La transfusion sanguine est une thérapeutique indispensable pour laquelle il n’existe pas actuellement de substitut. La transfusion de produits sanguins labiles est dans la grande majorité des cas très bien tolérée mais elle peut être à l’origine d’effets indésirables chez les receveurs (EIR) notamment de type inflammatoire. Ceci dépend de facteurs liés aux produits eux-mêmes et/ou aux receveurs de par leur prédisposition génétique et de leur état clinique. Les concentrés plaquettaires (CP) sont la principale source de manifestations inflammatoires et/ou allergiques. Ceci est notamment dû, en partie, à la capacité des plaquettes à sécréter une multitude de molécules ayant une activité inflammatoire. De plus, les processus de collecte, de préparation et de conservation induisent un stress vis-à-vis des cellules, qui peut activer les plaquettes et donc induire la production de produits inflammatoires dans les CP. Le but de ce travail de thèse a été dans un premier temps d’identifier les molécules les plus impliquées dans les manifestations inflammatoires. Le sCD40L en particulier est identifié comme étant largement impliqué dans les EIR après transfusion de CP, mais pas systématiquement. Aussi, la composante inflammatoire de ces réactions est multifactorielle. De plus, nous avons évalué le potentiel inflammatoire des CP sur l’endothélium vasculaire. Des différences d’activation des cellules endothéliales, dans un modèle in vitro, ont été observées lorsqu’elles sont en présence de surnageants de CP ayant induits un EIR. Ce travail de thèse poursuit l’effort entrepris par notre équipe de recherche, en vue de prédire la survenue d’EIR et de préciser les mécanismes qui influencent la physiopathologie plaquettaire transfusionnelle ; un corollaire de ces travaux est ainsi d’optimiser les processus de production et de conditionnement des CP transfusés afin de réduire ces réactions inflammatoires. / Blood transfusion is an indispensable therapy for which there is currently no substitute. Transfusion of blood products is in the great majority of cases very well tolerated but it can be at the origin of serious adverse reactions (SARs), notably of inflammatory reactions. This depends on the factors related to the products themselves and/or to the recipients, their genetic predisposition and clinical condition. Platelet concentrates (PCs) are the main source of inflammatory and/or allergic manifestations. This is due, in part, to the ability of platelets to secrete a multitude of molecules with inflammatory activity. In addition, the collection, processing and storage conditions induce stress on cells, which can activate platelets and thus induce the production of inflammatory products in PCs. The purpose of this work is to identify the molecules involved in inflammatory manifestations. sCD40L was identified as being involved in SARs after PCs transfusion, but not systematically. Also, the inflammatory component of these reactions is multifactorial. In addition, we evaluated the inflammatory potential of PCs on the vascular endothelium. Differences in endothelial cell activation, in an in vitro model, were observed when they were in the presence of PC supernatants involved in SARs. This thesis work continues the effort undertaken by our research team to predict the occurrence of SARs and to clarify the mechanisms that influence transfusional platelet physiopathology; a corollary of this work is to optimize the production and conditioning process of PCs transfused in order to reduce these inflammatory reactions.

