El género Enterococcus es conocido por ser de origen fecal o intestinal, pero tiene una amplia distribución en la naturaleza y se le puede encontrar en suelos, aguas, plantas y en productos alimenticios, siendo capaz de sobrevivir en medios poco enriquecidos. Los estudios reportados sobre estos microorganismos generalmente inciden en su aspecto clínico y su resistencia a antibióticos, y algunos se ubican en un contexto ambiental evaluando métodos para su detección o enumeración para uso en aguas recreacionales. Está aumentando la importancia de este microorganismo como agente causal de infecciones adquiridas en hospitales, pero el interés de estudio en este género radica en su alta resistencia natural a múltiples antimicrobianos y a su capacidad de adquirir y transferir dicha resistencia. Se sabe que Enterococcus es un microorganismo introducido al ecosistema marino debido a la contaminación de éste ambiente con desechos orgánicos, pero son pocos los reportes sobre estudios de resistencia antimicrobiana de éste género provenientes de muestras de agua de mar, siendo necesario este tipo de investigación que nos permita conocer la importancia de estos microorganismos en estos ambientes. / The genus Enterococcus is recognized as being of fecal origin but have a wide distribution in nature, they can be found in soil, water, plants and food products, being able to survive in low-enriched media. Studies on these microorganisms usually affect their appearance and clinical resistance to antibiotics, and there are some who are placed in an environmental context, evaluating methods of detection or enumeration in waters for recreational use. It is increasing the importance of this microorganism as a causative agent of infections acquired in hospitals, but the interest in this kind of study lies in its high natural resistance to multiple antimicrobials and their ability to acquire and transfer the resistance. Despite that Enterococcus is a microorganism introduced to the marine ecosystem by contamination with organic wastes, there are few reports on studies of antimicrobial resistance of the Enterococcus genus water samples from the sea, being necessary to this type of research that allows us to know the importance of these microorganisms in these environments.

El género Enterococcus es conocido por ser de origen fecal o intestinal, pero tiene una amplia distribución en la naturaleza y se le puede encontrar en suelos, aguas, plantas y en productos alimenticios, siendo capaz de sobrevivir en medios poco enriquecidos. Los estudios reportados sobre estos microorganismos generalmente inciden en su aspecto clínico y su resistencia a antibióticos, y algunos se ubican en un contexto ambiental evaluando métodos para su detección o enumeración para uso en aguas recreacionales. Está aumentando la importancia de este microorganismo como agente causal de infecciones adquiridas en hospitales, pero el interés de estudio en este género radica en su alta resistencia natural a múltiples antimicrobianos y a su capacidad de adquirir y transferir dicha resistencia. Se sabe que Enterococcus es un microorganismo introducido al ecosistema marino debido a la contaminación de éste ambiente con desechos orgánicos, pero son pocos los reportes sobre estudios de resistencia antimicrobiana de éste género provenientes de muestras de agua de mar, siendo necesario este tipo de investigación que nos permita conocer la importancia de estos microorganismos en estos ambientes. / The genus Enterococcus is recognized as being of fecal origin but have a wide distribution in nature, they can be found in soil, water, plants and food products, being able to survive in low-enriched media. Studies on these microorganisms usually affect their appearance and clinical resistance to antibiotics, and there are some who are placed in an environmental context, evaluating methods of detection or enumeration in waters for recreational use. It is increasing the importance of this microorganism as a causative agent of infections acquired in hospitals, but the interest in this kind of study lies in its high natural resistance to multiple antimicrobials and their ability to acquire and transfer the resistance. Despite that Enterococcus is a microorganism introduced to the marine ecosystem by contamination with organic wastes, there are few reports on studies of antimicrobial resistance of the Enterococcus genus water samples from the sea, being necessary to this type of research that allows us to know the importance of these microorganisms in these environments.

