Made available in DSpace on 2015-06-17T19:34:24Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-05-05. Added 1 bitstream(s) on 2015-06-18T12:48:54Z : No. of bitstreams: 1 000831351.pdf: 626171 bytes, checksum: 6309f47645c602431c0e00917cabbe12 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A contaminação bacteriana do útero após o parto é um evento quase unânime em vacas, em que a Escherichia coli (E. coli) é o principal micro-organismo encontrado. Apesar disto, a ativação de mecanismos de defesa local e sistêmica eliminam gradualmente os contaminantes ao longo do puerpério fisiológico. Porém, algumas bactérias possuem fatores de virulência, que facilitam sua instalação e permanência no tecido hospedeiro, propiciando o desenvolvimento de infecções uterinas. Embora o mecanismo não esteja completamente elucidado, certifica-se que a presença de E. coli nos primeiros dias pós-parto favorece o crescimento de Trueperella pyogenes num período mais tardio, bactéria frequentemente associada à infecção uterina. Com isto, objetivou-se estabelecer a dinâmica e perfil da microbiota uterina relacionando os fatores de virulência das E. coli isoladas do útero das vacas, 24 horas após a parição, com a presença bacteriana no ambiente uterino na segunda semana pós-parto. O estudo foi conduzido em 75 vacas holandesas preto e branca (HPB) com parto e puerpério isento de complicações. Decorridas 24 horas do parto (Momento 1) foi realizada avaliação ginecológica através da palpação retal, observada a coloração da mucosa vaginal e aferição da temperatura retal. Destes animais foram coletadas, em condições de assepsia, amostras da secreção loquial visando-se o cultivo microbiológico, antibiograma e a citologia uterina. O período pós-parto foi monitorado quanto às intercorrências e alterações da esfera reprodutiva e produtiva. No 14º dia pósparto (Momento 2), foram realizados os mesmos procedimentos, além da ultrassonografia transretal. Amostras de sangue foram coletadas, em ambos os momentos, para a caracterização da capacidade fagocítica dos neutrófilos pelo teste do nitroblue tetrazolium (NBT) estimulado (ES) e não estimulado (NE) e realização de hemograma. Nas E. coli isoladas foram ... / Bacterial contamination of the uterus after delivery is almost an unanimous event in cows, in which the Escherichia coli (E. coli) is the main micro-organism found. Despite this, the activation of local and systemic defense mechanisms gradually eliminate contaminants throughout the physiological puerperium. However, some bacterias possess virulence factors that facilitate its installation and remain in the host tissue, leading to the development of uterine infections. Although the mechanism is not fully elucidated, it is certified that, the presence of E. coli in the first days postpartum favors the growth of Trueperella pyogenes in a later period, bacteria often associated with uterine infection. Thus, aimed to establish the dynamics and profile of uterine microbiota relating the virulence factors of E. coli isolated from the uterus of cows 24 hours after calving, with the bacterial presence in the uterine environment in the second postnatal week. The study was conducted on 75 Holstein cows with normal delivery and postpartum without complications. After 24 hours of parturition (Moment 1), gynecological evaluation was performed by rectal palpation, observed staining of the vaginal mucosa and measurement of rectal temperature. Samples of secretion loquial were collected aseptically of these animals, aiming the microbiological culture, antibiogram and uterine cytology. The postpartum period was uneventful and monitored for changes in the reproductive and productive sphere. On the 14th day postpartum (Time 2), the same procedures were were performed, apart from transrectal ultrasonography. Blood samples were collected at both moments, to characterize the phagocytic ability of neutrophils by the nitroblue tetrazolium test (NBT) stimulated (S) and unstimulated (US) and hemogram. In E. coli isolates were investigated different genes associated with virulence factors (VF) by PCR. Rapid uterine involution, characterized by diameter of the ... / FAPESP: 2011/15852-7

Made available in DSpace on 2014-11-10T11:09:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-07-25Bitstream added on 2014-11-10T11:57:43Z : No. of bitstreams: 1 000741914_20151231.pdf: 202931 bytes, checksum: b09a175d62ec19f75595646ea61ffda5 (MD5) Bitstreams deleted on 2016-01-04T10:26:18Z: 000741914_20151231.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-01-04T10:28:14Z : No. of bitstreams: 1 000741914.pdf: 1231278 bytes, checksum: 31828ab93cfccd06f552bc041efb2c26 (MD5) / A linfadenite infecciosa em suínos representa uma das afecções mais preocupantes na criação de suínos em todo mundo, causada por patógenos de origem bacteriana, geralmente diagnosticada na linha de abate. Acarreta prejuízos econômicos com a condenação total ou parcial das carcaças, bem como reflexos em saúde pública, devido ao potencial zoonótico dos agentes causais. O presente estudo investigou a ocorrência e as principais espécies do gênero Mycobacterium, assim como marcadores de virulência plasmidial em linhagens de Rhodococcus equi (R. equi) isoladas de linfonodos e das fezes de suínos de abatedouros do interior do estado de São Paulo, com e sem linfadenite. Foram examinados 150 linfonodos (50 mesentéricos, 50 mediastínicos e 50 submandibulares) com lesões, 150linfonodos (50 mesentéricos, 50 mediastínicos e 50 submandibulares) sem lesões aparentes e 150 fezes de suínos, provenientes de animais destinados ao abate, em dois frigoríficos do interior do estado de São Paulo. As amostras de linfonodos e fezes foram submetidas ao cultivo microbiológico simultaneamente nos meios de ágar acrescido de sangue bovino (5%) desfibrinado, e