Une des propriétés majeures de la thrombine est le caractère pléiotropique de ses effets physiologiques et pathologiques à la fois dans le compartiment sanguin et tissulaire de la paroi. La voie de signalisation RhoA est activée par la fixation de la thrombine aux récepteurs PARs et cette voie est un régulateur principal de la mécanotransduction et de la plasticité cellulaire. Le facteur d’échange de RhoA, Arhgef1, est impliqué dans le développement de l’hypertension dépendante de l’angiotensine II et dans l’athérothrombose. Notre hypothèse est que le contrôle de la signalisation intracellulaire de RhoA par Arhgef1 est un élément régulateur de la coagulation plasmatique et pourrait participer aux modifications phénotypiques des plaquettes et des cellules vasculaires et ainsi contribuer à l’augmentation de la génération de thrombine tissulaire. Les objectifs ont été de caractériser la génération de thrombine et la fonction plaquettaire depuis leur activation jusqu’à leurs implications dans un modèle de thrombose tissulaire et d’étudier le rôle prothrombotique des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLVs) chez des souris Arhgef1 -/-. Résultats : Les souris Arhgef1-/- ont une numération plaquettaire normale mais présentent une diminution significative de l’activation plaquettaire, de la génération de thrombine en sang total et en présence de plaquettes (mais pas en plasma pauvre en plaquettes) et de l’adhérence plaquettaire par rapport aux souris contrôles. Ces modifications se traduisent, in vivo, par un plus grand nombre d’arrêts transitoires de l’écoulement sanguin dans le modèle de saignement à la queue et un allongement du temps de survenue du thrombus occlusif carotidien en réponse au FeCl3 chez les souris Arhgef1 -/- comparées aux contrôles. Les CMLVs des souris Arhgef1 -/- génèrent moins de thrombine à leur surface et ont une prolifération diminuée par rapport aux CMLVs des souris contrôles. En conclusion, les résultats démontrent le rôle d’Arhgef1 dans les fonctions plaquettaires et dans la régulation du phénotype des CMLVs. Le mécanisme principal fait intervenir la Rho GTPase dans l’adhésion plaquettaire et la génération de thrombine à la surface CMLVs qui contrôlent la formation du thrombus. Ces résultats suggèrent que ce facteur d’échange est capable d’amplifier la thrombose artérielle et pourrait être impliqué via les récepteurs à la thrombine dans le couplage thrombine tissulaire-rigidité cellulaire via les plaquettes et les CMLVs dans les pathologies vasculaires. / One of the major properties of thrombin is the pleiotropic character of its physiological and pathological effects in both the blood and the tissue compartment of the vessel wall. The RhoA signaling pathway is activated by the binding of thrombin to the PARs receptors and this pathway is a major regulator of mechanotransduction and cellular plasticity. The RhoA exchange factor, Arhgef1, is involved in the development of angiotensin II-dependent hypertension and in atherothrombosis. Our hypothesis is that the control of intracellular RhoA signaling by Arhgef1 is a regulatory element of plasma coagulation and could participate in phenotypic modifications of platelets and vascular cells and thus contribute to the increase of tissue thrombin generation. The objectives were to characterize thrombin generation and platelet function from their activation to their implications in a model of tissue thrombosis, and to study the prothrombotic role of vascular smooth muscle cells (VSMCs) in Arhgef1 -/- mice. Results: Arhgef1 -/- mice had a normal platelet count but showed a significant decrease in platelet activation, thrombin generation in whole blood and in the presence of platelets (but not in platelet poor plasma) and platelet adhesion compared to control mice. These modifications result, in vivo, by a greater number of transitory stopping of the blood flow in the tail bleeding model and an increase in the time of occurrence of the carotid occlusive thrombus in response to FeCl3 in Arhgef1 -/- mice compared to controls. The VSMCs of Arhgef1 -/- mice generate less thrombin at their surface and have decreased proliferation compared to VSMCs of the control mice. In conclusion, the results demonstrate the role of Arhgef1 in platelet function and in the regulating of the phenotype of VSMCs. The main mechanism involves Rho GTPase in platelet adhesion and in thrombin generation at the VSMC surface that control thrombus formation. These results suggest that this exchange factor is able to amplify aterial thrombosis and could be involved via thrombin receptors in tissue thrombin-cell stiffness coupling via platelets and VSMCs in vascular pathologies.

