although the effect of different fractioning of light fluences on prediction has become evident. To show the model ability not only to predict depth of necrosis (and, hence, damage extent), but also for dosimetry studies, an hypothetical situation in which the same fluence has been delivered in different (linearly varying) fluence rates. This test result showed the potential of the model not only to evaluate the damage extension by the therapy in real-time, but also to investigate untested clinical protocols results and, therefore, to allow proposals of improvement to photodynamic therapy protocols.

O objetivo do estudo foi avaliar o efeito de repetidas aplicações da Terapia Fotodinâmica antimicrobiana (TFDa) adjuvante ao tratamento periodontal não cirúrgico em pacientes fumantes. Foram selecionados 20 indivíduos fumantes com diagnóstico clínico de periodontite crônica. O estudo foi do tipo boca dividida, sendo um lado utilizado a TFDa associada à raspagem e alisamento radicular (RAR) e no outro apenas RAR. Foi utilizado laser com 660nm de comprimento de onda associada ao fotosensibilizador fenotiazida e as aplicações foram realizadas em 4 episódios (dias 0, 2, 7 e 14). Todos os pacientes foram acompanhados por 90 dias. As avaliações clínicas de índice de placa (IP), profundidade de sondagem (PS), nível clínico de inserção (NCI), sangramento à sondagem (SS) e sangramento marginal (SM) foram realizadas no baseline, 0, 30 e 90 dias após a execução do tratamento. Foi realizada análise microbiológica para contagem de 40 espécies bacterianas da amostra subgengival da placa bacteriana (Checkerboard DNA-DNA hybridization). Níveis das citocinas do fluido crevicular gengival foram avaliados (Interleucina-1β, Interleucina-10 e Fator de Necrose Tumoral Alpha). Os dados obtidos foram analisados estatisticamente. Em geral não foram observadas diferenças estatisticamente significantes entre os grupos (p &lt0,05) nos parâmetros clínicos, microbiológicos e imunológicos 90 dias após o tratamento. O tratamento periodontal com RAR + TFDa em múltiplos episódios não promoveu benefícios adicionais à RAR no tratamento não cirúrgico da periodontite crônica em fumantes sem o uso de antibióticos sistêmicos / The aim of this study was to investigate the additional influence of multiple applications of antimicrobial Photodynamic Therapy (aPDT) in smokers without use of systemic antibiotics. Twenty smokers with chronic periodontitis were treated in a split-mouth design study with aPDT adjunct to Scaling and Root Planing (SRP) or SRP only. aPDT was performed by using a laser light source with 660 nm wavelength associated with a photosensitizer. The applications were performed in four episodes (at days 0, 2, 7 and 14). All patients were monitored for 90 days. Plaque index, probing depth, clinical attachment level, bleeding on probing and marginal bleeding were performed at baseline, 0, 30 and 90 days after the SRP. Counts of 40 subgingival species in plaque samples were monitored (Checkerboard DNA-DNA hybridization). Gingival crevicular fluid and subgingival plaque samples were collected (Interleukin 1β, Interleukin 10 e Tumor necrosis factor. Data obtained were statistically analyzed. aPDT as an adjunct to SRP did not demonstrate statistically significant advantages on clinical parameters when compared with SRP alone. In general no statistic significant differences between groups were observed (p &lt0.05). Levels of anti-inflammatory cytokines and bacterial species were comparable in both groups at day 90 after treatment. Periodontal treatment with SRP + aPDT in multiples episodes was not able to improve results in the non-surgical treatment of chronic periodontitis in smokers when compared SRP alone, without the use of systemic antibiotics

Devido à sua intensa absorção de luz na região visível do espectro, as porfirinas e seus derivados (clorinas e bacterioclorinas) são de grande importância na terapia fotodinâmica (TFD) para o tratamento de doenças neoplásicas. Neste trabalho foram sintetizadas as novas vinil-porfirinas estrategicamente funcionalizadas (47 e 48), seguida de uma sistemática de reações de Diels-Alder com dieófilos ativados, com o propósito de obter clorinas e/ou bacterioclorinas para potenciais aplicações em TFD. / Due to their strong absorption in the visible region, porphyrins and related derivatives (chlorins and bacteriochlorins) are very important in photodynamic therapy (PDT) for the treatment of neoplasic diseases. In this work were synthesized the novel and strategically functionalizated vinyl-porphyrins 47 and 48, followed by systematic Diels-Alder reactions with activated dienophiles to obtain chlorins and/or bacteriochlorins, potentially useful on PDT.