Objetivo general. Abordar la caracterización molecular y funcional de un sistema binario de plásmidos crípticos involucrados en la transferencia horizontal de genes por conjugación en la bacteria fijadora de nitrógeno y simbionte de alfalfa, Sinorhizobium meliloti. Objetivos específicos. En el marco del objetivo precedente abordaremos el estudio de las funciones que hacen a la transferencia conjugativa y a la replicación del plásmido críptico modelo pSmeLPU88b de S. meliloti descripto previamente por Pistorio et al., (2003) según el siguiente esquema: - Identificación y caracterización de elementos estructurales y genes involucrados en la movilización del plásmido modelo pSmeLPU88b. - Caracterización del complejo Dtr (DNA transfer and replication). - Clonado, y caracterización de la región génica del plásmido pSmeLPU88b asociada al módulo Dtr. Búsqueda y caracterización del gen de la relaxasa y de su producto de traducción como una de las proteínas centrales de la transferencia de ADN via conjugativa. - Identificación y caracterización funcional del origen de transferencia (oriT). - Evaluación con herramientas moleculares del grado de ubicuidad de funciones de movilización (Dtr) en S. meliloti. - Identificación y caracterización de los módulos de replicación del plásmido pSmeLPU88b. - Clonado de los módulos de replicación, secuenciamiento, estudios de incompatibilidad. - Evaluación de la transmisibilidad del plásmido pSmeLPU88b en el medio suelo, en condiciones de laboratorio y de campo.

Las salmonelas no-tifoideas que causan actualmente infecciones en seres humanos son frecuentemente epidémicas y resistentes a los antimicrobianos (R), además de virulentas (V). La evolución de las bacterias en cuanto a la adquisición de determinantes-V y/o -R se debe,fundamentalmente, a la incorporación, a menudo secuencial, de piezas de ADN, cuya combinación origina nuevos elementos genéticos, que quedan inmediatamente sometidos a la selección natural en un ambiente cambiante.Los genes-V y -R pueden estar aislados, formando pequeñas agrupaciones (islotes) y/o en agrupaciones mayores (islas genómicas o de patogenicidad) y pueden ser de localización cromosómica o plasmídica. Los genes-R, una vez seleccionados, pueden mantenerse en las bacterias originarias y su descendencia o bien diseminarse entre bacterias más o menos relacionadas a través de los elementos genéticos móviles (EGMs) entre los que destacan el sistema integrón-casete génica, los transposones, los plásmidos y las islas gen.En la presente tesis se llevaron a cabo estudios de epidemiología molecular en 176 aislamientos de Salmonella enterica pertenecientes a tres serotipos no prevalentes, aunque causantes de alertas epidemiológicas: Hadar, Brandenburg y Ohio. Se determinó el impacto epidemiológico de los mismos, identificando los tipos endémicos y prevalentes en el Principado de Asturias y su posible presencia en otras áreas geográficas. Los subtipos fueron trazados mediante análisis de macrorrestricción genómica-PFGE y genotipos-R y -V. Como ejemplo tenemos que los subtipos prevalentes de Hadar se pueden considerar endémicos en España y uno de ellos causó un brote nacional asociado a la salsa de pollos asados comerciales en 2005. Los estudios de resistencia revelaron un amplio porcentaje de cepas con resistencia múltiple (RM) y una correlación entre ésta y la presencia de EGMs. En los tres serotipos se identificaron plásmidos-R, de tamaño variable (9-300 Kb) y diferentes genotipos-R, la mayoría de los cuales resultaron conjugativos. En aislamientos con RM de Brandenburg y Ohio, pero no de Hadar, se detectó un integrón de clase 1 (1600/dfrA1-aadA1), asociado a transposones de tipo Tn21 y estos, a su vez, a Tn9. En aquellos resistentes a tetraciclina se encontraron transposones de tipo Tn1721 y Tn10, portadores de los genes tet(A) y tet(B), respectivamente. Esta es la primera vez que se estudian los perfiles de genes-R en los plásmidos del serotipo Hadar y la organización de los EGMs implicados en la RM en los serotipos Brandenburg y Ohio. La determinación de los perfiles-V reveló pequeñas diferencias intra-serotipo en el caso de Hadar y Brandenburg (presencia/ausencia de sopE). Las variaciones inter-serotipo eran mayores: Hadar carecía de los genes agfA, sugR y rhuM, presentes en los otros dos serotipos, mientras que todos los aislamientos de Ohio presentaron un gen sugR delecionado y fueron negativos para sopE. Todos los aislamientos poseían las cinco islas de patogenicidad (SPI1-5) identificadas en la cepa tipo S. Typhimurium LT2.

