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Orientador: Tomomasa Yano / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-03T16:05:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Turri_RosimarydeJesusGomes_D.pdf: 4713341 bytes, checksum: a2618f7a635a48396756637f024bcee9 (MD5) Previous issue date: 2003 / Resumo: A patogênese da K.pneumoniae e Ecoli pode ser diretamente influenciada pelos fatores de virulência, dentre os quais encontram-se polissacarídeos capsulares, lipopolissacarídeos tóxicos, adesinas e sistema de aquisição de ferro. Além desses fatores de virulência, muito pouco é conhecido sobre outros fatores que podem participar da patogênese da K.pneumoniae. O presente trabalho estuda os fatores de virulência de K.pneumoniae e Ecoli isoladas de infecções nosocomiais em amostras ESBL (+) e ESBL (-), tendo como objetivos a comparação do grau de patogenicidade e produção de fatores de virulência por essas amostras in vivo e in vitro; a verificação da influência das condições de cultivo sobre a expressão de citotoxinas; o estudo do padrão de adesão em linhagens celulares; análise da influência da dose subinibitória de antibióticos beta-Iactâmicos sobre a produção de fatores de virulência pelas amostras ESBL (+). K.pneumoniae e Ecoli ESBL (+) apresentaram atividades hemolíticas moduladas pelo meio de cultura e pelas condições de cultivo, frente a sangue de eqüino e carneiro. A dose subinibitória do antibiótico estimulou a produção da hemolisina, sobre hemácias de eqüinos em meio Müller-Hinton apenas na presença do oxigênio. A carência de ferro nos meios induziu a produção de hemolisina, independente da aeração para hemácias eqüinas pelas amostras ESBL (+). O sobrenadante das culturas bacterianas apresentou atividade citotóxica em culturas de células HeLa, Vero e HT-29. Amostras ESBL (+) foram mais resistentes à ação bactericida do soro humano normal Que as ESBL (-). O padrão de adesão predominante entre amostras foi do tipo agregativo. Não foi observada diferença no grau de virulência para camundongos entre amostras ESBL (+) e ESBL(-) / Abstract: Virulence factors, such endotoxin, adhesins, cell envelope and the acquisition of iron system may be associated with K. pneumoniae and E. coli pathogenicity. However others virulence factors are not yet studied for understanding pathogeneses of K. pneumoniae. The aim of the present study is the comparation of potential virulence factors in strains of K. pneumoniae and E.coli ESBL (+) and ESBL (-) isolated from nosocomial infections, such characterization of adhesive properties in eukaryotic cells , influence of sub inhibitory dose of beta-Iactams antibiotics in toxins expression and virulence factors production in ESBL (+) strains. K. pneumonia e and E. coli ESBL (+) showed hemolytic activity towards sheep and horse erythrocytes regulated by culture conditions. The sub inhibitory dose of beta lactams antibiotics increased the hemolysin production in Mueller-Hinton agar with horse erythrocytes in oxygen presence. The iron absence in media culture improved the hemolytic activity expression, with horse erythrocytes in ESBL (+) strains independent of oxygen. The bacterial supematant culture showed cytotoxic activity in HeLa, Vero and HT -29 cell lines. The ESBL (+) strains were more resistant to the bactericidal action of normal human serum than the ESBL (-). The aggregative pattern of adherence was the predominant among E. colí and K. pneumoniae and was not observed virulence differences in mice in ESBL (+) and ESBL (-) strains / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Lucila Costallart Ricci, Marlene Braide Serafim / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-22T19:39:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Piton_MariaAmeliadeJesus_M.pdf: 13153764 bytes, checksum: 6ed463b9ceca25bff6a2da9c5dba060a (MD5) Previous issue date: 1997 / Resumo: Neste trabalho, foram estudadas 111 amostras de Escherichia coli isoladas de 60 fezes diarréicas de adultos e crianças encaminhados ao Hospital das Clínicas da UNICAMP, no período de Janeiro de 1992 a Março de 1994. Paralelamente, 27 cepas de E. coli isoladas de 19 amostras de fezes normais, também foram pesquisadas como grupo controle. Os 138 isolados de E. coli eram procedentes de coproculturas negativas para os enteropatógenos pertencentes aos gêneros