Le TRALI immunologique est un syndrome de détresse respiratoire aiguë rare, provoqué par la présence d’alloanticorps dans les produits transfusés. Il est classiquement étudié au moyen d’un modèle de souris qui reçoivent un anticorps monoclonal contre les molécules d’histocompatibilité de classe I, anti-H-2d. Or les mécanismes qui conduisent au TRALI restent encore largement incompris. Dans ce travail de thèse, je montre que l’inhibition des récepteurs P2X1 à l’ATP et du canal calcique TRPC6, diminue le développement des œdèmes péri-artériolaires pulmonaires lors d’un TRALI, suggérant un rôle des cellules musculaires lisses. Les expériences de déplétions cellulaires spécifiques montrent que les plaquettes et les neutrophiles ne sont pas nécessaires pour l’initiation du TRALI, contrairement à ce qui avait été montré par d’autres équipes. Les monocytes et/ou les macrophages sont par contre indispensables. J’ai aussi développé un modèle de TRALI immunologique utilisant des souris transgéniques pour le récepteur humain FcγRIIA, et un anticorps recombinant muni d’une partie Fc d’IgG1 humaine. Mes travaux montrent que le TRALI est plus sévère dans les souris transgéniques, accompagné d’une activation plus importante des plaquettes et des neutrophiles. Ce modèle permet d’envisager l’étude des mécanismes du TRALI sous un nouvel angle, plus proche de la physiopathologie humaine, ainsi que celle de la contribution des parties Fc des anticorps humains. / Immunological TRALI is a rare acute respiratory distress syndrome induced by the presence of alloantibodies in transfused products. A mouse model using a monoclonal antibody against the major histocompatibility complex class I, anti-H-2d, is usually used to study its mechanisms. Nevertheless, there is a lack in our understanding regarding the course of events. In this thesis, I show that the inhibitions of the ATP-gated receptor P2X1 and of the TRPC6 channel reduce the development of periarteriolar pulmonary edema occurring during TRALI, pointing to a role of smooth muscles cells. Specific cell depletions show that platelets and neutrophils are dispensable for TRALI initiation, in contrast to previous reports. Monocytes and/or macrophages are however necessary. I also developed a model of immune TRALI using transgenic mice expressing the human receptor FcγRIIA, and a recombinant antibody with a human IgG1-Fc fragment. My work reveal a more severe TRALI response in transgenic mice, with enhanced activation of platelets and neutrophils. This model allow a finer study of mechanisms underlying TRALI, moving towards the human actors of the pathology. We can also use this novel approach to assess the contribution of human Fc fragment.

L'acide docosahexaénoïque (DHA) est un acide gras polyinsaturé n-3 connu pour son rôle protecteur contre les maladies cardiovasculaires. Cependant une utilisation importante de DHA peut néanmoins contrebalancer les effets bénéfiques par la formation de produits d'oxydation dommageables. Notre travail a été de déterminer les effets de l'ingestion de doses croissantes de DHA chez l'Homme sain sur les fonctions, le métabolisme et l'état redox des plaquettes sanguines et d'analyser son action sur un modèle de précurseurs des plaquettes, la lignée humaine de mégacaryocytes MEG-01. Nos résultats montrent que l'ingestion de faibles doses de DHA (400 à 1600 mg) diminue la réponse plaquettaire. Une dose plus faible montre un effet anti-oxydant. Ceci est conforté par les effets transcriptionnels obtenus sur les cellules MEG-01. Ceci pourrait contribuer à l'explication de l'influence bénéfique des acides gras polyinsaturés n-3 à faible dose sur les maladies cardio-vasculaires.

Les plaquettes jouent un rôle majeur dans l'hémostase primaire ainsi que dans l'inflammation. Elles contiennent et sécrètent une grande variété de facteurs solubles et parmi les nombreux récepteurs qu'elles expriment à leur surface, les plaquettes expriment les " Toll-Like Receptor " (TLR), récepteurs clés de l'interaction entre l'immunité innée et adaptative. En réponse à un stimulus infectieux, comme le lipopolysaccharide (LPS) des bactéries Gram-négative, ligand naturel du TLR4, ou des peptides issus d'une partie de la protéine d'enveloppe du VIH (gp41), les plaquettes vont s'activer de manière différentielle. L'activation plaquettaire est variable en fonction de leur activation par à un stimulus hémostatique (exemple : la thrombine) vs. infectieux (exemple : le LPS) ; le panel de cytokines libérées dans le surnageant plaquettaire semble en fait finement régulé. De plus, nous avons démontré la présence intra-plaquettaire de la majorité des protéines composant les voies de signalisation du TLR4 eucaryote. Nous avons ensuite montré que ces voies pouvaient être modulées. L'engagement du TLR4 plaquettaire par deux types biochimiques de LPS entraîne un relargage différentiel des facteurs solubles immunomodulateurs dans le surnageant de culture et que ce surnageant dernier génère une activation différentielle des cellules cibles, comme les cellules mononucléées du sang circulant. Ces travaux montrent que la réponse inflammatoire plaquettaire est régulée en fonction du stimulus. Ainsi, mes travaux s'inscrivent dans la ré-exploration de la fonction inflammatoire des plaquettes sanguines et l'étude du rôle des plaquettes comme cellules de l'immunité innée et inflammatoire