meios seletivos de CAZ-NB, TCP e TVP para R. equi, e Stonebrink–Lesslie e Lowenstein-Jensen para micobactérias. As colônias sugestivas de R. equi e positivas no teste de CAMP, foram enviadas ao Japão para detecção de linhagens VapA ou VapB, associadas a virulência. As linhagens sugestivas no cultivo microbiano para o gênero Mycobacterium foram submetidas a caracterização de espécies por PCR pela técnica de PRA. Foram identificados nos linfonodos de suínos com lesões 48 (32,0%) linhagens de Mycobacterium spp.e 6 (4,0%) Rhodococcus equi. Nos linfonodos de suínos sem lesões foram identificados 11 (7,3%) isolados de Mycobacterium spp.e nenhuma linhagem de R. equi. Nas fezes foram identificadas 40 (26,6%) linhagens de Rhodococcus equi e ... / The infectious lymphadenitis represents one of the most important diseases in pigs worldwide caused by bacterium, usually diagnosed on the slaughterhouses.The disease leads to economic losses due to total or partial condemnation of carcasses, as well as public health concern due to the zoonotic potential of microorganisms. The present study investigated the occurrence and the main species of the genus Mycobacterium as well as virulence markers of plasmid in Rhodococcus equi (R. equi) strains isolated from lymph nodes and feces from pigs of slaughterhouses in the state of São Paulo, with and without lymphadenitis. Were sampled 150 lymph nodes (50 mesenteric, 50 mediastinal and 50 submandibular) with lesions, 150 lymph nodes (50 mesenteric, 50 mediastinal and 50 submandibular) without visible lesions, and 150 feces from pigs of slaughterhouses of state of São Paulo, Brazil. The lymph nodes samples and feces were subjected to microbiological culture simultaneously indefibrinated bovine blood agar (5%), selective media of CAZ-NB, TCP, TVP for R. equi, and Stonebrink-Lesslie, and Lowenstein-Jensen for mycobacteria . The suggestive colonies of R. equi and positive to CAMP test were sent to Japan for evaluation of plasmid profile (VapA or VapB). The suggestive of Mycobacterium sp. were subjected to polymerase chain reaction (PCR) – based species identification using restriction enzyme pattern analysis (PRA). Among lymph nodes of pigs with lesions, 48 (32.0%) Mycobacterium spp. and 6 (4.0%) R. equi strains were identified. In the lymph nodes of pigs without lesions were identified 11 (7.3%) Mycobacterium spp. and none R. equi strain. From the fecal samples, 40 (26.6%) R. equi and 2 (1.3%) Mycobacterium spp. isolates were identified. From 48 Mycobcterium isolates from pigs with lesions, 37 (77.0%) were identified by PRA as M. avium type 1, and 11 (23.0%) M. avium type 2. Among limph nodes with lesions wer ...

Made available in DSpace on 2015-03-03T11:52:26Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-07-18Bitstream added on 2015-03-03T12:07:12Z : No. of bitstreams: 1 000811933_20151218.pdf: 96939 bytes, checksum: 04a99a8168a4d1d45d4874efe4f2b497 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-12-18T13:57:58Z: 000811933_20151218.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-12-18T13:58:36Z : No. of bitstreams: 1 000811933.pdf: 896821 bytes, checksum: d95843628c2f7f0cc36797c46e5efaf7 (MD5) / Bacillus thuringiensis é uma bactéria que pode conferir patogenicidade a uma ampla variedade de insetos, e que possui fatores associados à mortalidade de insetos por B. thuringiensis, que foram identificados e são utilizados no controle de insetos-praga como, por exemplo, as toxinas Cry, Vip e Cyt. Novos genes de B. thuringiensis que possam estar envolvidos no processo de patogenicidade a insetos têm sido identificados, entre estes, as quitinases. Enzimas capazes de hidrolisar as ligações glicosídicas entre as unidades de N-acetil-glicosamina da quitina, e aparecem como uma interessante opção por também mostrarem potencial para serem utilizadas no controle de pragas. No presente trabalho, realizou-se o isolamento e a caracterização de um gene de quitinase do isolado de B. thuringiensis I_555 (chi_I555) e a produção e caracterização parcial da quitinase (Chi_I555). A análise de chi_I555 indicou uma fase de leitura aberta de 2025 pares de bases que codificam uma proteína com 674 aminoácidos e peso molecular de 74,24 kDa. Análises bioinformáticas indicaram a presença de um sítio ativo de quitinase, de um domínio de fribronectina e de um domínio ligante de quitina na proteína Chi_I555. A expressão heteróloga de Chi_I555 resultou na produção de uma quitinase ativa sobre o substrato “Chitin Azure” em uma faixa ótima de pH próxima do neutro. A proteína Chi_I555 utilizada neste estudo é altamente promissora para o uso em construções de plantas geneticamente modificadas / Bacillus thuringiensis is a bacterium that can confer pathogenicity to a wide variety of insects, and has associated with mortality of insects by B. thuringiensis factors that have been identified and are used to control insect pests such as the Cry toxins, Vip and Cyt. New genes of B. thuringiensis that may be involved in the pathogenic process of insects have been identified among these chitinases. Enzymes capable of hydrolyzing glycosidic linkages between the units of N-acetyl-glucosamine from chitin, and appear as an interesting option to also show potential for use in pest control. In this study, we carried out the isolation and characterization of a chitinase gene from B. thuringiensis isolate I_555 (chi_I555) and the production and partial characterization of a chitinase (Chi_I555). Chi_I555 analysis indicated an open reading frame of 2025 base pairs encoding a protein of 674 amino acids and a molecular weight of 74.24 kDa. Bioinformatics analysis indicated the presence of an active site of chitinase, a fribronectin domain and a chitin binding domain of the protein Chi_I555. Heterologous expression of Chi_I555 resulted in the production of an active chitinase on the substrate Chitin Azure in a great range of pH close to neutral. The Chi_I555 protein used in this study is highly promising for use in construction of genetically modified plants