Shigella, Salmonella e Yersinia, além dos sorogrupos mais associados aos virotipos EIEC, EPEC e EHEC. Na pesquisa da produção das enterotoxinas STa e L T-I do grupo ETEC, apenas a enterotoxina termo-Iábil foi identificada, inicialmente pela técnica sorológica da Imuno Hemólise Radial (SRIH). Porém, pela alta frequência de resultados positivos observada, esta técnica foi avaliada quanto a possíveis reações falso-positivas, a outros métodos sorológicos, métodos biológicos e a métodos moleculares normalmente também utilizados na identificação da L T -I. Dentre estas técnicas, o teste biológico utilizando-se culturas de células Vero e o GM1-ELlSA, foram os mais sensíveis na detecção da L T-I, identificando apenas 5 amostras produtoras desta enterotoxina, dentre as 111 isoladas de fezes diarréicas (3,6% ETEC L T-I). Demonstraram, desta forma, serem os mais adequados na identificação da enterotoxina L T -I em cepas isoladas de levantamentos epidemiológicos. Com relação aos testes sorológicos que utilizam hemácias de carneiro como suporte da reação hemolítica, tais como SRIH e micro-PIH (97,8% de concordância), estes podem ser utilizados como técnicas de triagem na pesquisa de L T -I. Porém, estas técnicas devem ser re padronizadas sempre que houver mudança da procedência dos eritrócitos, verificando-se a adequação da diluição do soro anti-toxina utilizado em reações sorológicas desenvolvidas com sobrenadantes de cultura de menos 10 amostras de E. coli positivas para esta enterotoxina e 10 cepas negativas. Quanto às provas de hibridização, 4 amostras hibridizaram com a sonda para L T-I, apresentando esta técnica 99,2% de concordância com a técnica de cultura celular e GM1-ELlSA. Com relação a determinação dos sorogrupos, dentre as cepas isoladas de fezes diarréicas, verificou-se maior freqüência de O11, O60 e O90, enquanto que nos isolados de fezes normais os sorogrupos mais freqüentes foram O6, O8 O14 e O87. Dentre as amostras isoladas de fezes diarréicas, dois sorogrupos descritos em EIEC (O171 e O29), além de um sorogrupo descrito para EPEC (O119) foram identificados. Maior número de produção de colicinas e maior variabilidade das mesmas foi verificado nos isolados de fezes normais (44.5% de cepas produtoras). Por outro lado, dentre as 111 amostras procedentes de fezes diarréicas, apenas 15 amostras (13,5%) produziram colicinas , dentre estas uma amostra produtora do Col V. Quanto à resistência aos antimicrobianos, as amostras isoladas de fezes diarréicas apresentaram resistência frente aos 6 antimicrobianos avaliados, superiores aos verificados junto ao grupo controle. No que diz respeito à produção de outras toxinas, uma amostra isolada de fezes diarréicas foi identificada como produtora de CNF1. Porém, produção de L T -li, VT e de CLDT não foi identificada. Por outro lado, testes em alça ligada de coelho demonstraram atividade enterotóxica em sobrenadantes de cultura de cepas não produtoras das demais toxinas. Padrões variados de hemaglutinação D-manose resistente (MRMH) foi observado, sendo que 74% dos isolados de fezes normais hemaglutinaram hemácias de galinha. Nenhum padrão MRMH foi condizente aos descritos para os diferentes Fatores de Colonização de ETEC. A estes somam-se resultados negativos frente aos soros a-CFA/I, a-CFA/II (CS2, CS3), a-CFAIV (CS4, CS5) e a-PCFO2. Com relação ao padrão de aderência às células HEp-2, em período de infecção de 3 horas e de crescimento de mais 3 horas, verificou-se 23 amostras apresentando padrão enteroagregativo, sendo 19 isoladas de fezes diarréicas e 4 de fezes normais foram estudados. Estes dados correspondem a 16.6% de amostras apresentando características do virotipo EaggEC. Dentre as cepas com este padrão, estas correspondem a 14 amostras de fezes, 13 destas de crianças abaixo de 8 anos. No grupo controle, as cepas correspondem a 4 amostras de fezes normais de adultos. Dentre as amostras com fenótipo de aderência em HEp-2, destacamos uma cepa com padrão LA/DA e uma ETEC L T-I com aderência difusa a 37°C, mas não a 16°C. Através da caracterização fenotípica das amostras em estudo, desenvolvida neste trabalho, uma triagem de cepas de interesse no estudo da enteropatogenicidade da E. coli pode ser realizada, o que certamente servirá de suporte para relevantes trabalhos posteriores / Mestrado / Microbiologia / Mestre em Ciências Biológicas