L'hémophilie A (HA) est une maladie hémorragique congénitale qui se traduit par un défaut en facteur VIII (FVIII) de la coagulation. Le traitement privilégié des saignements est l'administration de FVIII exogène cependant, 30% des patients développent une réponse anticorps alloimmune contre le FVIII thérapeutique qui inhibe son activité pro-coagulante. L'endocytose du FVIII par les cellules dendritiques (DC) et sa présentation aux lymphocytes T ont été documentées. Cependant, la nature des signaux de danger (SD) responsables de la maturation des DC indispensable à l'initiation de la réponse immunitaire anti-FVIII, est inconnue. Au cours de ma thèse, j'ai cherché à identifier l'origine de ces SD et envisagé 3 possibilités: Une origine liée à la structure intrinsèque du FVIII, au contexte inflammatoire avant l'administration de FVIII, ou au contexte inflammatoire généré par l'injection de FVIII. Mes résultats ont montré que le FVIII n'était pas capable d'induire la maturation de macrophages ou d'activer directement le TLR2. J'ai également écarté l'hypothèse d'un état d'activation compensatoire des plaquettes (PLT) dans un organisme privé de FVIII. En revanche, mes travaux ont mis en évidence un rôle des PLT dans l'initiation de la réponse immunitaire anti-FVIII dans le modèle murin d'HA. Mes résultats suggèrent que l'implication des PLT passe par leur activation par la thrombine générée lors de l'administration de FVIII. L'identification des médiateurs de l'inflammation issus de l'activation plaquettaire devrait ouvrir des perspectives thérapeutiques intéressantes dans le contrôle de l'inflammation au moment de l'administration de FVIII, afin de réduire son immunogénicité.

Le CD40 ligand (CD40L) est une molécule inflammatoire appartenant à la famille du Facteur de Nécrose Tumorale ("Tumor Necrosis Factor", TNF), originalement identifié au niveau des cellules immunitaires. L’interaction du CD40L avec son récepteur de haute affinité présent sur les cellules B, le CD40, est d’une importance cruciale à la production d’immunoglobulines lors de la réponse immunitaire. Aujourd’hui, nous savons que ces deux molécules qui constituent l’axe CD40/CD40L sont aussi exprimées au niveau des cellules du système vasculaire et occupent une place importante dans une variété de réactions inflammatoires, de sorte que le CD40L est présentement reconnu comme une molécule thrombo-inflammatoire prédictive des évènements cardiovasculaires. Les plaquettes sont la principale source du CD40L soluble ("soluble CD40L", sCD40L) plasmatique et il fut démontré être impliqué dans l’activation plaquettaire, malgré que son impact exact sur la fonction plaquettaire et les mécanismes sous-jacents demeurent inconnus. Ainsi, le but de ce projet était de déterminer l’impact du sCD40L sur la fonction plaquettaire et d’élucider les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents. Les objectifs spécifiques étaient : 1) d’évaluer l’impact du sCD40L sur l’activation et l’agrégation plaquettaire in vitro; 2) de déterminer le récepteur cible (CD40 ou autre) impliqué dans ces effets; 3) de décortiquer les voies signalétiques intracellulaires et moléculaires induites par le sCD40L, impliquant la participation potentielle de la famille du facteur associé du récepteur du TNF ("Tumor Necrosis Factor Receptor Associated Factor", TRAF) et 4) d’analyser l’effet du sCD40L sur la formation du thrombus in vivo. Le sCD40L augmente fortement l’activation et l’agrégation plaquettaire induite par de faibles doses d’agonistes. Les plaquettes humaines traitées avec une forme mutante du sCD40L qui n’interagit pas avec le CD40 et les plaquettes de souris CD40 déficientes (CD40-/-) ne furent pas en mesure d’induire ces effets. De plus, nous démontrons la présence de plusieurs membres de la famille des TRAFs dans les plaquettes, parmi lesquels seulement TRAF-2 interagit avec le CD40 suite à la stimulation par le sCD40L. Le sCD40L agit sur les plaquettes au repos par l’entremise de la protéine Rac1 et de sa cible en aval, soit la protéine kinase activatrice du mitogène p38 ("Mitogen Activating Protein Kinase", MAPK). Ceci mène ultimement au changement de forme plaquettaire et à la polymérisation de l’actine. Par ailleurs, il est intéressant de noter que les souris CD40-/- démontrent un défaut significatif de l’agrégation plaquettaire en réponse au collagène, ce qui souligne l’importance du CD40 dans les interactions