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:24Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012Bitstream added on 2014-06-13T18:56:08Z : No. of bitstreams: 1 duarte_apm_me_rcla.pdf: 783195 bytes, checksum: d3e24a85147657efd91a10c06fd66846 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / As formigas da tribo Attini são conhecidas como “cultivadoras de fungos” devido à complexa simbiose que mantém com um fungo basidiomiceto, cultivado como alimento. Além do fungo mutualista, cresce continuamente a lista de micro-organismos encontrados nos ninhos e na cutícula desses insetos. Recentemente, leveduras negras, relacionadas ao gênero Phialophora, foram consideradas componentes da simbiose formiga-fungo por comprometerem a habilidade das formigas em lidar com o micoparasita Escovopsis. Os fungos melanizados estão frequentemente relacionados a infecções humanas e, por isso, tem sido questionada a possibilidade desses insetos atuarem como vetores de dispersão de fungos negros patógenos no ambiente urbano. Esta dissertação marca o início de um esforço no qual procuramos investigar a diversidade de fungos negros presentes na cutícula de formigas cortadeiras, bem como verificar o grau de virulência das estirpes obtidas. Este último aspecto, ou seja, a possibilidade das formigas cortadeiras abrigarem e dispersarem micro-organismos patogênicos pode ser o início de um novo ramo de investigação. Analisando fêmeas aladas (içás) de Atta capiguara e A. laevigata, coletadas antes do início do voo nupcial, verificou-se que elas abrigam em suas cutículas uma comunidade diversa de fungos negros, como os gêneros Cladophialophora, Cladosporium, Cochliobolus, Exophiala, Ochroconis, Phaeococcomyces, Phialophora, Penidiella e Pyrenochaeta. Num segundo estudo, os resultados indicaram que leveduras negras do gênero Exophiala, presentes na cutícula de içás e em ambientes contaminados por derivados de petróleo, apresentam características que as tornam potenciais oportunistas humanos, como consistente crescimento a 40°C e produção de lacases. Espera-se que os resultados deste trabalho... / Attini ants are known as basidiomycete fungus cultivated as a food source. Besides the mutualistic fungus, there is a continuous growth in the list of microorganisms found in nests and cuticles of these insects. Phialophora-related black yeasts have recently been considered as components of the antfungus symbiosis by compromising the ability of ants to deal with the mycoparasite Escovopsis. Melanized fungi are frequently related to human infections and, therefore, the ability of these insects act as vectors for dispersal of pathogenic black fungi in the urban environment has been questioned. This dissertation makes a start at assessing the diversity of black fungi derived from the cuticle of leaf-cutting ants, as well as verifying the virulence degree of the strains obtained. The latter, i.e., the possibility of ants sheltering and dispersing pathogenic microorganisms can be the start of a new research field. Our microbial profile of Atta capiguara and A. laevigata winged females, collected prior to the mating flight, revealed that the cuticle of ants can harbor a diverse community of black fungi, such as the melanized genera Cladophialophora, Cladosporium, Cochliobolus, Exophiala, Ochroconis, Phaeococcomyces, Phialophora, Penidiella and Pyrenochaeta. Moreover, we demonstrated that Exophiala species, associated with gynes’ cuticle and hydrocarbon-polluted environments, have characteristics that make them potential human opportunists, like consistent growth at 40°C and laccase production. Our results will certainly serve as a basis for more detailed future studies to explore how these fungi reach the interior of the nest, how they survive... (Complete abstract click electronic access below)

Orientadora : Profª. Drª. Ida Chapaval Pimentel / Coorientador : Profª. Drª. Patricia R. Dalzoto e Profª. Drª. Laura Lúcia Cogo / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciencias Biológicas (Microbiologia, Parasitologia e Patologia Básica). Defesa: Curitiba, 31/03/2016 / Inclui referências : f. 26-29;43-46;63-67;85-88 / Área de concentração / Resumo: Queijos e salames são alimentos prontos para consumo e artesanalmente produzidos são mais susceptíveis à contaminação microbiana. Poucos estudos tem verificado a qualidade desses alimentos provenientes de diferentes regiões do Brasil. Um dos parâmetros usados para avaliar a qualidade microbiológica de produtos de origem animal é a quantificação de Escherichia coli, Staphylococcus coagulase positiva, e pesquisa de Salmonella spp. e Listeria monocytogenes. A presença destes, além do risco de uma infecção ou intoxicação alimentar, indica contaminação e com isto, possibilidade de outras doenças com transmissão oral-fecal. Da mesma forma, a resistência a antimicrobianos com capacidade de aderência e formação de biofilme encontradas em cepas isoladas de alimentos, é preocupante do ponto de vista epidemiológico, pois indica disseminação de cepas resistentes. Neste contexto, o objetivo do presente trabalho foi avaliar a qualidade microbiológica de 32 amostras de queijos e 13 de salames artesanais, adquiridos comercialmente, em casas de produtos artesanais ou feiras de produtores nas regiões metropolitana de dez capitais brasileiras. Análises microbiológicas com respectivas contagens de indicadores de contaminação microbiana, Escherichia coli e Staphylococcus coagulase positiva, bem como pesquisa dos patógenos Listeria monocytogenes e Salmonella spp. foram realizadas através de métodos bacteriológicos. Além