O adenocarcinoma de ducto pancreático (PDAC) é a quarta causa de morte em decorrência de neoplasias nos países ocidentais. Atualmente, a cirurgia ressectiva é a única possibilidade de cura para a doença, porém, a recidiva tumoral acontece em menos de um ano após a intervenção cirúrgica, mesmo com a quimioterapia adjuvante. A terapia fotodinâmica (PDT) é uma alternativa promissora no tratamento do câncer. No entanto, pouco se sabe sobre o uso da PDT em tumores pancreáticos. Portanto, o objetivo deste trabalho foi avaliar a eficiência da PDT com o azul de metileno (MB) como fotossensibilizador (MB-PDT) em induzir a morte de linhagens de PDAC humanas (AsPC-1, Panc-1, MIAPaCa-2 e BxPC-3) e estudar a contribuição de vias de necrose regulada nos efeitos citotóxicos da terapia sobre estes modelos. Os resultados obtidos mostraram que a MB-PDT foi capaz de induzir a morte massiva das células de PDAC. Além disso, eles indicaram que há dois perfis de susceptibilidade entre as quatro linhagens estudadas quando submetidas a MBPDT com 4,5 J/cm2 de energia e 6min de irradiação. De acordo com os dados apresentados, a diferença nas sensibilidades das linhagens à terapia não está associada à diferenças na capacidade de incorporação do MB ou na localização sub-celular do fotossensibilizador nas diferentes células, uma vez que a localização é, predominantemente, lisossomal em todas elas. Adicionalmente, mostrou-se que as linhagens menos susceptíveis ao tratamento, MIAPaCa-2 e Panc-1, apresentam níveis significativamente menores de RIPK3 e MLKL, dois dos componentes do necrossomo, essenciais para a execução da necroptose. Além disso, foi visto que a MB-PDT induz um aumento de fosforilação de MLKL em AsPC-1, demonstrando a ativação da necroptose após a terapia nestas células, mas não em MIAPaCa-2 (menos responsiva à terapia com 4,5 J/cm2 deenergia e 6min de tempo de irradiação). Ainda, a inibição da via de sinalização necroptótica diminuiu significativamente as porcentagens de morte das células mais susceptíveis (BxPC-3 e AsPC-1), não alterando a resposta de Panc-1 e MIAPaCa-2, corroborando a ativação e importância da necroptose para a citotoxicidade da MB-PDT. Finalmente, neste trabalho foi mostrado que o aumento do tempo de irradiação, mantendo-se a quantidade total de energia aplicada no tratamento, melhora a eficiência da MB-PDT em induzir a morte das células que apresentam limitações para executar a necroptose, sugerindo que mais de uma via de morte esteja sendo ativada após a terapia e que o tempo de irradiação atuaria modulando esta ativação. Complementarmente, foi mostrado que os tempos maiores de irradiação aumentam o estresse oxidativo intracelular que é acompanhado por uma diminuição significativa do conteúdo intracelular de glutationa reduzida (GSH), indicando, preliminarmente, que a ferroptose pode estar sendo acionada após os protocolos mais longos de irradiação. Coletivamente, os resultados apresentados neste trabalho confirmam a eficiência da MB-PDT no tratamento de diferentes linhagens de PDAC, indicando que a necroptose está sendo ativada e contribuindo para a citotoxicidade da terapia sobre as células que não apresentam resistência à esta via de morte. Ainda, eles demonstram que o aumento do tempo de irradiação pode transpor a barreira de resistência de algumas linhagens à terapia, provavelmente por induzir a ativação de outras vias de necrose regulada, mostrando a importância da otimização do protocolo de tratamento no aumento da eficiência da MB-PDT sobre os tumores de pâncreas. Finalmente, os resultados confirmam a MB-PDT como alternativa eficaz no tratamento do PDAC, apresentando um amplo espectro de atuação sobre subtipos tumorais resistentes à vias clássicas de morte celular, uma característica importante no contexto de uma terapia anti-cancer. / Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of death due to neoplasms in western countries. Currently, resective surgery is the only therapetical approach to cure this disease, but tumor´s recurrence occurs less than one year after the surgery, even with adjuvant chemotherapy. Photodynamic therapy (PDT) is a promising alternative for the cancer treatment. However, the efficacy of PDT to treat pancreatic tumors as well as the mechanisms involved in the induction of tumorigenic cell death remain unclear. For this purpose, in this study, we set out to evaluate the efficacy of PDT using methylene blue (MB) as a photosensitizer (MB-PDT), in inducing death of human PDAC derived cell lines (AsPC-1, Panc-1, MIAPaCa-2 and BxPC-3) and to deeper investigate the contribution of necroptosis to the cytotoxic effects of the therapy. We observed that MB-PDT was able to induce massive death of PDAC cells. Moreover, our results indicated that upon MB-PDT (4.5 J/cm2 energy and 6min of irradiation time), there were two susceptibility profiles among the four cell lines studied. Data also showed that this differential profile of cell response was neither associated with the differences in the MB incorporation capacity nor with the subcellular location of the photosensitizer, since the localization was predominantly lysosomal in all of tested cell lines. In addition, less susceptible cells, MIAPaCa-2 and Panc-1, showed significantly lower levels of RIPK3 and MLKL, two of the necrosome components, essential for triggering necroptosis. Furthermore, while MB-PDT (4.5 J/cm2 and 6min of irradiation) has been able to increase MLKL´s phosphorylation levels, an essential step in necroptosis induction, in AsPC-1cells, less