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Calreticulina de Trypanosoma cruzi, (TcCRT) es una proteína presente en el retículo endoplásmico (RE) y traslocada desde este organelo al área de emergencia flagelar, donde captura al componente C1q del sistema del complemento (SC), en una estrategia similar a la utilizada por las células apoptóticas. En consecuencia, la interacción TcCRT/C1q, además de inhibir la activación de la vía clásica del SC, promueve infectividad. Esta Memoria de Título propone estudiar el rol de la sobreexpresión de TcCRT en la infectividad parasitaria mediada por la interacción TcCRT/C1q. Para esto utilizamos una línea parasitaria que sobreexpresa calreticulina (TcCRT+) en un 13% y un clon nativo (wild type, wt), derivados de la cepa Tulahuén de T. cruzi. Nuestros resultados mostraron que tripomastigotes pretratados con C1q aumentan la infectividad en células VERO, en ambas variantes. Por otro lado, tripomastigotes pretratados con C1q y fragmentos F(ab’)2 de inmunoglobulinas anti-TcCRT que carecen de la porción Fc, capaces de inhibir esta interacción, interfieren significativamente con la infectividad dependiente de C1q, reduciendo la internalización de parásitos en células VERO para ambas variantes. Sin embargo, no se evidenció diferencias en cuanto a infección celular entre los tripomastigotes TcCRT+ y wt, por lo cual se concluye que un 13% de sobreexpresión de TcCRT no producen mayor infectividad. Es probable, que esta sobreexpresión no se exprese en la superficie parasitaria y por lo tanto, no participe en el proceso infectivo. Por otra parte, TcCRT es un factor de virulencia sobre la superficie celular, pero probablemente asociada a una gran cantidad de proteínas participando en este complejo proceso

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Las mascotas exóticas, especialmente los reptiles -ampliamente distribuidos por el mundo representan un alto riesgo para la Salud Pública, debido principalmente a su condición de portadores intestinales de Salmonella spp., estimándose que del total de casos de salmonelosis un 7% se asocia al contacto con reptiles (SAR). Del total de SAR un 15% aproximadamente presenta un cuadro invasivo, los cuales incluyen septicemia, meningitis, infección en cartílagos e inclusive la muerte. La invasividad de Salmonella se encuentra asociada a genes de virulencia, que se organizan principalmente en la isla de Patogenicidad 2 (SPI-2) de su genoma. En consideración a lo anterior el propósito de este estudio fue detectar genes de virulencia asociados a invasividad, en cepas de Salmonella spp. aisladas desde reptiles en cautiverio de la Región Metropolitana. En este estudio se seleccionaron cuatro genes de virulencia (spiA, sseG, ssaB, sscB) asociados a invasividad, específicamente a la sobrevivencia de esta bacteria al interior de macrófagos y su diseminación sistémica. De las 34 cepas analizadas, el perfil más frecuente encontrado fue spiA/sscB/sseG (35,2%), seguido por sscB/sseG/ssaB (8,8%), siendo los genes mayormente detectados sseG (91%), ssaB (71%) y sscB (61%), mientras que el gen spiA fue menor su detección (31%). Estos resultados constituyen la primera aproximación molecular de la potencial virulencia de cepas de Salmonella aislada desde reptiles en Chile. Se discuten los resultados con la variabilidad genética en cepas de diferentes fuentes animales y el hombre. / Exotic pets, especially reptiles, are widely distributed throughout the world, particularly in Chile, where a high percentage are intestinal carriers of Salmonella spp. (About 50%), representing a risk to public health. Thus, it is estimated that of all cases of salmonellosis in humans, about 6-7% is associated with contact with reptiles (RAS). Of total RAS, about 15% has a box-invasive, which include septicemia, meningitis, infection in cartilage and even death. Salmonella invasiveness is encoded in virulence genes that are organized primarily in Pathogenicity Island 2 (SPI-2). The purpose of this study was to detect genes associated with invasiveness virulence in Salmonella strains, isolated from reptiles in captivity in the Metropolitan Region. In this study, four virulence genes (spiA, sseG, ssaB, sscB) associated with invasiveness, and therefore, belonging to the pathogenicity island 2 were selected. These genes are related to the survival of the bacteria within macrophages and their systemic dissemination. Of the 34 strains tested, the most common profile was spiA/ sscB/ sseG (35.2%), followed by sscB/sseG/ssaB (8.8%), the most prevalent genes sseG (91%), ssaB (71%) and sscB (61%), while the spiA obtained a lower prevalence (31%). These results provide the first molecular approach of potential virulence of Salmonella strains isolated from reptiles in Chile. The results with the genetic viability in different strains of animals and humans sources are discussed.