de pesquisar genes de virulência, diarreiogênicos ou codificadores de enterotoxina estafilocócica, avaliou-se o perfil de susceptibilidade a antimicrobianos comumente utilizados na clínica humana, capacidade de formação de biofilme e aderência a células HeLa em E. coli e Staphylococcus coagulase positiva. Nas amostras de queijos analisadas foram observadas E. coli em 50,0%, Staphylococcus coagulase positiva em 34,4% e Salmonella spp. em 6,3%. Nas amostras de salames foram observadas Staphylococcus coagulase positiva em 23,1% e Salmonella spp. em 7,7%. Nenhuma das amostras apresentou genes codificadores de E. coli diarreiogênicas. A pesquisa dos genes codificadores de enterotoxinas demonstrou a presença de genes seg, sei, sen e seu. Quanto ao perfil de susceptibilidade a antimicrobianos, 28,9% das amostras apresentaram isolados resistentes a antimicrobianos. Resistência a duas ou mais classes de antimicrobianos foram observados em 20,0% das amostras. Todos os isolados apresentaram capacidade de formação de biofilme, e 26,7% das amostras apresentaram capacidade de aderência em células HeLa. De acordo com as regulamentações da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), cerca de 51% das amostras de alimentos artesanalmente produzidas na Região Metropolitana de dez capitais brasileiras estavam impróprias para consumo, concluindo-se a importância de um monitoramento próximo e efetivo para prevenir surtos de origem alimentar. Apesar de não terem sido isoladas E. coli diarreiogênicas, a presença de Staphylococcus coagulase positiva enterotoxigênicas, isolados resistentes a antimicrobianos, capazes de formarem biofilmes e aderirem em células teciduais podem representar um potencial risco à saúde de seus consumidores. Palavras chave: resistência antimicrobiana; intoxicação alimentar estafilocócica; genes de virulência; Listeria monocytogenes, Salmonella spp., qualidade microbiológica. / Abstract: Cheeses and fermented sausages are ready-to-eat foods, and the artisanal production process of these foods is susceptible to microbial contamination. Few studies have examined the quality of these foods from different Brazilian regions. One of the parameters used to evaluate the microbiological quality of animal origin products is the quantification of Escherichia coli, coagulase-positive staphylococci and the presence of Salmonella spp. and Listeria monocytogenes. The presence of them, besides the risk of food poisoning or an infection indicates contamination and thus, the possibility of other diseases with fecal-oral transmission. Similarly, resistance to antimicrobials with adhesion and biofilm formation found in isolated strains of foods worrisome from the epidemiological point, it indicates spread of resistant strains. In this context, the aim of this study was to evaluate the microbiological quality of 32 cheese samples and 13 fermented sausages purchased commercially from artisanal food houses or fair producers from the metropolitan area of ten Brazilian capitals. Microbiological analysis were conducted to determine the counts of microbial contamination indicators, including E. coli and coagulase-positive staphylococci, and evaluate the presence of pathogens like Listeria monocytogenes and Salmonella using bacteriological methods. In addition to searching virulence genes, diarrheagenic or staphylococcal enterotoxin encoders evaluated the susceptibility profile to antimicrobials commonly used in human clinical, biofilm-forming ability and adherence to HeLa cells in E. coli and coagulase-positive staphylococci. E. coli was detected in 50.0% of samples, coagulase-positive staphylococci in 34.4%, and Salmonella spp. in 6.3%. In fermented sausage samples, we detected coagulase-positive staphylococci in 23.1% of samples and Salmonella spp. in 7.7%. None of the samples showed genes encoding diarrheagenic E. coli. The research of the genes encoding enterotoxins showed the presence of seg, sei, sen and seu genes. As for the susceptibility profile to antimicrobials, 28.9% of the samples had isolates resistant to antimicrobials. Resistance to two or more classes of antimicrobials were observed in 20.0% of samples. All isolates have biofilm formation capacity, and 26.7% of the samples adherence capacity in HeLa cells. According to Brazilian Health Regulatory Laws (ANVISA), about 51% of the artisanal food samples from the metropolitan areas of 10 capital cities were improper for consumption, indicating the importance of close monitoring of these foods and effective measures for preventing foodborne outbreaks. Although they have not been isolated E. coli diarrheagenic, the presence of enterotoxigenic coagulase-positive staphylococci isolates resistant to antimicrobials, capable of forming biofilms and adhere to tissue cells may represent a potential risk to the health of its consumers. Keywords: Antimicrobial resistance, food poisoning, virulence genes, Listeria monocytogenes, Salmonella spp., microbiological quality

