京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(農学) / 甲第21808号 / 農博第2321号 / 新制||農||1066(附属図書館) / 学位論文||H31||N5180(農学部図書室) / 京都大学大学院農学研究科応用生命科学専攻 / (主査)教授 植田 充美, 教授 渡邊 隆司, 教授 栗原 達夫 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Agricultural Science / Kyoto University / DFAM

No description available.

Clostridium cellulolyticum est une bactérie anaérobie stricte et cellulolytique qui produit des complexes multienzymatiques (cellulosomes) très performants pour la dégradation des polysaccharides de la paroi végétale. C. cellulolyticum adhère à la cellulose et ce phénomène intervient dès les premiers stades de croissance. Pour de nombreuses bactéries cellulolytiques, les cellulosomes semblent impliqués dans le processus d'adhérence et alors que les mécanismes moléculaires mis en jeu pour l'adhérence à la cellulose sont connus ou proposés, celui ou ceux de C. cellulolyticum sont inconnus.Mon projet de thèse a consisté à étudier l'adhérence et la colonisation des fibres de cellulose par C. cellulolyticum et d'identifier le ou les facteurs moléculaires impliqués dans l'adhérence. J'ai ainsi mis en œuvre deux stratégies distinctes. D'une part, une approche par mutagénèse aléatoire qui a permis d'isoler deux clones à l'adhérence diminuée et d'autre part, une approche par mutagénèse ciblée visant à inactiver des gènes candidats, susceptibles d'intervenir dans l'adhérence.J'ai aussi étudié la colonisation des fibres de cellulose par C. cellulolyticum et observé que les cellules adhèrent avec une haute spécificité et affinité à la cellulose. La colonisation des fibres se ferait en mono-couche cellulaire et par successions d'événements d'adhésion-relarguage-réadhésion. Un mutant d'inactivation de CipC, la protéine d'échafaudage des cellulosomes, a mis en évidence l'implication de cette protéine dans l'adhérence, mais aussi que l'adhérence à la cellulose pourrait être multifactorielle. Enfin, j'ai étudié le rôle de HycP, une protéine à CBM3 dont la fonction est inconnue. / Clostridium cellulolyticum is a strict anaerobe, cellulolytic bacteria. It produces multienzymatic complexes, called cellulosomes, which are able to efficiently degrade the plant cell wall polysaccharides. Cellulolytic bacteria, including C. cellulolyticum do binds to cellulose since early growth stage. For most of the studied cellulolytic bacteria, adherence to cellulose seems to be mediated by their cellulosomes. However, molecular factors involved in C. cellulolyticum adherence to cellulose remain unknown.My Ph.D. aimed to implement different but complementary strategies to study adhesion and colonization of cellulose fibers by C. cellulolyticum and to identify the molecular mechanism(s) by which the bacteria bind to cellulose. In order to identify some proteins encoding genes involved in adhesion, I firstly developed random mutagenesis and isolated two adhesion deficient mutants. I also used a targeted mutagenesis tool to inactivate some candidate genes.My studies highlight C. cellulolyticum adheres with both high specificity and affinity to cellulose. Colonization of cellulose fibers by C. cellulolyticum forms a mono-layer of segregated cells on cellulose surface and may occur through cycles of adhesion-release-re-adhesion to substrate. Inactivation of the CipC encoding gene led to a short decrease of the mutant strain's adherence level. This result suggests some other proteins may be involved in C. cellulolyticum adhesion to cellulose. Finally, I studied HycP, a produced and secreted CBM3 encoding protein of unknown function. HycP is a unique protein among databases and may have a phagic origin.