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El Virus Diarrea Viral Bovina (VDVB) es un patógeno de gran importancia, puesto que es responsable de importantes pérdidas económicas en la industria del bovino, debido a que causa disminución en la producción, trastornos reproductivos y, en algunos casos, puede provocar la muerte del animal. El VDVB pertenece al género Pestivirus de la familia Flaviviridae. Es un virus cuyo genoma es un ARN de hebra simple y polaridad positiva, que presenta dos regiones no codificantes en sus extremos (5’NCR y 3’NCR) y una única región codificante entre ambas, la cual codifica para una poliproteína que contiene todas las proteínas virales. Una de estas proteínas es la glicoproteína Erns, que posee actividad RNasa. Esta actividad enzimática no es necesaria para la multiplicación del virus y se reconoce como un factor de virulencia, dado que su inhibición produce atenuación de los signos clínicos en el hospedero. En la presente memoria se midió la actividad RNasa de cuatro aislados nacionales del VDVB, pertenecientes a los subgenotipos 1b (CH/113 y CH/1025) y 1j (CH/511 y CH/1087), los subgenotipos más predominantes en el país; y la cepa de referencia internacional, NADL, perteneciente al subgenotipo 1a. Ambos virus del subgenotipo 1j presentan una mutación en el sitio activo de la actividad RNasa de la glicoproteína Erns, correspondiente a la sustitución del aminoácido Histidina por Tirosina, mientras que los otros virus estudiados poseen la secuencia silvestre del VDVB. Los resultados obtenidos muestran que los virus del subgenotipo 1j presentan una baja ostensible de su actividad RNasa. Por el contrario, las cepas del subgenotipo 1b presentan niveles de actividad RNasa comparables a los de la cepa de referencia NADL. Al comparar las diferencias en actividad enzimática entre las cepas que presentaron o no la mutación, utilizando el método de Scheffé, se determinó que estas diferencias son estadísticamente significativas. / Proyecto Fondecyt 1060581

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El Virus Diarrea Viral Bovina (VDVB) está ampliamente distribuido a nivel mundial y afecta tanto a rumiantes domésticos (bovinos, caprinos, ovinos, etc.) como silvestres (ñu, jirafa, búfalo, etc.), siendo una de las principales causas de pérdidas económicas en el ganado bovino, debido principalmente a problemas reproductivos. El VDVB presenta una alta variabilidad genómica, que se manifiesta en sus características biológicas y antigénicas. La manifestación clínica de la enfermedad también presenta importantes diferencias, que van desde cuadros subclínicos (la mayoría de los casos) hasta presentaciones con un 100% de mortalidad. Estas diferencias se deben a una serie de factores, tanto del virus como del hospedador, siendo uno de los factores importantes la virulencia del aislado viral, que se asocia a la eficiencia replicativa del VDVB. El objetivo de esta Memoria de Título fue determinar la eficiencia replicativa de diez aislados del VDVB, obtenidos de bovinos naturalmente infectados con diferentes manifestaciones clínicas y pertenecientes a los distintos genotipos y subgenotipos presentes en Chile, ocho pertenecientes al genotipo 1 (VDVB1a, 1b, 1i y 1j) y dos al genotipo 2 (VDVB2a). Para ello, se determinó la cinética de multiplicación viral en cultivos de células Madin-Darby Bovine Kidney y la eficiencia replicativa se estimó ocupando los siguientes indicadores: Producción máxima de viriones (DICT50/ml) (P), Período de multiplicación viral (horas) (T), Velocidad de síntesis de viriones (V), en que V=P/T y la Pendiente durante la fase exponencial de la multiplicación viral (M). De acuerdo a los indicadores, los virus de los subgenotipos 1a y 1j tendrían una alta eficiencia replicativa, principalmente por la capacidad de completar su ciclo infectivo a 12 horas post-infección y los menores tiempos para concluir la multiplicación viral. Por otra parte, los virus del subgenotipo 1b y 1i serían los virus con la menor eficiencia replicativa, considerando su baja producción máxima de viriones, velocidad de síntesis de virus infecciosos y la pendiente durante la fase exponencial de la multiplicación viral