responsive MIAPaCa-2 cells presented no variations on the phosphorylation state of this pseudokinase. Moreover, pharmacological inhibition of the necroptotic signaling pathway significantly decreased cell death percentages of the most susceptible cells (BxPC-3 andAsPC-1), without altering the response of Panc-1 and MIAPaCa-2, corroborating that activation of necroptosis was strongly involved in the cytotoxicity of MB-PDT. Finally, this work showed that increasing the irradiation time improved the efficacy of MB-PDT in killing cells which display limitations to perform necroptosis, suggesting that the irradiation time would be modulating the degree of oxidative stress generated and this stimuli would in turn, be responsible for triggering other regulated cell death pathways in a RIKP3 and MLKL independent way. Indeed, this increase in oxidative stress was accompanied by a significant decrease in GSH, a global indicatior of less antioxidant cell capacity, preliminarily pointing at the induction of ferroptosis by longer irradiation protocols. In summary, we demonstrated that MB-PDT is able to induce cell death in different PDAC cell lines and that different regulated cell death mechanisms are being activated upon MB-PDT induction. Furthermore, it was demonstrated that increased irradiation time may overcome the resistance barrier of some cell lines, probably inducing the activation of other regulated cell death pathways, showing the importance of optimizing the irradiation protocol in order to maximize the efficacy of the therapy. Finally, our observations point MB-PDT as an alternative and effective therapy for pancreatic cancer treatment, displaying a broad-spectrum action on tumors displaying different resistance mechanisms to classic cell death pathways, a desired property for improving an anticancer therapy.

A terapia fotodinâmica (PDT) consiste em introduzir no organismo um composto fotoativo (fotossensibilizador) e irradiar o local a ser tratado com a luz visível. Este procedimento permite obter a(s) forma(s) ativa(s) do composto que tem a capacidade de matar células neoplásicas, bem como fungos e bactérias. Algumas desvantagens dos fotossensibilizadores atualmente aplicados na clínica estimulam a busca de novos compostos mais adequados. Os corantes ciânicos com dois cromóforos (BCD) possuem características espectrais promissoras para aplicação em PDT. Isso estimulou a realização deste trabalho que teve como finalidade estudar as características espectrais, energéticas e de fotodecomposição dos BCD: (i) em diferentes solventes (escolhidos pela constante dielétrica $\\xi$ e capacidade de formar ligação hidrogênio), (ii) na interação com micelas, e (iii) na interação com DNA. Foram estudados $4$ isômeros de corantes ciânicos com dois cromóforos (BCD) com estrutras iguais. Estes isômeros diferem pela estrutura da parte central da molécula. Foram utilizados métodos espectroscópicos estáticos e com resolução temporal tais como absorção ótica, flash-fotólise, fluorescência, anisotropia, dicroísmo circular e calorimetria fotoacústica. Os resultados experimentais foram analisados em comparação com resultados obtidos do cálculo computacional em que foi feita a otimização geométrica das moléculas, análise de orbitais eletrônicos, dos níveis de energia e das probabilidades de transição entre estes. A partir destes dados foram construídos os espectros de absorção S-S dos corantes. Os cálculos confirmaram que a probabilidade de transição entre os níveis de energia dos BCD depende do ângulo entre os cromóforos que é determinado pela estrutura da parte central da molécula. Para um ângulo de $180^{0}$ somente uma banda de absorção está presente no espectro e para o de $90^{0}$ aparecem duas bandas de intensidades iguais. Foi mostrado que no intervalo de temperaturas $<100^{0}$ as conformações dos cromóforos de BCD no estado fundamental são trans-trans, exceto para o BCD com ângulo de $120^{0}$ entre os cromóforos em que no intervalo $0^{0}$ a $100^{0}$ ocorre a mistura das conformações trans-trans e cis-trans. Os resultados experimentais mostraram que em solventes orgânicos os BCD não formam agregados. Como suas características espectroscópicas não seguem a equação de Lippert concluímos que sua solvatação está determinada tanto pelo mecanismo não específico como específico devido as ligações hidrogênio. Os tempos de vida ($\\tau_{S1},\\tau{}_{T1}$) e rendimentos quânticos ($\\phi_{S1},\\phi{}_{T1}$) dos estados excitados singleto e tripleto dos BCD diminuíram com o aumento da constante dielétrica $\\xi$ do solvente. Entretanto o aumento da viscosidade do solvente aumentou estes parâmetros. A presença de água nos solventes orgânicos promove a formação dos agregados de BCD. Os valores de $\\tau_{S1},\\tau\\,{}_{T1}$ e $\\phi_{S1},\\phi\\,{}_{T1}$ diminuíram, provavelmente, devido a dois efeitos: diminuição da microviscosidade ao redor da molécula de BCD e agregação do BCD estimulada pela presença da água. A interação dos BCD com micelas depende da carga dos tensoativos. Para uma carga negativa houve a presença de $3$ espécies do corante dependendo da concentração das micelas: os monômeros livres, os monômeros ligados à micela e os agregados ligados a micela. O tensoativo zwiteriônico gerou duas espécies: os monômeros livres e os monômeros ligados à micela. As constantes de ligação dos BCD com micelas de LPC são da ordem $10^{7}M^{-1}$. Não houve interação com os tensoativos positivos. A interação com DNA estimula a agregação de BCD. Na presença de DNA em solução existem