En raison des enjeux écologiques actuels, l'utilisation de ressources lignocellulosiques dans l'élaboration de matériaux composites suscite actuellement un intérêt grandissant. Au-delà des applications traditionnelles (papier, panneaux composites, textiles…), les ressources lignocellulosiques constituent une alternative durable aux ressources fossiles pour la production de biocarburant ou d'agrocomposites à base de fibres végétales. Ainsi, si l'on souhaite optimiser les performances de ces nouveaux composites, il est nécessaire de mieux connaitre les propriétés de la fibre et par conséquent réaliser une étude multi-échelle des propriétés physicochimiques et mécaniques des fibres, des polymères constitutifs et de leurs interactions. Dans ce cadre, le premier objectif de la thèse a été de mesurer à l'échelle nanométrique le gradient de propriétés mécaniques et physicochimiques de coupes de fibres végétales par l'intermédiaire de deux techniques utilisant le microscope à force atomique (AFM) visant à cartographier les propriétés nanomécaniques et les caractéristiques spectrales en IR. Puis, pour mieux comprendre le rôle des polymères et de leurs interactions sur les propriétés de la fibre, des systèmes bioinspirés, composés des trois principales classes de polymères pariétaux et de complexité croissante ont été élaborés en veillant à introduire des interactions covalentes et non covalentes entre les polymères, et plus particulièrement entre la lignine et les polysaccharides (cellulose, hémicelluloses). / Due to environmental context, the exploitation of lignocellulosic ressources in the elaboration of composite materials has currently a growing interest. Beside traditional uses (paper, textiles…), lignocellulosic ressources constitute a sustainable alternative to fossils ressources for the production of biofuels and fiber-based agrocomposites. However, optimization of the performance of fiber composites requires a multi-scale study of the physicochemical and mechanical properties of the fibers and of their constitutive polymers and their interactions. To this end, the first goal of the thesis is to measure at nanometric scale, the gradient of the mechanical and physicochemical properties of plant fibers using two AFM-based techniques aiming at the mapping of nanomechanical and IR spectral properties. Then, in order to better understand the role of the polymers and of their interactions on the fibers' properties, bioinspired systems have been designed with three main lignocellulosic polymers while achieving in covalent and non-covalent interactions between the polymers (especially between polysaccharides and lignin).

O etanol celulósico a partir da palhada de cana pode elevar a produção do bioetanol, porém esta é normalmente decomposta no campo. A degradação da parede celular no campo não foi elucidada e compreender este processo auxiliará na produção de etanol celulósico. O objetivo deste trabalho foi caracterizar a degradação da palhada de cana de açúcar no campo durante um ano. Foi analisada a composição da parede celular por fracionamento e composição dos monossacarídeos. Na parede celular, observou-se redução de 26% no teor de celulose enquanto houve aumento de 13% na fração de hemiceluloses mais solúveis. Mudanças na composição dos monossacarídeos das frações mostraram que o arabinoxilano (AX) foi o primeiro polímero a ser solubilizado (após 3 meses) seguido dos <font face=\"Symbol\">b-glucanos e celulose (após 6 meses). Isto sugere que o AX é a hemicelulose mais exposta e sua solubilização permitiu a degradação da celulose após 6 meses. A partir dos dados obtidos, sugeriu-se a utilização de xilanases seguidas de glucanases numa possível ordem de enzimas para produção de etanol celulósico. / The sugarcane straw cellulosic ethanol can increase bioethanol production, but the straw is usually degraded in the field. However, the process that leads the cell wall disassembly under field conditions is unknown and understanding how this happens can improve cellulosic ethanol production. In the present work we aimed at studying how sugarcane straw is degraded in the field during a year. Cell wall composition was determined by fractioning and determination of monosaccharide composition. Results showed a decrease (ca.26%) in cellulose content and an increase of 13% in high solubility hemicelluloses fraction. Changes in monosaccharide composition showed that the first polymer to be solubilised is the arabinoxylan (AX) (after 3 months) followed by <font face=\"Symbol\">b-glucans and cellulose (after 6 months). This suggests that AX is the most exposed hemicelullose and its solubilisation allowed cellulose degradation after 6 months. Our data suggest the use of xylanases followed by glucanases as an enzyme order to be used in cellulosic ethanol production from sugarcane straw.