El eje central de la presente Tesis Doctoral ha sido la conexión existente entre la capacidad infectiva de Salmonella typhimurium y el mantenimiento de sus concentraciones intracelulares óptimas de hierro y zinc. El estudio de la relación entre el hierro y la virulencia se realizó mediante la construcción y caracterización de un mutante fur. La proteína Fur es el regulador de los sistemas vinculados con la captación, transporte y almacenamiento de este elemento. La desregulación de estos sistemas en la cepa mutante provoca el aumento de la concentración intracelular de Fe2+ libre, lo que incrementa la actividad de algunas enzimas como la 3',5'-cAMP fosfodiesterasa codificada por el gen cpdA. Este hecho determina una disminución de la concentración de cAMP intracelular y, por consiguiente, una reducción de aquellos genes y regulones que están bajo el control del complejo CRP-cAMP, entre los que se encuentra el sistema de síntesis y ensamblaje de flagelos. Así mismo, se ha demostrado que existe una vinculación adicional entre la proteína Fur y la síntesis flagelar a través del control por parte de ésta del promotor flhDC, conocido también como master operon, y que se encuentra en la cúspide de la cascada de activación de todo el regulón. La reducción de la concentración intracelular de cAMP puede ser la causa de la menor virulencia de los mutantes fur cuando son inoculados intraperitonealmente en ratones BALB/c o Swiss.La vinculación entre el zinc y la capacidad infectiva de S. typhimurium se abordó mediante la construcción de mutantes que tuvieran afectado el gen zur, que codifica el regulador transcripcional relacionado con este elemento, o el gen znuC, que forma parte de un sistema de transporte de alta afinidad. En el primer caso, cuando los sistemas de transporte de zinc de la cepa mutante están desregulados, se observa un ligero descenso de la capacidad infectiva cuando se inocula por vía intraperitoneal dicho mutante en ratones BALB/c. Sin embargo, es la inactivación del sistema de alta afinidad la que comporta una reducción más drástica de la virulencia de la cepa cuando se inocula ya sea por vía oral o intraperitoneal en el huésped. De acuerdo con estos datos, la cepa ZnuC- es excluida por la salvaje a lo largo del proceso infectivo cuando se lleva a cabo una inoculación conjunta con ambas. Finalmente, y mediante la construcción de una cepa mutS de S. typhimurium así como de otra portadora de un plásmido con los genes umuDC de Escherichia coli, se ha comprobado que el incremento de la frecuencia de mutagénesis, tanto espontánea como inducida, no confiere una ventaja selectiva a lo largo del proceso infectivo. En concordancia con ello, también se ha podido constatar que el DNA de las células de S. typhimurium no sufre un nivel de lesiones lo suficientemente elevado como para inducir el sistema de reparación de emergencia durante la infección.Los artículos que se adjuntan en los anexos I, II y III de la presente memoria de Tesis Doctoral contienen los resultados en los que se basa este trabajo.Anexo I: Campoy, S., A. M. Pérez de Rozas, J. Barbé e I. Badiola. 2000. Virulence and mutation rates of Salmonella typhimurium strains with increased mutagenic strength in a mouse model. FEMS Microbiol. Lett. 187:145-150Anexo II: Campoy, S., M. Jara, N. Busquets, A. M. Pérez de Rozas, I. Badiola y J. Barbé. 2002. Intracellular cyclic AMP concentration in decreased in Salmonella typhimurium fur mutants. Microbiology 148:1039-1048Anexo III: Campoy, S., M. Jara, N. Busquets, A. M. Pérez de Rozas, I. Badiola y J. Barbé. 2002. Role of the high-affinity zinc uptake znuABC system in Salmonella enterica serovar Typhimurium virulence. Infect. Immun. 