três espécies de BCD: os monômeros livres e ligados com DNA e os agregados de BCD na superfície do DNA. O conteúdo relativo dessas espécies depende da razão {[}BCD]/{[}DNA]. As constantes de ligação dos monômeros de todos BCD com DNA foram da ordem de E7M^{-1}$. Os valores de tau_{S1},\\tau{}_{T1}$ e $\\phi_{S1},\\phi{}_{T1}$ aumentaram com a ligação dos BCD ao DNA, o que significa que a contribuição dos processos não radiativos diminuiu em comparação a água e aos solventes orgânicos. Os BCD sofrem fotodecomposição e esta depende da presença de oxigênio. Na fotodecomposição do BCD ocorre destruição do sistema de conjugação-pi num dos cromóforos pela ligação do oxigênio singlete, formado devido a transferência de energia do estado tripleto do próprio BCD para oxigênio molecular. Os resultados obtidos (alta afinidade com sistemas biológicos e modelos, altos rendimentos quânticos do estado tripleto na interação com estes sistemas, formação de oxigênio singleto) mostram que os BCD apresentam características vantajosas para suas aplicações como fotossensibilizadores em PDT, motivo pelo qual o estudo da sua fototoxicidade e testes in vivo deve prosseguir. / Photodynamic therapy (PDT) consists in the administration of photoactive compounds (photosensitizers) in an organism with subsequent application of visible light to the area to be treated. This procedure leads to the activation of the compound which kills neoplasic cells, as well as fungus and bacteria. The photosensitizers used nowadays show some disadvantages, thus motivating the search for more effective compounds. Bichromophoric cyanine dyes (BCD) exhibit good spectral characteristics to be used in PDT, encouraging the development of this study. This work aimed at studying spectral, energetic and photodecomposition characteristics of BCD: (i) in different solvents (choosen accordingly to their dieletric constant $\\xi$ and the capacity to form hydrogen bonds), (ii) at their interaction with micelles and (iii) at their interactions with DNA. Four BCD isomers with equal chromophores and different structure of the central part of the molecule were studied. Static and time resolved spectroscopic methods such as optical absorption, fluorescence, anisotropy, circular dicroism and photoacustic calorimetry were used. Experimental results were compared with computational ones, based on geometry optimization and analysis of electronic orbital densities, energy levels and transition probabilities. This data allowed to create the BCD singlet absorption spectrum. The computer modelling confirmed that the transition probabilities depended on the angle between chromophores determined by the central structure. The $180^{0}$ BCD showed a single absorption band, while the $90^{0}$ BCD showed two bands of equal intensities. It was demonstrated that at $<100^{0}C$ BCD chromophores are present in the trans-trans form, except for the BCD with $120^{0}$ where the mixture of trans-trans and cis-trans forms was present in the $0^{0}-100^{0}C$ temperature interval. Experimental results have shown that BCD did not form aggregates in organic solvents. The BCD spectral characteristics did not followed the Lippert equation, which means that both non-specific and specific mechanisms, such as the hydrogen bond formation determined the BCD solvatation The life times ($\\tau_{S1},\\tau\\,{}_{T1}$) and quantum yields ($\\phi_{S1},\\phi\\,{}_{T1}$) of singlet and triplet excited states decreased with increase of the solvent dielectric constant $\\xi$. Though, the solvent viscosity increment caused the increase of these parameters. The addition of water to organic solvents led to BCD aggregation. The $\\tau_{S1},\\tau\\,{}_{T1}$ and $\\phi_{S1},\\phi\\,{}_{T1}$ values decreased, probably due to two effects: the decrease of microviscosity around the molecules and aggregation of BCD due to interaction with water. The interaction of BCD with micelles depended on the micelle electric charge. In the presence of negatively charged ones three species were produced in the solution: BCD free monomers, BCD aggregates bound to micelles and BCD monomers bound to micelles. Zwiterionic micelles produced two species: BCD free monomers and monomers bound to micelles. The binding constants with zwiterionic LPC micelles were $\\sim10^{6}M^{-1}$. Positively charged micelles did not interact with BCD. Interaction with DNA stimulated the BCD aggregation. Three species were produced in the solution: BCD free monomers and monomers bound to DNA and BCD aggregates bound to DNA. The relative content of these species depended on the {[}BCD]/{[}DNA] ratio. The BCD monomer to DNA binding constants were $\\sim10^{7}M^{-1}$. The $\\tau_{S1},\\tau{}_{T1}$ and $\\phi_{S1},\\phi{}_{T1}$ values increased with BCD binding to DNA, indicating that non radioactive processes decreased in comparison with pure water and homogeneous organic solvents. The BCD photodecomposition depended on the oxygen presence. This fotodecomposition occured when singlet oxygen (generated due to the energy transfer from the BCD molecule in its triplet state to molecular oxygen) interacted with one of the BCD chromophores destroying its $\\pi$-conjugation system. The obtained results (high affinity to biological and model systems, high triplet state quantum yields at interaction with these systems, singlet oxygen formation) showed that BCD possess promising characteristics for application as photosensitizers in PDT, encouraging future studies on their phototoxicity and \\textit{in vivo} tests.