plaquettes-plaquettes. Dans un deuxième temps, le sCD40L amplifie l’agrégation plaquettaire en sang complet, accélère les temps de thrombose in vitro mesurés à l’aide du système PFA-100 et augmente l’adhésion plaquettaire au collagène sous condition de flux, le tout par l’entremise du CD40. Finalement, dans un modèle de thrombose artérielle murin, l’infusion du sCD40L exacerbe la formation du thrombus chez les souris du type sauvage ("Wild Type", WT), mais non chez les souris CD40-/-. Ceci fut en plus associé à une augmentation significative du nombre de leucocytes au sein du thrombus des souris WT traitées à l’aide du sCD40L, tel que démontré par marquage immuno-histologique anti-CD45 et par quantification des coupes artérielles par microscopie optique. En résumé, ce projet identifie une nouvelle voie signalétique, TRAF-2/Rac1/p38 MAPK, en réponse au sCD40L et démontre ses effets sur l’activation et l’agrégation plaquettaire. De manière encore plus importante, nous démontrons pour la première fois la présence d’une corrélation positive entre les niveaux circulants du sCD40L et la thrombose artérielle, tout en soulignant l’importance du CD40 dans ce processus. Ainsi, le sCD40L constitue un activateur important des plaquettes, les prédisposant à une thrombose exacerbée en réponse au dommage vasculaire. Ces résultats peuvent expliquer le lien étroit qui existe entre les niveaux circulants du sCD40L et l’incidence des maladies cardiovasculaires. / CD40 ligand (CD40L) is an inflammatory molecule of the tumor necrosis factor (TNF) superfamily originally identified on cells of the immune system. Interaction of CD40L with its respective receptor on B cells, CD40, is of critical importance for immunoglobulin isotype switching during the immune response. Today, we know that these two molecules are also present on cells of the vascular system and have important implications in various inflammatory reactions, such that CD40L is now regarded as a thrombo-inflammatory molecule that predicts cardiovascular events. Platelets constitute the major source of soluble CD40L (sCD40L) found in plasma and it has been shown in return to influence platelet activation, albeit the exact functional impact and underlying mechanisms remain undefined. Hence, this project was designed to investigate the effects of sCD40L on platelet function and to elucidate the cellular and molecular mechanisms involved. The specific aims of this study are four fold: 1) evaluate the impact of sCD40L on platelet activation and aggregation in vitro; 2) determine through which receptor (CD40 or other) these responses are mediated; 3) elucidate the underlying intracellular signalling pathways and molecular mechanisms involved, including the potential participation of the Tumor Necrosis Factor Receptor Associated Factor (TRAF) family and 4) assess the impact of sCD40L on thrombus formation in vivo. sCD40L strongly enhances activation and aggregation of washed human platelets induced by sub-threshold concentrations of agonists. Human platelets treated with a mutated form of sCD40L that does not bind CD40 and CD40 deficient (CD40-/-) mouse platelets failed to elicit such responses. Furthermore, we found that platelets express multiple members of the TRAF family, among which only TRAF-2 associates with CD40 upon sCD40L stimulation. Noticeably, sCD40L primes resting platelets through activation of the small GTPase Rac1 and its downstream target p38 mitogen activating protein kinase (MAPK), which leads to platelet shape change and actin polymerization. Interestingly, CD40-/- mice exhibit impaired platelet aggregation in response to collagen, thus highlighting the importance of CD40 in platelet-platelet interactions. Moreover, sCD40L dose-dependently enhances whole blood platelet aggregation and accelerates platelet function analyzer (PFA)-100 closure times in a CD40-dependant fashion. Preincubation of whole blood with sCD40L significantly increases platelet adhesion to collagen in an ex-vivo perfusion system under flow. In addition, in a ferric chloride-induced murine arterial thrombosis model, infusion of sCD40L exacerbates thrombus formation in wild type (WT), but not in CD40-/- mice. This was further associated with increased leukocyte infiltration within the thrombus mass of WT mice treated with sCD40L. In this project, we identify a new TRAF-2/Rac1/p38 MAPK signaling pathway in response to sCD40L and its effects on platelet activation and aggregation. More importantly, we establish a direct positive correlation between levels of sCD40L and thrombus formation in vivo, while highlighting the requirement of CD40 in this process. Thus, sCD40L is an important platelet primer predisposing platelets to enhanced thrombus formation in response to vascular injury. These results may explain the link between circulating levels of sCD40L and the occurrence of cardiovascular diseases.