70:4721-4725. / In this work we pretend to elucidate the relation that could be established between Salmonella typhimurium virulence and the zinc or iron intracellular concentrations.The Fur protein is involved in either iron-uptake or iron-storage regulation. In a fur mutant these systems are deregulated, giving raise an increased free Fe2+ concentration. In this situation the enzymic activity of some proteins like 3',5'- cAMP phosphodiesterase, encoded by cpdA gene, may be stimulated, decreasing the fur mutant final cAMP intracellular concentration. This lower cAMP level altered the expression of all the genes that are under the CRP-cAMP regulation like flagellar system. In this work, we also demonstrate that there is a direct relationship between Fur protein and the flagellar synthesis, in fact, Fur can regulate this system by controlling the expression of flhDC operon, also called master operon, which is the starting point of all the activation cascade.The reduction of the cAMP intracellular concentration could be the responsible of the lower fur mutants virulence when this strain is inoculated in BALB/c or Swiss mice.To study the relation between zinc and virulence two mutants were constructed a zur and a znuC mutant. The first one has its zinc-uptake systems deregulated, and we observed that in this case the virulence was lower when this strain was intraperitoneally inoculated in BALB/c mice. But is in the znuC mutant, where the high-affinity zinc uptake system was affected, when it was, either in an oral or an intraperitoneal inoculation, the greatest reduction of virulence capacity.Finally, the relation of mutation rates and virulence was also tested. To do that, two strains of S. typhimurium presenting increased mutation rates, either spontaneous or mediated by DNA damage have been constructed. One of the strains carries a null mutS mutation, while the other harbours a plasmid which contains the Escherichia coli umuDC operon. The virulence of these strains has been determined by inoculated in BALB/c or Swiss mice. Strains with either increased spontaneous or DNA damage mediated mutation rates have the same LD50 than the wild type strain. Moreover, our work point out that the DNA damage level during mouse infection it is not enough to activate the S. typhimurium SOS response. The papers that are included in anexos I, II and III contained the main results that are the basis for this work.Anexo I: Campoy, S., A. M. Pérez de Rozas, J. Barbé e I. Badiola. 2000. Virulence and mutation rates of Salmonella typhimurium strains with increased mutagenic strength in a mouse model. FEMS Microbiol. Lett. 187:145-150Anexo II: Campoy, S., M. Jara, N. Busquets, A. M. Pérez de Rozas, I. Badiola y J. Barbé. 2002. Intracellular cyclic AMP concentration in decreased in Salmonella typhimurium fur mutants. Microbiology 148:1039-1048Anexo III: Campoy, S., M. Jara, N. Busquets, A. M. Pérez de Rozas, I. Badiola y J. Barbé. 2002. Role of the high-affinity zinc uptake znuABC system in Salmonella enterica serovar Typhimurium virulence. Infect. Immun. 70:4721-4725.

Las salmonelas no-tifoideas que causan actualmente infecciones en seres humanos son frecuentemente epidémicas y resistentes a los antimicrobianos (R), además de virulentas (V). La evolución de las bacterias en cuanto a la adquisición de determinantes-V y/o -R se debe,fundamentalmente, a la incorporación, a menudo secuencial, de piezas de ADN, cuya combinación origina nuevos elementos genéticos, que quedan inmediatamente sometidos a la selección natural en un ambiente cambiante.Los genes-V y -R pueden estar aislados, formando pequeñas agrupaciones (islotes) y/o en agrupaciones mayores (islas genómicas o de patogenicidad) y pueden ser de localización cromosómica o plasmídica. Los genes-R, una vez seleccionados, pueden mantenerse en las bacterias originarias y su descendencia o bien diseminarse entre bacterias más o menos relacionadas a través de los elementos genéticos móviles (EGMs) entre los que destacan el sistema integrón-casete génica, los transposones, los plásmidos y las islas gen.En la presente tesis se llevaron a cabo estudios de epidemiología molecular en 176 aislamientos de Salmonella enterica pertenecientes a tres serotipos no prevalentes, aunque causantes de alertas epidemiológicas: Hadar, Brandenburg y Ohio. Se determinó el impacto epidemiológico de los mismos, identificando los tipos endémicos y prevalentes en el Principado de Asturias y su posible presencia en otras áreas geográficas. Los subtipos fueron trazados mediante análisis de macrorrestricción genómica-PFGE y genotipos-R y -V. Como ejemplo tenemos