Made available in DSpace on 2016-07-01T13:10:29Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-09-11. Added 1 bitstream(s) on 2016-07-01T13:14:12Z : No. of bitstreams: 1 000866878.pdf: 819016 bytes, checksum: f4b074f87450614f386b1be1ec42f77b (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A carne bovina pode ser um importante veículo de vários patógenos para os humanos, com destaque à Escherichia coli produtora de Shiga-toxina (STEC), associada com diarreia em animais e humanos. Neste estudo, investigou-se em bovinos abatidos no estado de São Paulo, a prevalência dos diferentes patótipos de E. coli diarreiogênica e o perfil de virulência dos isolados de STEC. De um total de 431 animais, STEC foi identificada em 116 (26,9%) amostras de fezes, das quais 111 (25,8%) STEC eae- e 5 (1,2%) STEC eae+. O patótipo EPEC foi detectado em 20 (4,6%) amostras de fezes dos animais testados. Os demais patótipos de E. coli diarreiogênica não foram identificados. Dos 95 isolados de STEC analisados quanto ao perfil de virulência, todos albergavam stx2, enquanto que 28 (29,5%) continham stx1. Os genes iha e saa, que codificam adesinas, foram encontrados em 93,7% (89/95) e 66,3% (63/95), respectivamente. O gene espP, que codifica uma protease que auxilia na colonização intestinal, foi detectado em 61,1% (58/95) e a hemolisina ehxA em 54,7% (52/95). Também foram identificados em menores frequências os genes subAB, nleE e nleB. STEC está amplamente disseminada nos rebanhos bovinos de São Paulo, carreando genes comumente isolados de patógenos humanos, o que reforça a importância da inspeção e fiscalização nos abatedouros / Beef can be an important vehicle for various pathogens to humans, especially Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC), associated to human and animal diarrhea. In this study, the prevalence of different pathotypes of diarrheagenic E. coli, and virulence profiles of STEC were investigated among feces of cattle slaughtered in São Paulo state, southeast of Brazil. From a total of 431 animals, STEC was identified from 116 (26,9%) samples, being 111 (25,8%) STEC eae- and 5 (1,1%) STEC eae+. EPEC pathotype was detected among 20 (4,6%) of animals. The other pathotypes of diarrheagenic E. coli were not identified. Of the 95 STEC isolates assessed for virulence profile, all harbored stx2, while 28 (29,5%) contained stx1. Iha and saa, genes encoding adhesins, were found at 93,7% (89/95) and 66,3% (63/95), respectively. EspP, gene which encoding a protease related with intestinal colonization, was detected in 61,1% (58/95) and ehxA hemolysin was present in 54,7% (52/95). SubAB, nleE and nleB genes were also detected in lower rates. STEC is widespread in cattle herds of São Paulo, containing commonly isolated genes from human pathogens, which reinforces the importance of inspection and surveillance in the slaughterhouses

Made available in DSpace on 2016-09-27T13:40:04Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-07-31. Added 1 bitstream(s) on 2016-09-27T13:45:14Z : No. of bitstreams: 1 000868835.pdf: 1467491 bytes, checksum: 8ee2f2f1a6a55757ee87dffc67df02b2 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / A paracoccidioidomicose, uma das mais importantes micoses sistêmicas da América Latina, é causada pelas espécies crípticas Paracoccidioides brasiliensis e P. lutzii. Ainda não é claro como o processo de especiação dentro do gênero Paracoccidioides influi em aspectos como virulência e patogenia da doença. O objetivo deste trabalho é caracterizar algumas dessas diferenças entre as duas espécies crípticas, utilizando-se de modelo experimental alternativo, as larvas da traça de cera Galleria mellonella. Este modelo tem sido utilizado em estudos envolvendo outros patógenos, porém ainda é pouco explorado em Paracoccidioides spp. No presente estudo, G. mellonella refletiu diferenças entre a virulência de cargas fúngicas distintas, bem como dentre isolados variados e destes com os grupos controle. Além disso, foi possível a recuperação do patógeno a partir de larvas experimentalmente infectadas. Isolados P. lutzii apresentaram níveis de virulência variáveis, sendo pertencentes a esta espécie os isolados com maior e menor virulência observadas neste estudo (8334 e Pb01, respectivamente). Já os isolados pertencentes a espécie P. brasiliensis (Pb339, Pb192 e T15LN1) apresentaram taxas de mortalidade mais homogêneas e intermediárias. Tais resultados credenciam as larvas de G. mellonella como modelo de experimentação adequado para o estudo do processo de virulência em Paracoccidioides spp. Ainda, foi realizado knockdown do gene codificador da gp43 (PbGP43), o antígeno imunodominante em P. brasiliensis e do seu homólogo em P. lutzii (PlP43) utilizando-se a estratégia de RNA antisense combinada com transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens. Foram obtidos três transformantes P. brasiliensis com expressão de PbGP43 de cerca de 8%, 14% e 36% quando comparados com a expressão do isolado selvagem original Pb192. Além disso foram obtidos dois transformante P. lutzii com expressão de PlP43 por volta de 23% e... / Paracoccidioidomycosis (PCM), an important systemic mycosis in Latin America, is caused by the cryptic species Paracoccidioides brasiliensis and P. lutzii. How these species differ in their virulence factors is still unknown and needs to be properly evaluated. While the role of PbGP43, which codes gp43, as a virulence factor is relatively well established for P. brasiliensis, the same is not true for its ortholog in P. lutzii, namely PlP43. PbGP43 and PlP43 present differences in their nucleotide sequences, expression levels, epitope occurrence and influences on PCM diagnosis. Herein, we obtained PbGP43 and PlP43 knockdown strains by antisense RNA technology combined with ATMT, in order to comparatively evaluate their effects on virulence, employing the alternative experimental host Galleria mellonella larvae. Our results suggest that p43 is important in the P. lutzii infectious process, as previously demonstrated by gp43 in P. brasiliensis. We confirmed G. mellonella as a useful model for studying P. brasiliensis and P. lutzii virulence, since it reflects variation between inoculum size and different strains, as well as between wild-type and respective knockdown transformant strains. Virulence levels may vary among isolates of the same species, probably reflecting that the physiological condition is more important than the species effect. Re-isolation of Paracoccidioides from experimentally infected G. mellonella larvae is possible and might be useful for epigenetic studies related to infection / CNPq: 143371/2011-8