As paredes celulares vegetais são estruturas essenciais para o crescimento e desenvolvimento das plantas. Além das suas diversas funções biológicas, os componentes polissacarídicos constituintes das paredes celulares (celulose, hemiceluloses e pectinas) são de vital importância como fonte natural de fibras para a nutrição humana e animal e são considerados os principais recursos renováveis do planeta, utilizados como matéria-prima para diversos processos industriais, por exemplo nos processos de produção de polpa celulósica. Todos esses fatores têm despertado grande interesse no estudo da composição e biossíntese das paredes celulares. A biossíntese dos seus polímeros se inicia no citoplasma das células, onde ocorre a formação dos precursores por uma rota metabólica complexa de biossíntese de açúcares-nucleotídeo. O entendimento da regulação dessa rota metabólica é fundamental para modular a dinâmica de biossíntese desses açúcares e assim tentar manipular as propriedades bioquímicas das paredes celulares. Nesse contexto, o presente projeto de pesquisa teve como objetivo avaliar o efeito da superexpressão do gene miox2 de Arabidopsis thaliana em plantas de Nicotiana tabacum. O produto desse gene é a enzima mio-inositol oxigenase (E.C. 1.13.99.1), cuja função é converter o mio-inositol em ácido D-glucurônico, composto central da rota de biossíntese de açúcares-nucleotídeo. Foram determinadas quatro isoformas tecido-específicas para o gene miox (miox1, miox2, miox4 e miox5) em Arabidopsis, sendo que a isoforma miox2 é a predominante em caules. Esse gene foi clonado em trabalhos anteriores realizados no laboratório e no presente trabalho, o cDNA do gene miox2 foi superexpresso em plantas de tabaco (Nicotiana tabacum) a fim de se avaliar o efeito da superexpressão na composição de carboidratos de parede celular secundária. As linhagens de plantas transgênicas obtidas, não mostraram diferenças visualmente perceptíveis em comparação aos controles, indicando ausência de alterações fisiológicas e morfológicas. Foram quantificados os monossacarídeos de paredes celulares secundárias (arabinose, ramnose, galactose, glicose, xilose, manose), os ácidos urônicos (ácido galacturônico e glucurônico) e as ligninas (solúvel e insolúvel), a partir de tecido xilemático e parênquima medular do caule. A ausência de modificações significativas nas proporções desses metabólitos, indica que as plantas exercem um estrito controle na regulação da biossíntese de paredes celulares secundárias de forma que a superexpressão do gene miox2 não provocou nenhuma alteração altamente significativa. Outros genes candidatos e os mecanismos envolvidos na sua regulação deverão ser testados quanto ao nível de transcrição, modificações pós-trancricionais e pós-traducionais a fim de entender a regulação do fluxo de carbono para a biossíntese de paredes celulares. / Cell-walls are essential structures for plant development and growth. Apart from its biological functions, the polyssacharides that make cell-walls (cellulose, hemicellulose and pectins) are the principal natural fibrous materials used for human and animal nutrition. They are also considered the most important renewable resource on earth and their use as industrial raw material is inevitable. An example is the use of wood in the production of pulp and paper. For all these reasons, the study of molecular composition and biosynthesis of plant cell-walls has been a matter of great interest for researchers over the past few years. Cell-wall polyssacharides biosynthesis begins at the cytoplasm, where a pool of UDP-glucose and other activated sugar nucleotide precursors are generated by multiple and complex interconvertion reactions. Understanding how cells control the metabolic pathways responsible for sugar nucleotide precursors synthesis, would be a primary requirement for manipulating them in an attempt to generate plants with improved properties for human use. In that context, tha aim of this research work was to analyze the effects of Arabidopsis thaliana miox2 gene overexpression in a plant model system (Nicotiana tabacum). The product of miox2 gene is myo-inositol oxygenase enzyme 2 (E.C.1.13.99.1) which converts D-glucuronic acid, an important sugar nucleotide precursor, from its substrate myo-inositol. Four isoforms of miox gene, with apparent tissue specific expression (miox1, miox2, miox4 and miox5) were already determined, but miox2 is the one primarily expressed in stems. Its cDNA was cloned from Arabidopsis thaliana in previous works and overexpressed in tobacco plants. Five normal transgenic lines were obtained, showing no phenotypically differences relative to the control line. This fact implied that miox2 overexpression did not alter any physiological nor morphological aspect of plant development. The cell-wall monossacharides (arabinose, rhamnose, galactose, glucose, xylose and mannose), uronic acids (galacturonic and glucuronic acid) and lignins (soluble and insoluble) from stem xylem and parenchymal tissue were quantified. The absence of major changes in any of the compounds measured for the transgenic lines indicated that they were able to adjust their level of carbohydrate composition. Plants seem to regulate the proportions of sugar nucleotide precursors through highly complex metabolic pathways that establish strong compensatory mechanisms. It will be necessary to study other candidate genes and some aspects of their regulation at transcriptional, postranscriptional and postransaltional level, as an attempt to understand the cell-wall carbohydrate flux.