Los plásmidos en cepas de Acidithiobacillus sp. aislados de aguas ácidas de mina son recursos genéticos que aún no han sido reportado en nuestro país, que podrían usarse en la construcción de vectores y el mejoramiento de cepas bacterianas para su aplicación en biorremediación y biolixiviación. Por ello, el objetivo de esta tesis fue determinar la presencia de plásmidos de Acidithiobacillus aislados de aguas ácidas de zonas mineras, y analizar in sílico genes putativos identificados a partir del secuenciamiento y anotación de dos plásmidos de la cepa At. ferrivorans PQ33. Para la extracción de plásmidos se utilizó el protocolo de PureLink™ Quick Plasmid Miniprep Kit (Invitrogen ™). Los plásmidos de At. ferrivorans PQ33 fueron secuenciados por síntesis química en sistema HiSeq 200 de Illumina. El software Velveth, versión 1.1, fue empleado para el ensamblamiento de novo de las secuencias. Los plásmidos circularizados fueron anotados usando las herramientas Prokka y ORFfinder, las búsquedas de similaridad se realizaron empleando BlastX contra la base de datos del GenBank. Blastn y el software Artemis fueron usados para identificar los orígenes de replicación. De 24 cepas de Acidithiobacillus (10 de Puno, 6 de Huancavelica y 8 de Cerro de Pasco), 17 (70.83%) presentaron plásmidos. El análisis in silico reveló la presencia de genes implicados en la conjugación (TraD, MobA, proteínas de exclusión de entrada y XerD), sistemas toxina-anti toxina (HicA y HicB), proteínas de replicación (RepA y proteínas de union a DNA), reguladores de transcripción y post traducción (CopG y la chaperona DnaJ), así como la destacable presencia de una proteína de virulencia (VapD), además de dos proteínas (Porina fosfato selectiva O y diguanilato ciclasa), implicadas en la resistencia a la falta de nutrientes y producción de biofilm, respectivamente. Es la primera vez que se reporta plásmidos caracterizados de un cepa psicrotolerante de Acidithiobacillus ferrivorans, con capacidad de transferencia horizontal y sistemas de regulación implicados tanto en el mantenimiento del plásmido como en la adherencia a sustratos, característica importante de esta especie para su aplicación en biominería. / Tesis

Acinetobacter baumannii es un cocobacilo aeróbico, Gram negativo y considerado un patógeno nosocomial emergente, que ha desarrollado resistencia a múltiples fármacos. El presente trabajo tuvo como objetivo determinar la resistencia antimicrobiana de cepas de Acinetobacter baumannii aisladas de pacientes internados en el Hospital Nacional Guillermo Almenara Irigoyen y relacionarlo con la presencia de plásmidos, así como determinar la prevalencia de esta especie en dicho nosocomio según el servicio de hospitalización, tipo de muestra, edad, sexo y factores de comorbilidad, mortalidad y estacionalidad. Se identificaron 40 cepas de A. baumannii de origen clínico aisladas de muestras de pacientes hospitalizados del nosocomio Guillermo Almenara Irigoyen durante enero-diciembre del 2012. Las cepas fueron identificadas mediante el sistema automatizado Micro Scan y el método convencional. Se utilizo Agar MacConkey y Agar Leeds Acinetobacter, incubándose a 37 y 44°C respectivamente, en la coloración Gram se observaron cocobacilos Gram negativas, se hicieron pruebas bioquímicas como TSI, citrato y gelatina además de la pruebas de oxidasa y catalasa. Se realizó la sensibilidad antimicrobiana a través del sistema automatizado Micro Scan y el método de difusión en disco. El 100% de las cepas mostraron resistencia a cefalosporina de tercera generación, meropenem, imipenem, ciprofloxacino, ticar/Ac. clavulánico. El 93.5% fueron resistentes a cefepime y sulfametoxazol-trimetoprim, el 95 % a levofloxacino, el 90% a amikacina, el 45% a gentamicina, el 37.5% a tobramicina y el 30% a tetraciclina. Se registraron 12 antibiotipos de resistencia, con una mayor frecuencia en el servicio de Unidad de cuidados Intensivos. Se determinó el perfil plasmídico de las cepas estudiadas, obteniendo 31 perfiles según el número y tamaño