Orientador : Lucila Costallat Ricci / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-28T21:12:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_YliriaFerreirada_M.pdf: 8250034 bytes, checksum: 4153a375169220d327ec671517b9ecc7 (MD5) Previous issue date: 2001 / Resumo: Cepas de Escherichia coZi podem apresentar mecanismos e fatores de virulência diversos podendo causar no homem, principalmente, infecções intestinais. Desta forma, tendo-se como base os dados clínicos, expressão de mecanismos e de fatores de virulência, dados epidemiológicos, sorotipagem e análises moleculares, dentre outros, as cepas de E. coZi diarreiogênicas humanas podem ser classificadas em pelo menos sete grupos de enteropatogenicidade. Com relação ao grupo diarreiogênico representado pela E. coZi enterotoxigênica (ETEC), a identificação destes patógenos incluem a pesquisa das enterotoxinas STa e/ou LT e a expressão de fatores de colonização (FC). Estes últimos, também denominados de adesinas, permitem a colonização da bactéria à mucosa do intestino delgado, podendo variar morfológica e antigenicamente. Vários FC já foram identificados e caracterizados em cepas ETEC isoladas de diferentes regiões geográficas. Em trabalhos anteriores, a runbria PCF02 foi identificada, caracterizada e purificada a partir de 2 cepas ETEC LT+ pertencentes ao sorogrupo 02, isoladas no nosso meio. Na seqüência dos trabalhos, a partir da fimbria purificada, 9 hibridomas secretores de anticorpos monoclonais reativos com PCF02 foram obtidos, seus isotipos determinados e soluções ascíticas dos mesmos preparadas e tituladas em provas de Western blotting e ELISA. Após a padronização da prova de Inibição do ELISA, desenvolvida com MAbs dos isotipos IgA (4) e IgG2b (5) e pools dos mesmos, mais 5 amostras diarreiogênicas de E. coZi foram identificadas como sendo PCFO2+. Possível homologia (analogia) de epítopos com CFAIII foi verificada com estes MAbs, através de observações em imunomicroscopia. Neste trabalho, dando continuidade aos estudos relacionados ao PCFO2, procurou-se inicialmente reavaliar-se a metodologia de purificação e comprovar-se a Prova de Inibição do ELISA padronizada para a identificação desta fimbria, além de verificar-se possíveis homologias de epítopos entre PCF02 e outros FC, descritos como os mais freqüentemente identificados em cepas ETEC isoladas de fezes humanas. Com base nos resultados obtidos, comprovou-se que MAbs do isotipo IgA reconhecem epítopos distintos dos MAbs IgG2b, uma vez que estes últimos são capazes de reagirem com uma segunda subunidade de 15 kDa de PCF02, em provas de Westem blotting. Esta nova subunidade desta fímbria talvez deva corresponder ao "tip" da mesma. Pelos experimentos desenvolvidos verificou-se que apenas as amostras 312-2 e 312-3, dentre as cinco cepas identificadas inicialmente como PCF02+, expressavam realmente esta fímbria apresentando, também, a fração de 15kDa. Quanto às amostras D242 e D243, estas demonstraram pertencer ao complexo CF AIIV expressando CS5 e CS6 sendo que esta última subunidade apresenta epítopos idênticos aos expressos em PCF02. Quanto às amostras pertencentes ao sorogrupo 02, nenhuma reação inespecífica foi verificada. Portanto, a Prova de Inibição do ELISA desenvolvida com MAbs do isotipo IgG2b demonstrou ser adequada não só para a identificação das duas subunidades de PCF02 expressas em cepas ETEC, como também de amostras ETEC do complexo CF AIIV, que sempre expressam a subunidade CS6 / Abstract: Some strains of Escherichia coZi may expresses differents mechanisms and virulences factors representing one of several highly adapted clones wich together have evolved the ability to cause a broad spectrum of human and animal diseases. With respect to enteric diarrheal diseases caused by E. coZi strains, seven categories of diarrheagenic E. coZi isolated from human stool cultures have been classified, based on clinical observations, mechanisms, virulence factors, epidemiologic studies, serotypes and molecular analysis. The group represented by enterotoxigenic E. coZi (ETEC) is identified by ST and or L T enterotoxins production and expression of colonization factors (CF). These adhesins allow bacteria colonization on the surface of the small bowel mucosa. Detection of CF in alI ETEC strains identified in the differents geographic regions of the world is impractical because of their great number and heterogeneity. Previous studies, a new putative colonization factor (PCF) was characterized in isolates of ETEC from human diarrheical stools at Ouro Preto (MG) Brazil, expressing just L T and belonging to sorogroup 02. This fimbriae was named PCF02, and with this purified antigen nine hybridomas secreting MAbs (monoclonal antibodies) against PCF02 were produced. For standardization of Inhibition ELISA Test to identify PCF02 in enterotoxigenics strains pools of these MAbs, belonging to isotypes 19A (4) and IgG2b (5), were tested using this immune reaction. After testes new five ETEC strains presented positive results to PCF02, alI belonging to serogroup 02. The aim of this study included improvement of the purification methods of this fimbriae and evidences confirming sensibility and specificity of Inhibition ELISA Test in PCF02 identification. The objectives propossed also included study of possible epitopes similarity between this fimbriae and the most frequently CF reported in epidemiological studies. Ours results confumed that Mabs belonging to 19A and IgG2b isotypes reacted with differents epitopes of PCFO2. With respect to IgG2b a new subunit or adhesin presenting about 15 kDa was identified in Westem blotting reactions in semi-purified proteic extraction of PCFO2 strain. Regarding to Inhibition ELISA Test developed with MAbs belonging to both isotypes datas confirmed expression of PCFO2 just by 312-2 and 312-3 