Compte tenu de l'utilisation envisagée du graphite comme matériau de creuset à la place de la silice frittée pour la cristallisation dirigée des lingots de silicium multcristallin de qualité photovoltaïque, un objectif majeur de la thèse était de développer un revêtement spécifique au matériau de moule sélectionné. Une première tâche de ce travail a consisté à définir très précisément les conditions de fonctionnement du couple revêtement anti-adhérent / matériau de creuset et les modifications à apporter au procédé afin d'utiliser le revêtement standard à base de poudre de Si3N4 sur graphite, La deuxième tâche de la thèse a consisté à mettre en place le procédé de moulage à partir d'une étude préliminaire basée sur une configuration simplifiée de moulage par écrasement où un morceau de silicium s'étale à l'intérieur du moule au cours de sa fusion. Le but recherché est de mettre en évidence les conséquences de la configuration " moulage " (caractérisée par un rapport élevé surface de contact / volume de Si a priori très défavorable) et des conditions thermiques (gradient et vitesse de solidification) sur l'adhérence (collage), la pollution par le revêtement et la structure cristalline du silicium.

Le CD40 est un membre de la famille des récepteurs du facteur de nécrose tumorale ("Tumour necrosis factor", TNF), initialement identifié sur des cellules de carcinome de la vessie. L'interaction du CD40 avec son ligand (CD40L) est d'une importance cruciale pour le développement des cellules B et de la commutation d'isotype au cours de la réponse immunitaire acquise. L'expression du complexe CD40/CD40L était initialement cru d'être limiter aux cellules du système immunitaire, mais aujourd'hui il est bien connu que ce complexe est également exprimé sur les cellules du système circulatoire et vasculaire, et est impliqué dans diverses réactions inflammatoires; de sorte que le CD40L est maintenant considéré comme une molécule thrombo-inflammatoire prédictive des événements cardiovasculaires. Les plaquettes expriment constitutivement le CD40, alors que le CD40L n'est exprimé que suite à leur l'activation. Il est ensuite clivé en sa forme soluble (sCD40L) qui représente la majorité du sCD40L en circulation. Il fut démontré que le sCD40L influence l'activation plaquettaire mais son effet exact sur la fonction plaquettaire, ainsi que les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents à son action demeurent inconnus. Ainsi, ce projet a été entrepris dans le but d’adresser les objectifs spécifiques suivants: 1) évaluer les effets in vitro du sCD40L sur l'activation et l'agrégation plaquettaire; 2) identifier les récepteurs plaquettaires impliqués dans l’action du sCD40L; 3) élucider les voies signalétiques intracellulaires induits par le sCD40L; 4) évaluer les effets du sCD40L sur la formation de thrombus in vivo. Nous avons trouvé que le sCD40L augmente fortement l'activation et l'agrégation des plaquettes en réponse à de faibles concentrations d'agonistes. Les plaquettes humaines traitées avec une forme mutante du sCD40L qui n'interagit pas avec le CD40, et les plaquettes de souris déficientes en CD40 ne furent pas en mesure d'induire de telles réponses, indiquant que le récepteur principal du sCD40L au niveau des plaquettes est le CD40. En plus, nous avons identifié la présence de plusieurs membres de la famille du facteur associé du récepteur du TNF ("TNF receptor-associated factor", TRAF) dans les plaquettes et nous avons montré que seulement le TRAF2 s'associe avec le CD40 suite à la stimulation par le sCD40L. Nos résultats indiquent aussi que le sCD40L agisse sur les plaquettes au repos par l'entremise de deux voies signalétiques distinctes. La première voie implique l'activation de la petite GTPase Rac1 et de sa cible en aval, soit la protéine kinase p38 activée par le mitogène ("p38 mitogen-activated protein kinase", p38 MAPK ), menant au changement de forme plaquettaire et à la polymérisation de l'actine; alors que la deuxième voie implique l'activation de la cascade signalétique du NF-kB. Par ailleurs, à la suite d'une lésion artérielle induite par le chlorure de fer, le sCD40L exacerbe la formation de thrombus et l'infiltration leucocytaire au sein du thrombus dans les souris du type