que los subtipos prevalentes de Hadar se pueden considerar endémicos en España y uno de ellos causó un brote nacional asociado a la salsa de pollos asados comerciales en 2005. Los estudios de resistencia revelaron un amplio porcentaje de cepas con resistencia múltiple (RM) y una correlación entre ésta y la presencia de EGMs. En los tres serotipos se identificaron plásmidos-R, de tamaño variable (9-300 Kb) y diferentes genotipos-R, la mayoría de los cuales resultaron conjugativos. En aislamientos con RM de Brandenburg y Ohio, pero no de Hadar, se detectó un integrón de clase 1 (1600/dfrA1-aadA1), asociado a transposones de tipo Tn21 y estos, a su vez, a Tn9. En aquellos resistentes a tetraciclina se encontraron transposones de tipo Tn1721 y Tn10, portadores de los genes tet(A) y tet(B), respectivamente. Esta es la primera vez que se estudian los perfiles de genes-R en los plásmidos del serotipo Hadar y la organización de los EGMs implicados en la RM en los serotipos Brandenburg y Ohio. La determinación de los perfiles-V reveló pequeñas diferencias intra-serotipo en el caso de Hadar y Brandenburg (presencia/ausencia de sopE). Las variaciones inter-serotipo eran mayores: Hadar carecía de los genes agfA, sugR y rhuM, presentes en los otros dos serotipos, mientras que todos los aislamientos de Ohio presentaron un gen sugR delecionado y fueron negativos para sopE. Todos los aislamientos poseían las cinco islas de patogenicidad (SPI1-5) identificadas en la cepa tipo S. Typhimurium LT2.

El hierro es un oligoelemento esencial para la supervivencia celular ya que es un cofactor de muchas enzimas y forma parte de la estructura de muchas proteínas. Es por este motivo que los microorganismos necesitan mecanismos eficientes para la captación de hierro cuándo carecen del mismo. Está ampliamente descrito que la captación de hierro es uno de los pasos clave en el desarrollo de un patógeno dentro de su huésped 1. Pero, aunque el Fe es indispensable, su exceso en el citoplasma es tóxico para la célula ya que cataliza la reacción de Fenton con la consiguiente formación de radicales hidroxilo 2, 3. Por todo ello la homeóstasis del Fe2+ se encuentra estrictamente controlada. La proteína Fur (ferric uptake regulator) es el principal regulador transcripcional implicado en la respuesta celular a la concentración de hierro, controlando tanto la inducción de sistemas de captación de Fe2+ de alta afinidad, como la expresión de proteínas para el almacenamiento y enzimas que utilizan hierro 4. Normalmente Fur, asociado al ión Fe2+, se une a una secuencia concreta denominada caja Fur presente en la región promotora de los genes que regula, bloqueando de esta manera su transcripción 5. Aunque también puede activar la expresión de diferentes genes de forma directa o indirecta 1. En el presente trabajo se estudia, mediante microarrays de DNA, el papel de la proteína Fur en el patógeno intracelular S. enterica serovar Typhimurium y la relación de este regulador con los mecanismos de virulencia de dicho microorganismo. / Iron is an essential trace element for the cell since it is a cofactor for many enzymes and is a part of the structure of many proteins. It is for this reason that the microorganisms need efficient mechanisms for iron uptake when lacking it. It is widely reported that iron uptake is one of the key steps in the development of a pathogen within its host 1. Although Fe2+ is indispensable, its excess in the cytoplasm is toxic to the cell since it catalyzes the Fenton reaction leading to the formation of hydroxyl radicals 2, 3. Therefore Fe2+ homeostasis is strictly controlled. Protein Fur (ferric uptake regulator) is the major transcriptional regulator involved in the cellular response to iron concentration, by controlling the induction of Fe2+ high affinity uptake systrems and the protein expression of iron storing and utilizing enzymes 4. Normally, Fur, associated to the Fe2+ ion, binds to a specific sequence called Fur box present in the promoter region of genes the regulated genes, thus blocking its transcription 5. Fur also can activate the expression of different genes directly or indirectly 1. The role of the Fur protein in the intracellular pathogen S. enterica serovar Typhimurium and its relationship with the virulence mechanisms of this microorganism is studied in this work by DNA microarrays.