isolates. Antigenic similarities was demonstrated between CS6 belonging to CF AIIV complex and PCFO2. Results demonstrated that D242 and D243 expresse CS5 and CS6. We conclude that the Inhibition ELISA Test developed with MAbs of isotype IgG2b were able to identify not just ETEC strains expressing PCFO2 but also expressing CS6, representing an important tool for the identification of these adhesins / Mestrado / Microbiologia / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Orientadores: Cinthia Pereira Machado Tabchoury, Renata de Oliveira Mattos-Graner / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-15T04:03:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Arthur_RodrigoAlex_D.pdf: 8956677 bytes, checksum: 3655b08eae9bcd1faa50719332f91c0e (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Os estreptococos do grupo mutans, em especial Streptococcus mutans, são considerados como um dos principais microrganismos relacionados à doença cárie dental. Clinicamente, esses microrganismos estão presentes na cavidade bucal na forma de diferentes genótipos, que podem apresentar diferentes características fenotípicas. Nesse sentido, foi avaliada diversidade genotípica de S. mutans em biofilme dental formado in vivo ou in situ durante 3 dias sob condições controladas de exposição à sacarose, o mais cariogênico dos carboidratos, e os seus monossacarídeos constituintes (glicose e frutose). Diferentes genótipos de S. mutans foram encontrados nessas distintas condições, entretanto, não foi observada seleção de genótipos nos biofilmes dentais formados. Além disso, as características fenotípicas de virulência desses genótipos não foram avaliadas. Sendo assim, seria importante avaliar nesses genótipos previamente isolados de biofilme dental formado in vivo e in situ, na presença ou ausência de sacarose, as características fenotípicas de cariogenicidade relacionadas à aciduricidade e à acidogenicidade, visando investigar a relação entre um alto desafio cariogênico (exposição frequente à sacarose e acúmulo de biofilme) e a virulência de S. mutans. Tanto naqueles genótipos previamente isolados de biofilme dental formado in vivo, quanto naqueles isolados de biofilme dental formado in situ, a aciduricidade foi avaliada em relação à análise da viabilidade celular em condições ácidas e em relação à atividade da bomba F-ATPase, e a acidogenicidade foi avaliada em relação à análise da curva de queda de pH devido metabolização de glicose. Além disso, oito genótipos previamente isolados do biofilme dental formado in situ durante 3 dias foram submetidos a um crescimento na forma de biofilme in vitro, condição na qual foram avaliadas a acidogenicidade, a habilidade do genótipos em sintetizar polissacarídeos extracelulares e o potencial desses genótipos para desmineralizar o esmalte dental. Em relação aos genótipos isolados de biofilme dental formado in vivo, aqueles isolados de biofilme formado na presença de sacarose foram mais ácido-tolerantes, tanto em pH 5,0 ou 2,8, e mais acidogênicos, uma vez que apresentaram menores valores de pH final durante a análise da curva de queda de pH e também maior velocidade na produção de ácidos nos primeiros 15 minutos de metabolização da glicose, que aqueles encontrados em biofilme formado na sua ausência de sacarose. Além disso, não foram encontradas diferenças expressivas na atividade da bomba F-ATPase entre essas duas condições distintas. Comportamento semelhante também foi observado para genótipos previamente isolados de biofilme dental formado in situ, com maior aciduricidade e acidogenicidade para aqueles genótipos isolados de biofilme formado na presença de sacarose. No modelo de biofilme in vitro não foram encontradas diferenças nem na acidogenicidade nem na habilidade dos genótipos de produzirem polissacarídeos extracelulares. Entretanto, os genótipos apresentaram potenciais cariogênicos distintos, não havendo relação entre o potencial cariogênico desses genótipos e a condição na qual esses genótipos foram isolados (presença ou ausência de um alto desafio cariogênico). Os resultados sugerem que as freqüentes quedas de pH decorrentes da exposição à sacarose parecem tornar os genótipos mais de S. mutans mais virulentos. Além disso, genótipos distintos de S. mutans podem apresentar diferentes potenciais cariogênicos. / Abstract: Mutans streptococci, mainly Streptococcus mutans, are considered as the main microorganisms related to dental caries. These microorganisms are present in oral cavity as distinct genotypes, which may show distinct phenotypic traits. In this context, it was evaluated the S. mutans genotypic diversity in dental biofilm formed in vivo and in situ during 3 days under controlled exposure to sucrose, the most carigenic carbohydrate, and its monosaccharides constituents (glucose and fructose). Distinct S. mutans genotypes were found under these before mentioned conditions, but no selection of them was found in dental biofilms formed. Moreover, the virulence phenotypic traits of these genotypes were not evaluated. Thus, it would be important to evaluate in these genotypes previously isolated from dental biofilm formed in vivo and in situ in the presence or absence of sucrose, the phenotypic traits of cariogenicity related to aciduricity and acidogenicity in order to investigate the relationship between a high cariogenic challenge (frequent exposure to sucrose and biofilm accumulation) and their virulence. Either in those genotypes isolated from in vivo dental biofilms, or in those isolated from in situ dental biofilms, the acidogenicity trait was evaluated through counts of viable cells in acid conditions and F-ATPase activity, and the acidogenicity trait was evaluated through the ability to lower the pH due to glycolysis. Besides, eight genotypes previously isolated from in situ dental biofilms