de las bandas, que oscila entre 1,240 - 55,459 pb aproximadamente; luego se relacionó con los patrones de resistencia y el origen de aislamiento de la cepa. Además se realizó la curación de las cepas con bromuro de etidio a una concentración del 300 µg/ml. Las cepas que perdieron la resistencia fueron interpretadas como portadoras de resistencia plasmídica a los determinados antibióticos. Además se determinó una prevalencia del 7.42% de total de bacterias gram negativas aisladas, presentando un mayor número de casos en los meses de verano e invierno, con una misma proporción para ambos sexos, la edad promedio de los pacientes infectados fue 62.314±19.745. A.baumannii se aisló principalmente de muestras respiratorias, seguida de hemocultivos y líquidos biológicos provenientes del servicio de UCI, Medicina Interna 1 y Cirugía General 5. Las infecciones se asociaron a pacientes con estados de inmunosupresión debido a procesos quirúrgicos y enfermedades base como cáncer, insuficiencia hepática crónica, insuficiencia renal y EPOC. La tasa de mortalidad asociada a la infección fue del 56.4%. / ---- Acinetobacter baumannii is an aerobic, Gram-negative coccobacillus and is considered an emerging nosocomial pathogen that has developed resistance to multiple drugs. The present study aimed to determine the antimicrobial resistance in Acinetobacter baumannii strains isolated from patients hospitalized in the Guillermo Almenara Irigoyen National Hospital and its relationship with the presence of plasmids, and determine the prevalence of this species in that hospital according to the inpatient service , sample type, age, sex and comorbidity, mortality and seasonality factors. 40 A. baumannii strains of clinical origin, isolated from samples of hospitalized patients at the Guillermo Almenara Irigoyen hospital during January and December 2012, were identified. Strains were identified by the MicroScan Automated System and by the conventional method. MacConkey Agar and Leeds Acinetobacter Agar were used, incubating at 37 and 44ºC, respectively. Gram-negative coccobacillus were observed in the Gram stain. Biochemical test including TSI, citrate and gelatin were performed, in addition to the oxidase and catalase tests. Antimicrobial susceptibility testing was performed using the Micro Scan automated system and the disk diffusion method. 100% of the strains showed resistance to third-generation cephalosporin, meropenem, imipenem, ciprofloxacin, ticar / clavulanic acid. 93.5% were resistant to cefepime and trimethoprim-sulfamethoxazole, 95% to levofloxacin, 90% to amikacin, 45% to gentamicin, 37.5% to tobramycin and 30% to tetracycline. 12 resistance antibiotypes were recorded, with more frequency in the intensive care unit service. The plasmid profile of the studied strains was determined, obtaining 31 profiles according to the number and size of the bands, which ranged from about 1,240– 55,459 bp; these were then associated with the resistance patterns and the isolation origin of the strain. Furthermore, strain curing was performed with ethidium bromide at a concentration of 300 µg/ml. Strains that lost resistance were interpreted as strains carrying plasmidic resistance to certain antibiotics. Moreover, a prevalence of 7.42% of total isolated Gram-negative bacteria was determined, presenting a larger number of cases in the summer and winter, with the same proportion for both sexes; the average age of infected patients was 62.314 ± 19.745. A. baumannii was mainly isolated from respiratory samples, followed by blood cultures and biological fluids samples from the UCI service, Internal Medicine 1 and General Surgery 5. The infections were associated to patients with immunosuppression state caused by surgical procedures and underlying diseases such as cancer, chronic liver failure, kidney failure and EPOC. The mortality rate associated with infection was 56.4%. Keywords: Acinetobacter baumannii, nosocomial infection, antimicrobial resistance plasmids, plasmids healing, hospital prevalence.