O fotoenvelhecimento é uma condição dérmica decorrente da sobreposição do envelhecimento cronológico e dos efeitos da exposição crônica à radiação ultravioleta (UV) solar. A pele fotodanificada é um local propício para o desenvolvimento de lesões pré-cancerosas que podem evoluir para casos de câncer de pele. Logo, o tratamento dessa condição não é apenas de cunho estético, mas também preventivo. A Terapia Fotodinâmica (TFD) é uma técnica que se baseia na fotoativação de uma molécula fotossensível, que na presença de oxigênio, produz espécies citotóxicas que levam à morte da célula e tecido alvo. Esta técnica tem sido utilizada em estudos clínicos para o tratamento da pele fotoenvelhecida, e tem apresentado bons resultados funcionais e cosméticos. São muitas as variações em parâmetros como fonte de luz, dose e tipo de fotossensibilizador. A TFD fracionada utiliza um tempo de escuro entre frações da dose total e mostra-se mais eficiente que a iluminação em uma única dose, porém seu efeito no tratamento da pele fotoenvelhecida ainda é desconhecido. Neste trabalho, um protocolo de TFD foi desenvolvido para comparar o resultado da terapia com iluminação dose única e fracionada aplicada no fotoenvelhecimento. A avaliação foi através de histologia e espectroscopia de fluorescência e tempo de vida de fluorescência. Camundongos hairless foram fotoenvelhecidos e tratados com luz LED violeta (404 nm) e creme 20% ALA (1h de incubação) com dose única (1 J.cm-2) e fracionada (duas frações de 0,5 J.cm-2 e 10 min de escuro). O efeito da TFD fracionada foi mais intenso, causando ulcerações na pele e alterações histológicas características. Esse resultado mostrou que a TFD com iluminação fracionada não foi adequada para o tratamento da pele fotoenvelhecida. A análise por tempo de vida de fluorescência foi capaz de mostrar alterações durante as semanas de recuperação. Acredita-se que essa informação venha da epiderme devido ao remodelamento observado nessa camada. / Photoaging is a skin condition resulting from the overlap of chronological aging and the effects of chronic exposure to sunlight ultraviolet (UV). Photodamaged skin is more susceptible for the development of pre-cancerous lesions, which can become skin cancer. Therefore, the treatment of this condition is not only of aesthetic concern but it is also of preventive nature. Photodynamic therapy (PDT) is a technique based on the photoactivation of a light-sensitive molecule, which, in the presence of oxygen produce cytotoxic species that lead to cell death and tissue destruction. This technique has been used in clinical trials for the treatment of photoaged skin, and it has presented good functional and cosmetic results. There are many variations on PDT parameters such as the light source, dose and type of photosensitizer. Fractionated PDT is one these variations which uses a dark interval between light fractions. Studies show that this illumination scheme enhances the therapeutic efficacy, although its effects in the treatment of photoaged skin are still unknown. In this work, a protocol was developed to compare the outcome of PDT with single and fractionated illumination applied in photoaging. The assessments were made by histology and by the optical technics: steady state and lifetime fluorescence spectroscopy. Photoaging was induced in hailess mice skin which were then treated with violet LED (404 nm) and 20% ALA cream (1h of incubation) with either single (1 J.cm-2) or fractionated (2 fractions of 0.5 J.cm-2 and 10 min of dark interval) doses. The effect of fractionated PDT was more intense, causing ulcerations on the skin and distinctive histological changes. This result shows that PDT with fractionated illumination was not suitable for the treatment of photoaged skin. The analysis by fluorescence lifetime spectroscopy was able to reveal changes during the recovery weeks. It is believed that this information comes from the epidermis due to the remodeling observed in this layer.