formed during three days were grown as in vitro biofilms, and these genotypes were evaluated regarding their acidogenicity, cariogenic potential and ability to synthesize extracellular polysaccharides. In relation to genotypes isolated from in vivo biofilms, those isolated from biofilms formed in the presence of sucrose were more acid-tolerant, either at pH 5.0 or at pH 2.8, and more acidogenic, since they showed lower values of final pH during the evaluation of the curve of pH fall and also higher ability to produce acids in the first 15 minutes of glucose fermentation, than genotypes isolated from in vivo biofilms formed in the absence of sucrose. Besides, no expressive differences regarding F-ATPase activity between these two distinct conditions were found. Genotypes found only in the presence of sucrose were more acidogenic than those found only in the absence of this carbohydrate. Similar data were found for genotypes isolated from in situ dental biofilms formed in the presence of sucrose, which were more aciduric and more acidogenic than genotypes isolated from biofilms formed in the absence of this carbohydrate. In in vitro biofilm model, no differences either in the acidogenicity or in the ability of genotypes to synthesize extracellular polyssacharide were found. However, the S. mutans genotypes showed distinct cariogenic potential, independent of the fact that these genotypes had been isolated in the presence or absence of a high cariogenic challenge. The results suggest that frequent pH fall due to sucrose exposure may select more virulent S. mutans genotypes. Besides, distinct S. mutans genotypes may show distinct cariogenic potential. / Doutorado / Cariologia / Doutor em Odontologia

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Salmonella spp., es un agente bacteriano patógeno responsable de una gran variedad de cuadros clínicos en animales y humanos, incluyendo cuadros de tipo gastroentéricos e invasivos, a través de diversas rutas de transmisión, ya sea en mamíferos, aves, peces, anfibios, insectos y reptiles. En el caso de los reptiles, son una de las especies exóticas común de encontrar como animal de compañía, ganando cada vez más popularidad a pesar de ser reconocidos como reservorio de Salmonella. Junto con esto se ha observado un mayor número de casos de salmonelosis humana asociada a estos animales. En reptiles, la especie de Salmonella principalmente asociada es S. bongori, junto con las subespecies arizonae, houtanae, salamae y enterica de la especie S. enterica. Los principales reptiles relacionados a casos de salmonelosis en humanos son los Ophidios (serpientes), Saurios (lagartos), Quelonios (tortugas) y Rhynchocephalios (iguanas), animales que son comúnmente mantenidos como mascotas. La salmonelosis humana asociada a reptiles se manifiesta con diferentes cuadros, pudiendo ser exclusivamente gastrointestinal o presentándose con cuadros invasivos. Algunos autores han asociado el tipo de manifestación clínica con la exposición a distintos tipos de reptiles, aunque no se han investigado los factores de virulencia presentes en dichas cepas. En Salmonella, actualmente se reconoce la existencia de una organización de genes de virulencia en sectores cromosomales, denominados islas de patogenicidad (IP), donde se asocian varios factores que dan cuenta de la enfermedad gastrointestinal (IP-1) o invasiva (IP-2). Es por esto, que la identificación de los factores de virulencia en Salmonella spp. es importante para la caracterización del agente, más aún, frente al hecho de que en Chile existen reptiles que portan esta bacteria y que no han sido caracterizados más allá de su perfil fenotípico de resistencia antimicrobiana. En este estudio, se determinará la presencia de algunos genes de virulencia asociados a la invasión de enterocitos, en cepas de Salmonella aisladas de reptiles mantenidos en cautiverio en la Región Metropolitana de Chile. / Salmonella spp., is a pathogenic bacterial agent that –through different routes of transmission- causes a variety of gastroenteric and invasive manifestations. Although transmission by means of contaminates food is the most frequent route, transmission by direct or indirect contact with animals is now a reality. Reptiles, an exotic species increasing in popularity, represent an example of the above mentioned. It is common to find these animals as pets despite having been recognized as reservoirs for Salmonella. This tendency continuous to grow, bringing with it a greater number of human salmonellosis associated with the reptile, confirming at least four cases in minors in Chile, from 2012 to 2015. Taking into consideration the above, the objective of this thesis was to detect six virulence genes associated with invasion in strains located on the pathogenic islands one and five in Salmonella spp., isolated from reptile kept in captivity in the Metropolitan Region of Chile. To achieve this objective, a strain collection of thirty-four strains of Salmonella spp., was used. The genes invA and hilA were detected in 100% of the strains, while the orgA, sopE, sopB and sipB were detected in 47%, 23%, 85% and 97% of the strains accordingly; yhese being similar results to those observed in Salmonella strains isolated from birds, eggs, pigs, environmental samples and human and food samples, among others. The low percentage of strains that presented the orgA gene is noteworthy, a situation that could be explained by considering that Salmonella is limited to intraluminal intestinal infection in reptiles. In this study it was possible to conclude that, due to the presence of some genes that encode virulence factors associated with trans epithelial migration, these strains could represent a potential risk for the community. Keywords: Salmonella, reptile, virulence, pathogenicity islands.