Investiga la resistencia bacteriana al ión mercurio (Hg2+) en 55 cepas de Escherichia coli aisladas de diferentes ambientes marinos de la costa limeña: Bahía de Pucusana, Bahía de Miraflores y Bahía del Callao (Lima-Perú). Se determinan los diferentes serogrupos de las cepas, utilizando sueros polivalentes EPEC, EIEC y EHEC; la resistencia al mercurio es evaluada realizando pruebas de MIC a cloruro de mercurio: 30, 50, 80, 100, 200, 300 y 400 µM/mL disuelto en caldo LB. Se evalúa las cepas mercurio-resistentes frente a antibióticos clínicos por la técnica de difusión en placa usando los siguientes antibióticos en discos: Cloramfenicol (C), 30 µg; Norfloxacina (Nor),10 µg; Amikacina (Ak), 30 µg; Kanamicina (K), 30 µg; Ampicilina (A), 10 µg; Sulfaperazone (Sfp), 30 µg; Tetraciclina (Te), 30 µg; Aztreonam (Az), 30 µg; Ceftazidima (Caz), 30 µg; Gentamicina (Ge), 10 µg; Amoxicilina (Amx), 25 µg; Sulfametoxazol-trimetoprim (Sxt), 25 µg; Ácido Nalidíxico (W), 30 µg; Ciprofloxacina (Cip), 5 µg. El origen de la resistencia al mercurio mediada por plásmidos se comprueba mediante la técnica de curación con SDS (10 % p/v); se realiza la técnica de conjugación de plásmidos tomando la cepa receptora E. coli DH5α. Para la visualización de los plásmidos conjugativos se realiza la técnica de extracción de plásmidos con el método de Lisis Alcalina con SDS en las cepas receptoras mercurio-resistentes. Así mismo se evalúa la presencia del gen merA, que se encuentra en el operón mer, por el método del PCR tomando como DNA molde los plásmidos aislados. Del total de las cepas de E. coli (n=55) estudiadas, el 29,1 % (n=16) resultan ser positivas para los serogrupos EPEC, de éstas: 31,25 % EPEC poliA, 50 % EPEC poliB, 18,75 % EPEC poliC. El 74,54 % (n=41) son resistentes al mercurio en distintas concentraciones, de éstas el 34,15 % son resistentes a antibióticos; se observa la resistencia al mercurio mediada por plásmidos en el 80,5 %. De las cepas mercurio resistentes, el 14,63 % (n=6) muestran ser portadores de plásmidos conjugativos, observándose la presencia de estos en las cepas receptoras mercurio resistentes. Se observa la presencia truncada o aberrante del gen merA en los plásmidos aislados, confirmando la frecuencia del operón mer en el 14,63 % de las cepas mercurio resistentes. / Tesis

La transferencia horizontal de genes (HGT) ha sido uno de los temas más debatidos en biología evolutiva durante las últimas dos décadas debido a que esto ha desafiado considerablemente nuestra visión acerca de la historia evolutiva de los genomas. En el caso de organismos procariotas como las bacterias, la adquisición de genes de otros individuos alejados filogenéticamente les ha permitido producir genomas extraordinariamente heterogéneos y dinámicos cambiando por tanto, la ecología y la patogenicidad de las especies bacterianas (Maiden 1998; Gogarten et al., 2002; Ochman et al., 2000). En eucariotas también se ha registrado la ocurrencia de eventos de HGT, los cuales incluyen a un gran número de genes provenientes de varios donadores en los rotíferos de la clase Bdelloidea (Gladyshev et al., 2008) o la transferencia de genes de la bacteria intracelular Wolbachia dentro del genoma de sus hospederos artrópodos (Hotopp et al., 2007). En plantas, el modelo mejor conocido sigue siendo el del género Agrobacterium cuyo mecanismo de infección involucra la transferencia e integración de una región del plásmido Ti al genoma de la célula vegetal. El impacto de este hallazgo ha tenido grandes aplicaciones en diversos campos de la biología vegetal, agricultura y biotecnología. Sin embargo, el descubrimiento de secuencias homólogas al T-DNA del plásmido Ri de Agrobacterium rizhognenes en el genoma de especies del género Nicotiana (White et al., 1983; Furner et al., 1986), Daucus carota “zanahoria” (Spano et al., 1982) y Convulvus arvensis (Tepfer, 1982) han evidenciado que la ocurrencia de este tipo de eventos actúan como una fuerza significativa en la evolución de genomas eucariotas (Richardson y Palmer, 2007; Bock, 2010; Talianova y Janousek, 2011). La importancia de estos hallazgos incrementa la necesidad de realizar más investigaciones para entender el mecanismo de flujo horizontal de genes a través de bacterias en la evolución de plantas superiores, por lo que el presente trabajo de tesis pretende identificar y caracterizar la presencia de secuencias homólogas al T-DNA del plásmido Ti de Agrobacterium spp. en el genoma de Ipomoea batatas (L.) Lam “camote” y especies silvestres relacionadas, con el fin de evidenciar la ocurrencia de eventos de HGT en este género y el posible impacto de este hallazgo en su evolución. / Tesis