A determinação da distribuição da luz em tecidos biológicos é importante para aplicações tais como a terapia fotodinâmica e o fotodiagnóstico. grande parte das aplicações se baseiam na luz que atinge a superfície do tecido e se propaga ao longo da profundidade. A combinação da absorção e do espalhamento leva aos perfis de intensidade que determinam a ação terapêutica. Os métodos existentes para a prever a distribuição da luz nos tecidos biológicos necessitam da determinação dos coeficientes ópticos do tecido, e demandam longo tempo computacional de modo que a aplicação em tempo real conjugada às fototerapias torna-se impossível. Considerando a terapia fotodinâmica, o contorno da necrose é determinado pela dose limiar. Portanto é importante assegurar uma intensidade de luz acima deste limiar na região onde deseja-se induzir necrose. Esta determinação envolve o conhecimento da distribuição da luz. Nesta tese são apresentados experimentos realizados em meios que simulem o comportamento óptico dos tecidos biológicos para estabelecer uma metodologia empírica para determinar a distribuição da luz. Este método baseia-se em medidas da intensidade de luz como função da posição espacial no interior do meio. Os dados são então armazenados em forma de uma matriz tridimensional. Usando esta matriz, operações matemáticas como soma, translação e rotação são utilizadas para compor diferentes campos de luz, ou seja, diferentes geometrias de iluminação. As medidas experimentais e as previsões teóricas foram comparadas demonstrando que o método proposto pode ser utilizado para recuperar a distrubuição da luz em meios túrbidos para diversas geometrias de iluminação. Experimentos in vivo mostraram que este método pode ser bastante útil na determinação da dosimetria para terapia fotodinâmica. / The determination of light distribution within biological tissues is important for applications such as photodynamic therapy and photodiagnostics. Most applications use light that reaches the tissue surface and propagates along the depth. The combination of absorption and scattering leads to light intensity profiles which determines the therapeutic action. Considering photodynamic therapy, necrosis contour is determined by the threshold intensity. Therefore it is quite important to assure intensity above the threshold at the region where necrosis is desired. This determination involves the knowledge of light distribution. In this study, we have developed an empirical method to determine light distribution in optical phantom. This method is based on experimental measurements of light intensity as a function of position inside the medium. The data were collected for a collimated narrow laser beam and arranged in a tridimensional matrix. Using this matrix, simple mathematical operations were used to simulate different conditions of irradiation geometry. Comparison between experimental measurements and mathematical simulations show that our method can be used to recover light distribution in biological tissue for any condition of illumination, since we have previously performed simple measurements in a sample using a narrow beam. In vivo experiments showed that this method can be very useful to the determination of photodynamic therapy dosimetry.

Fotossensibilizadores são moléculas capazes de interagir com a luz de modo a gerar espécies altamente reativas de oxigênio como o oxigênio singlete e outras formas radicalares. Esta propriedade pode ser utilizada para o tratamento de câncer, remoção de contaminantes ambientais, inativação de agentes patogênicos no sangue e hemoderivados, bem como na esterilização alimentos. A técnica que utiliza o efeito fotodinâmico para o tratamento de câncer recebe o de nome Terapia Fotodinâmica (do termo em inglês: Photodynamic Therapy - PDT).Photofrin®, Photogem® e Photosan® são fármacos de primeira geração, derivados da hematoporfirina, que constituem o principal grupo de medicamentos com aplicação clínica em PDT. Photodithazine® é um fármaco de 2ª geração, derivado de clorina-e-6, que encontra-se em fase de testes clínicos e apresenta resultados promissores como fotossensibilizador (FS). Este trabalho tem o objetivo de investigar a eficiência fotodinâmica destes fármacos através de experimentos que envolvem a utilização da albumina de soro bovino (BSA) e o ácido úrico (AU) como dosímetros químicos; eritrócitos como modelo de membrana celular e a determinação do coeficiente de partição (P ou Log P) para se investigar lipofilicidade e a interação dos FS com as membranas celulares. Soluções contendo BSA e FS, preparadas em tampão fosfato, foram iluminadas com LED (630nm) e o decréscimo na fluorescência do BSA em 340nm foi utilizado para se calcular constante da velocidade de fotoxidação (kC, min-1). No teste do AU, a mistura AU e FS foi iluminada com LED e o coeficiente de atividade fotodinâmica (AF, m2.J-1) foi determinado através do decréscimo da banda do AU em 293nm. Os resultados convergem para a seguinte ordem de eficiência fotodinâmica: Photodithazine® >> Photogem® > Photofrin® > Photosan®, baseada nos valores de kC (14,8±0,3); (9,8±0,5); (3,2±0,7) e (2,9±0,5)min-1 e AF (64±14), (37±9), (9±2) e (4±1)m2J-1, respectivamente. Com objetivo de determinar o tempo necessário para causar 50% de hemólise (t50), amostras de eritrócitos (hematócrito=2%) foram irradiadas por 10 minutos e o dano causado à membrana pelo efeito fotodinâmico foi monitorado através da variação na absorbância característica da oxihemoglobina em 540 e 577nm. O mecanismo preferencial envolvido na fotoxidação da membrana celular foi investigado por meio de