A parede celular vegetal, estrutura essencial para as plantas, é extremamente importante para a economia humana, já que apresenta diversas utilidades, como por exemplo, fabricação de papel, fibras de vestuário, construção civil, entre outras. A maior parte da parede celular vegetal primária (aproximadamente 90%), é formada por polissacarídeos como celulose, hemiceluloses e pectinas. Os monossacarídeos, unidades formadoras dos polissacarídeos, são sintetizados, nas plantas, a partir de diferentes açúcares nucleotídeos, sendo que, o suprimento desses, pode afetar a biossíntese dos polissacarídeos da parede celular. Visando analisar o impacto da alteração do fluxo metabólico do carbono na composição da parede celular, o presente projeto de pesquisa teve como objetivo alterar a composição dos polissacarídeos da parede celular de Nicotiana tabcum, através da modulação da expressão do gene uxs, responsável pela codificação da enzima UDP-D-glucuronato descarboxilase (UDPGlcADC, EC 4.1.1.35) que converte UDP-D-glucuronato em UDP-D-xilose, importante açúcar nucleotídeo, precursor do monossacarídeo xilose. Para isso, após a clonagem do gene uxs de ervilha, foram obtidas plantas transgênicas de tabaco superexpressando esse gene. Diversas análises foram realizadas para determinação da composição química da parede celular primária e secundária dessas plantas. Pela análise de FTIR da parede celular primária, verificou-se que três linhagens transgênicas apresentaram espectrotipos consistentes, indicando uma redução na quantidade de pectinas e ligações ésteres carboxílica nessas linhagens transgênicas. Apesar de não terem sido detectadas alterações na proporção dos monossacarídeos ramnose, xilose, arabinose, manose e galactose, e na quantidade de celulose, na parede celular primária das plantas transgênicas, foram observadas diferenças na proporção de galactose não esterificada, nas linhagens que apresentaram espectrotipo. Com relação à parede celular secundária, observou-se que algumas linhagens transgênicas apresentaram maior concentração de lignina solúvel relacionada a uma redução no conteúdo de lignina insolúvel. / The plant cell wall is not only an essential structure for plants, but also an extremely important raw material in human economy. The plant cell wall has diverse utilities, for example, papermaking, textile fiber, civil construction. Polysaccharides, such as cellulose, hemicelluloses and pectins, are the major components of the primary plant cell wall (approximately 90%). These polysaccharides are formed by monosaccharides, which are synthesized in the plant from different nucleotide sugars. The suppliment of the nucleotide sugars can affect plant cell wall polysaccharides biosynthesis. Aiming at analyzing the impact of the alteration in the metabolic carbon flux on cell wall composition, the objective of this research project was to alterate the plant cell wall polysaccharides composition by the modulation of the uxs gene. This gene encodes the UDP-D-glucuronic acid decarboxylase enzyme (UDPGlcADC, EC 4.1.1.35) that promotes the conversion of UDP-D-glucuronic acid to UDP-D-xylose, an important sugar nucleotide precursor of xylose monosaccharide. To achieve this goal, the pea uxs gene was cloned and transgenic tobacco plants overexpressing this gene were obtained. Several analyses were performed to determinate the primary and secondary cell wall composition of those transgenic plants. The primary cell wall analysis by FTIR identified three transgenic lines that show different spectrotypes compared to wild type and those transgenic spectrotypes had the same features. The results indicate a reduction of pectin and ester carbonyl binding in the transgenic plants. No alterations were detected in the monosaccharide (rhamnose, xylose, arabinose, manose and galactose) proportions and the amount of cellulose in the primary cell wall of the transgenic plants. Nevertheless, differences in the proportion of unesterified galactose were observed in the same transgenic lines that showed spectrotypes. With regard to secondary cell wall, some transgenic lines showed an increase in soluble lignin which is related to a reduction in insoluble lignin.