Ingeniero Civil Químico. Ingeniero Civil en Biotecnología / Cuando se habla de ciencia e ingeniería, los métodos y herramientas utilizados son bastante distintos entre ellos. Bajo esta diferencia aparece la biología sintética, disciplina que busca diseñar y modificar organismos vivos para producir nuevas funciones y/o mejorar las ya existentes. Para ello hace uso de herramientas básicas de la ingeniería, tales como los conceptos de modularidad, estandarización, abstracción, modelamiento y diseño. Para poder estandarizar las unidades básicas de esta disciplina, los biobricks, se pueden utilizar pruebas en matraces, pero no es usual hacerlo en biorreactores. La concepción, diseño implementación y operación de uno de estos equipos constituye el objetivo principal de este proyecto. Como parte de los resultados del mismo, se estimó que el mejor modo de operar para lograr estas mediciones se compone de una cascada de CSTRs, la que fue implementada en escala de laboratorio. Para las pruebas de medición se construyeron cinco plásmidos, de los cuales cuatro fueron elaborados con técnicas usadas en biología sintética. De estos últimos, se obtuvo dos vectores con alta producción basal en LB, otro que no sintetizó la proteína esperada y sólo el último presentó un comportamiento apropiado, vale decir, producción basal baja y un aumento significativo en presencia de inductor. Para analizar el comportamiento del reactor en operación, se realizó una experiencia de distribución de tiempos de residencia. Los resultados indicaron que la diferencia entre el biorreactor, compuesto por 7 minirreactores CSTR en serie, y el modelo matemático, fue aproximadamente un 1%. En las pruebas de operación del biorreactor con bacterias, se obtuvo que la cepa con el promotor que responde a arabinosa posee un crecimiento más alto que la cepa con promotor sensible a aTc. En cambio, en términos de producción de proteína, el promotor sensible a aTc posee una inducción más fuerte. Específicamente, usando un flujo de 0,794 [mL/min], este promotor mostró una mayor productividad de proteína por biomasa, lo que lo caracteriza como un promotor fuerte.

Identifica y determina la prevalencia de los genes blaOXA-23-like, blaOXA-24-like y blaOXA-58-like, que codifican las carbapenemasas de tipo OXA, las cuales son consideraras clínicamente relevantes en el Acinetobacter baumannii. Se analizaron 51 aislamientos de Acinetobacter baumannii con perfil de resistencia a carbapenémicos provenientes del Laboratorio Clínico de un Hospital Nacional de Referencia en Lima de diciembre 2017 – marzo 2018. Se determinó fenotípicamente la presencia de carbapenemasas por el método de inactivación de los carbapenémicos seguido de la identificación genotípica de los genes del tipo OXA de mayor importancia clínica la cual se realizó por PCR multiplex los genes blaOXA-23-like, blaOXA-24-like y blaOXA-58-like. Se obtuvieron fenotípicamente 51/51 (100%) pruebas positivas para la presencia de carbapenemasas en las cuales se identificaron genéticamente la presencia de 38/51 (74,5%) blaOXA-24- like y 5/51 (9,8%) blaOXA-58-like. Un solo gen en 33/51 (64,7%) cepas corresponden a blaOXA-24-like y 2 genes en 5/51 (9,8%) cepas corresponden a blaOXA-24-like y blaOXA-58-like; no se detectó la presencia de genes codificantes blaOXA-23-like. Se concluye que el 100% de las cepas recolectadas, evaluadas a través del método MIC*, son productoras de enzimas carbapenemasas; así mismo el 38/51 (74,5%) de estas cepas portaban genes codificantes de blaOXA- 24-like y blaOXA-58-like siendo el gen blaOXA-24-like el más prevalente. Finalmente en el presente estudio no se detectó la presencia de genes codificantes blaOXA-23-like. / Tesis