experimentos que avaliaram a influência de água deuterada, azida de sódio e manitol na velocidade de fotoxidação dos eritrócitos. Os resultados dos experimentos de hemólise apontam para a seguinte ordem de eficiência fotodinâmica: Photodithazine® >> Photofrin® > Photogem® > Photosan®, baseada nos valores de t50 : (1,2±0,3), (3,4±0,1), (3,8±0,2), (5,2±0,1)min e logP (0,21); (0,15); (0,11); (-0,21); respectivamente. A hemólise com Photogem® em meio deuterado foi cerca de 25% mais rápida e a presença de azida de sódio causou diminuição na hemólise, expressa pela diminuição dos valores de porcentagem máxima de hemólise (%HMÁX) e aumento nos valores de t50.. A presença de manitol nos ensaios de hemólise não apresentou influência nos valores de t50 e %HMÁX, indicando que a hemólise não ocorre via mecanismo radicalar, mas aponta para o mecanismo do tipo II, via oxigênio singlete, como sendo o mecanismo predominante na fotoxidação da membrana plasmática dos eritrócitos pelos fotossensibilizadores estudados. As diferenças encontradas entre os fármacos HpD são atribuídas as suas diferentes constituições, uma vez que tratam-se de misturas de monômeros, dímeros e oligomeros em diferentes frações. Experimentos realizados em solução homogênea, tais como os experimentos de fotoxidação de BSA e o teste do ácido úrico, fornecem importantes informações a respeito da estrutura-atividade dos fármacos, mas negligenciam os efeitos de interação dos FS com o meio biológico. Em ambiente biológico, os FS participam de inúmeras interações adicionais, constituindo sistemas únicos, com diferentes propriedades fotofísicas e fotoquímicas. Estudos anteriores, realizados no nosso grupo de pesquisa, envolvendo a determinação da citotoxicidade destes FS em culturas de células normais e tumorais, bem como estudos de separação cromatográfica dos constituintes de fármacos HpD estão de acordo com os resultados apresentados neste trabalho. / Photodynamic Therapy (PDT) is a developing technology that has been used for cancer treatment and recognized to have a huge potential for microorganisms inactivation and detoxication. It is based on light irradiation of a photosensitizer (PS) in order to produce reactive oxygen species. Many kinds of compounds are known to have photosensitizing properties. Photofrin®, Photogem® and Photosan® consist of mixtures of monomers, dimmers, and oligomers from hematoporphyrin treated chemically being the most clinically used PS. Photodithazine® is a water soluble clorin-e6-derivative, a second-generation drug. The present work provides a comparative study between these PS, using bovine serum albumin (BSA) and uric acid (UA) as chemical dosimeters as well as human red blood cells (RBC) as a cell membrane model and octanol/phosphate buffer partition coefficient (logP) to access the lipophilicity of the compounds. BSA and PS solutions in phosphate buffer were illuminated with LED ( =630nm) and the decrease in the BSA fluorescence at 340nm was used to calculate the photoxidation rate constant (kC, min-1). In UA test, a mixture of UA and photosensitizer was illuminated with LED ( =630nm) and the photodynamic activity coefficient (PA, m2.J-1) was determined by the decrease in the 293nm absorbance of UA. The results from these methodologies suggest that the photodynamic efficiency order is: Photodithazine® > Photogem® > Photofrin® > Photosan®, based on PA values (64±14), (37±9), (9±2) and (4±1)m2J-1 and kC values (14.8±0.3); (9.8±0.5); (3.2±0.7) and (2.9±0.5)min-1, respectively. In order to determine the t50 (time for 50% of hemolysis) the samples of RBC (hematocrit=2,0%) were irradiated for 10min and the absorbance characteristic of oxyhemoglobin (540 e 577nm) released due to the damage and consequent membrane lysis by the action of the PS was obtained. The mechanism involved in the photoxidation of the membrane was also studied determining how sodium azide, deuterium oxide and manitol affect the t50 values. The hemolysis experiments and logP values suggest the following order: Photodithazine® > Photofrin® > Photogem® > Photosan®, based on t50 values (1.2±0.3), (3.4±0.1), (3.8±0.2), (5.2±0.1)min and logP (0.21); x (0.15); (0.11); (-0.21), respectively. The rate of the hemolysis is increased about 25% in the deuterium oxide presence, and decreased in the sodium azide presence. Moreover, the experiments performed in the manitol presence not show any diference on t50 values. These results showed that the preponderant mechanism in the photohemolisys is of the type II. The differences in the photoxidative action of the HpD should be due to the diverse content of monomers, dimmers and oligomers of the PS components. The results of hemolysis experiments suggest that these differences should result in singular interactions of HpD with the membrane constituents. Photofrin seems to be the more effective HpD concerning the hemolysis of erythrocytes and logP values. Therefore the results of all used methodologies suggest that clorin-e6-derivative seems to be a much more efficient PS, followed by the three HpD. Photooxidation experiments performed in simple solution provide valuable information on structure-activity relationships, but neglect the effects due to of membrane interactions; the PS molecule can bind with the membrane of RBC and this PS-RBC complex is a unique system with different photophysical and photochemical properties. These results have been confirmed in our group by cytotoxic studies with tumor and non-tumor cells as well as by chromatographic separation of the HpDs showing that the correlation between the parameters still holds.