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-07-01Bitstream added on 2014-06-13T20:24:22Z : No. of bitstreams: 1 goncalves_azl_dr_rcla.pdf: 1708787 bytes, checksum: b3a9a5f321c84fbef694ca3153961530 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / No presente trabalho vinte de cinco linhagens de basidiomicetos, estocadas na coleção de microrganismos do Laboratório de Bioquímica e Microbiologia Aplicada, foram avaliadas com relação aos seus potenciais de produção de enzimas ligninolíticas. A finalidade dessas enzimas é complementar um preparado enzimático (contendo xilanases e celulases) para ser aplicado em dietas de ruminantes. A produção das enzimas nos resíduos/subprodutos farelo de trigo, farelo de algodão, polpa cítrica e bagaço de cevada foi considerável. Farelo de trigo e bagaço de cevada proporcionaram as melhores quantidades da enzima lacase. O fungo Coriolopsis byrsina produziu altos níveis de lacase extracelular, com baixa atividade de celulase. A atividade de feruloil esterase foi detectada no extrato enzimático bruto desse mesmo fungo quando cultivado em bagaço de cevada. A lacase foi estável até 60 °C por 1 hora, apresentando duas temperaturas ótimas, a 40 e 55 °C. Foi estável em ampla faixa de pH (4,0 – 8,0), apresentando pH ótimo 4,5 e mantendo 20% de sua atividade em pH 7,0. Além disso, apresentou 30% da sua atividade após 6 horas de incubação nas condições do ambiente ruminal. O tratamento das fibras vegetais com o extrato enzimático bruto de C. byrsina (alta atividade de lacase) misturado com o extrato enzimático bruto Trichoderma reesei (celulase + xilanase) melhorou o percentual de hidrólise, disponibilizando os carboidratos fermentáveis para posterior fermentação ruminal. A digestibilidade in vitro por produção de gases apresentou aumento significativo em todos os alimentos (forragens) avaliados / At the present research work twenty five basidiomycete strains kept in the colection of microrganisms in the Processing Biochemistry and Applied Microbiology laboratory at IBILCE were evaluated according to their ligninolytic enzymes production potential. The objective of these enzymes would be to complement an enzymatic mix (containing xylanases and cellulases) to be added to ruminants diets. The enzyme production in the byproducts like wheat bran, cotton bran, citrus pulp and brewer’s spent grain were considerably high. The wheat bran and the brewer’s spent grain presented the highest quantity of laccase. The fungal Coriolopsis byrsina produced high levels of extracellular laccase with low cellulose activity. The feruloyl esterase activity was detected in the crude enzyme of the same fungal when cultivated in brewer’s spent grain. Laccase was stable at 60 °C for 1 hour, presenting two optimal temperature at 40 and 55 °C. It was stable at (4.0 – 8.0) pH range, presenting optimal pH at 4.5 and keeping 20% of its activity at pH 7.0. Besides that, it presented 30% of its activity after 6 hours of incubation under ruminal conditions. The vegetable fiber treatment with C. byrsina crude enzyme (laccase high activity) mixed to Trichoderma reesei crude enzyme (cellulose + xylanase) improved the hydrolysis percentage releasing sugars for further ruminal fermentation. In vitro gas production digestibility showed significant increase in various crops

Orientador: Eleni Gomes / Banca: Regina Teresa Rosim Monteiro / Banca: João Claudio Thomeo / Banca: Ricardo Andrade Reis / Banca: Daniela Alonso Bocchini Martins / Resumo: No presente trabalho vinte de cinco linhagens de basidiomicetos, estocadas na coleção de microrganismos do Laboratório de Bioquímica e Microbiologia Aplicada, foram avaliadas com relação aos seus potenciais de produção de enzimas ligninolíticas. A finalidade dessas enzimas é complementar um preparado enzimático (contendo xilanases e celulases) para ser aplicado em dietas de ruminantes. A produção das enzimas nos resíduos/subprodutos farelo de trigo, farelo de algodão, polpa cítrica e bagaço de cevada foi considerável. Farelo de trigo e bagaço de cevada proporcionaram as melhores quantidades da enzima lacase. O fungo Coriolopsis byrsina produziu altos níveis de lacase extracelular, com baixa atividade de celulase. A atividade de feruloil esterase foi detectada no extrato enzimático bruto desse mesmo fungo quando cultivado em bagaço de cevada. A lacase foi estável até 60 °C por 1 hora, apresentando duas temperaturas ótimas, a 40 e 55 °C. Foi