A estomatite sob prótese é uma inflamação causada pela Candida spp associada ao uso de próteses totais e que também pode ser encontrada em pacientes usuários de outros tipos de próteses. Uma das principais preocupações é promover uma condição de saúde adequada a esses usuários. Assim, tem-se pesquisado muitos métodos de higienização das próteses totais e tratamentos para eliminação da Candida. Nos pacientes com sistema imunológico debilitado, desnutridos, idosos e recém-nascidos, a ocorrência de candidíase é alta, em suas variadas formas clínicas. Para o tratamento convencional da doença utiliza-se a nistatina ou miconazol. A terapia fotodinâmica (PDT, do inglês Photodynamic Therapy) é uma técnica que pode potencialmente atingir células prejudiciais sem afetar os tecidos normais do hospedeiro. A efetividade da terapia combina dois princípios: o acúmulo preferencial de fotossensibilizador nas células alvo e a irradiação precisa da luz, o que possibilita a ação seletiva e localizada da terapia fotodinâmica. A terapia apresenta como vantagens ser um método não invasivo; que não apresenta evidência de promover resistência bacteriana; de baixo custo quando comparado ao laser de alta potência; sem efeitos colaterais, além de agir seletivamente na área de aplicação. O presente estudo teve por objetivo avaliar a ação da PDT no tratamento da estomatite sob prótese em usuários de próteses totais. Após triagem, 22 pacientes foram selecionados (seguindo os critérios de inclusão e exclusão) e divididos em dois grupos: controle (05 mL de nistatina, 06 vezes ao dia, durante 14 dias) e experimental, submetidos à PDT, cujo protocolo foi: irradiação, por meio da técnica pontual em contato, de 120J/cm² de densidade de energia, 40mW de potência, 2min por ponto. A PDT2 foi realizada 07 dias após a PDT1. Para ambos os grupos foi realizada uma coleta 30 dias após a terapia proposta. Todo material coletado passou por diluições seriadas, semeado em meios de cultura e incubados para posterior contagem do número de unidades formadoras de colônias (UFC). Nos grupos em que houve isolamento da levedura, todos os tratamentos com a PDT reduziram significativamente (p<0.05) a carga da levedura na mucosa dos pacientes em todos os tempos de tratamento, comparado a fase pré tratamento. Houve uma redução significante (p<0.05) no grupo tratado, por 7 dias, quando comparado ao grupo tratado, após os 30 dias. Nos pacientes em que houve isolamento da levedura a redução no isolamento foi significativamente maior (p<0.05) em todos os tempos de tratamentos quando comparado ao grupo de pacientes na fase pré tratamento, não houve diferença significante (p<0.05) no isolamento da levedura em nenhum tempo do tratamento, (Figura 16). A redução no isolamento de Candida foi significativamente maior (p<0.05) no grupo tratado com a terapia fotodinâmica (PDT) por 7 e 14 dias quando comparado ao grupo tratado com nistatina pelo mesmo período. Com isso foi possível concluir que, dentro das condições clínicas desde trabalho, o tratamento com terapia fotodinâmica foi uma alternativa eficaz no tratamento da estomatite sob prótese / Denture stomatitis is pathological condition in complete or partial denture wearers caused by Candida spp. In the present, the major concern is to promote a proper health condition. Thus, many hygiene methods and treatments for elimination of Candida have been studied. The incidence of candidiasis is high in patients with low immune system, elderly and infants. For the conventional treatment, nystatin or miconazole are used. Photodynamic Therapy is a technique that can potentially reach harmful cells without damaging effects to normal tissue. The effectiveness of the therapy combines two principles: the preferential accumulation of the sensitizer in the target cells and light irradiation, which enables the selective and localized photodynamic therapy. PDT has the advantage of be a noninvasive treatment, shows no evidence promoting bacterial resistance, has low cost when compared to hight power lasers, has no side effects and act selectively in the area of application. The aim of this study was to evaluate the PDT effectiveness on denture stomatitis treatment in complete denture wearers. 22 patients were selected (by inclusion and exclusion criteria) and located in two groups: control (05 mL of nystatin, 06 times a day, 2 weeks) and experimental group, treated by PDT which protocol was: irradiation by laser with wavelength of 660nm, output power of 40mW, energy density of 120 J/cm², 02 minutes per point. The PDT2 was performed 07 days after PDT1. For both groups samples were collected 30 days after the proposed therapy. Sample were collected from the palatal mucosa and underwent serial dilution, were spread into culture media and incubated for subsequent colony forming units counting (CFU). All treatments with PDT significantly reduced (p <0.05) the number of yeast counting in patients mucosa at all treatment times compared to before treatment (initial). There were significant decrease (p <0.05) in the group after one week of treatment when compared to the group 30 day after treatment. The reduction in the isolation of Candida was significantly higher (p <0.05) in the group treated by the photodynamic therapy (PDT) on day 7 and 14 when compared with group treated by nystatin for the same period. Thus, we conclude that under the conditions provided by this clinical study, photodynamic therapy can be an effective alternative treatment of denture stomatitis in complete denture wearers.