estável em ampla faixa de pH (4,0 - 8,0), apresentando pH ótimo 4,5 e mantendo 20% de sua atividade em pH 7,0. Além disso, apresentou 30% da sua atividade após 6 horas de incubação nas condições do ambiente ruminal. O tratamento das fibras vegetais com o extrato enzimático bruto de C. byrsina (alta atividade de lacase) misturado com o extrato enzimático bruto Trichoderma reesei (celulase + xilanase) melhorou o percentual de hidrólise, disponibilizando os carboidratos fermentáveis para posterior fermentação ruminal. A digestibilidade in vitro por produção de gases apresentou aumento significativo em todos os alimentos (forragens) avaliados / Abstract: At the present research work twenty five basidiomycete strains kept in the colection of microrganisms in the Processing Biochemistry and Applied Microbiology laboratory at IBILCE were evaluated according to their ligninolytic enzymes production potential. The objective of these enzymes would be to complement an enzymatic mix (containing xylanases and cellulases) to be added to ruminants diets. The enzyme production in the byproducts like wheat bran, cotton bran, citrus pulp and brewer's spent grain were considerably high. The wheat bran and the brewer's spent grain presented the highest quantity of laccase. The fungal Coriolopsis byrsina produced high levels of extracellular laccase with low cellulose activity. The feruloyl esterase activity was detected in the crude enzyme of the same fungal when cultivated in brewer's spent grain. Laccase was stable at 60 °C for 1 hour, presenting two optimal temperature at 40 and 55 °C. It was stable at (4.0 - 8.0) pH range, presenting optimal pH at 4.5 and keeping 20% of its activity at pH 7.0. Besides that, it presented 30% of its activity after 6 hours of incubation under ruminal conditions. The vegetable fiber treatment with C. byrsina crude enzyme (laccase high activity) mixed to Trichoderma reesei crude enzyme (cellulose + xylanase) improved the hydrolysis percentage releasing sugars for further ruminal fermentation. In vitro gas production digestibility showed significant increase in various crops / Doutor

O etanol celulósico a partir da palhada de cana pode elevar a produção do bioetanol, porém esta é normalmente decomposta no campo. A degradação da parede celular no campo não foi elucidada e compreender este processo auxiliará na produção de etanol celulósico. O objetivo deste trabalho foi caracterizar a degradação da palhada de cana de açúcar no campo durante um ano. Foi analisada a composição da parede celular por fracionamento e composição dos monossacarídeos. Na parede celular, observou-se redução de 26% no teor de celulose enquanto houve aumento de 13% na fração de hemiceluloses mais solúveis. Mudanças na composição dos monossacarídeos das frações mostraram que o arabinoxilano (AX) foi o primeiro polímero a ser solubilizado (após 3 meses) seguido dos <font face=\"Symbol\">b-glucanos e celulose (após 6 meses). Isto sugere que o AX é a hemicelulose mais exposta e sua solubilização permitiu a degradação da celulose após 6 meses. A partir dos dados obtidos, sugeriu-se a utilização de xilanases seguidas de glucanases numa possível ordem de enzimas para produção de etanol celulósico. / The sugarcane straw cellulosic ethanol can increase bioethanol production, but the straw is usually degraded in the field. However, the process that leads the cell wall disassembly under field conditions is unknown and understanding how this happens can improve cellulosic ethanol production. In the present work we aimed at studying how sugarcane straw is degraded in the field during a year. Cell wall composition was determined by fractioning and determination of monosaccharide composition. Results showed a decrease (ca.26%) in cellulose content and an increase of 13% in high solubility hemicelluloses fraction. Changes in monosaccharide composition showed that the first polymer to be solubilised is the arabinoxylan (AX) (after 3 months) followed by <font face=\"Symbol\">b-glucans and cellulose (after 6 months). This suggests that AX is the most exposed hemicelullose and its solubilisation allowed cellulose degradation after 6 months. Our data suggest the use of xylanases followed by glucanases as an enzyme order to be used in cellulosic ethanol production from sugarcane straw.