sauvage, mais pas chez les souris déficientes en CD40. En conclusion, ce projet a permis d'identifier pour la première fois deux voies signalétiques distinctes en aval du CD40 plaquettaire et a permis d'établir leur implication dans l'activation et l'agrégation plaquettaire en réponse au sCD40L. De manière plus importante, ce projet nous a permis d'établir un lien direct entre les niveaux élevés du sCD40L circulant et la formation de thrombus in vivo, tout en soulignant l'importance du CD40 dans ce processus. Par conséquent, l'axe CD40/CD40L joue un rôle important dans l'activation des plaquettes, les prédisposant à une thrombose accrue en réponse à une lésion vasculaire. Ces résultats peuvent expliquer en partie la corrélation entre les taux circulants élevés du sCD40L et l'incidence des maladies cardiovasculaires. / CD40 is a member of the tumour necrosis factor (TNF) receptor family, originally identified on human bladder carcinoma cells. Interaction of CD40 with its ligand (CD40L) is of crucial importance for B cell development and immunoglobulin isotype switching during the adaptive immune response. Expression of the CD40/CD40L dyad was initially thought to be restricted to cells of the immune system, but today it is known to be also expressed on cells of the circulatory and vascular systems, and have important implications in various inflammatory reactions, such that CD40L is now regarded as a thrombo-inflammatory molecule and a reliable predictor of cardiovascular events. Platelets constitutively express CD40, whereas CD40L is expressed upon activation and subsequently cleaved into its soluble form (sCD40L), accounting for the majority of circulating sCD40L. Soluble CD40L has been shown to influence platelet activation but its precise effect on platelet function, and the underlying cellular and molecular mechanisms remain undefined; hence the purpose of this project. The specific aims of this study are: 1) to evaluate the in vitro effects of sCD40L on platelet activation and aggregation; 2) to determine the receptor(s) on platelets involved in the action of sCD40L; 3) to elucidate the intracellular signalling pathways induced by sCD40L; and 4) to evaluate the in vivo effects of sCD40L on thrombus formation. We have showed that sCD40L strongly enhances activation and aggregation of washed human platelets in response to sub-threshold concentrations of agonists. Human platelets treated with a mutated form of sCD40L that lacks CD40 binding, and platelets from CD40 deficient mice failed to elicit such responses, indicating that CD40 is the major platelet receptor for sCD40L. Moreover, we identified the presence of multiple members of the TNF receptor-associated factor (TRAF) in platelets and showed that only TRAF2 associates with CD40 after sCD40L stimulation. Interestingly, sCD40L primes resting platelets through two distinct signalling pathways. The first pathway involves activation of the small GTPase Rac1 and its downstream target p38 mitogen-activated protein kinase, leading to platelet shape change and actin polymerization; whereas the second pathway involves activation of the NF-κB signalling cascade. Furthermore, sCD40L exacerbates thrombus formation and leukocyte infiltration within the thrombus mass in wild-type mice but not in CD40 deficient mice following ferric chloride-induced arterial injury. In conclusion, we have identified for the first time two distinct signalling pathways downstream of platelet CD40, and established their implication in platelet activation and aggregation in response to sCD40L. Noticeably, we established a direct link between elevated levels of sCD40L and in vivo thrombus formation, while emphasizing the requirement of CD40 in this process. Therefore, the CD40/CD40L dyad plays an important role in platelet priming that predisposes platelets to enhanced thrombus formation in response to vascular injury. These results may partly explain the correlation between elevated circulating levels of sCD40L and the incidence of cardiovascular diseases.

Les plaquettes sont des cellules sanguines anucléées impliquées dans les phénomènes d'hémostase et de thrombose. La majorité des fonctions plaquettaires dépend de leur membrane cellulaire, qui contient de nombreux microdomaines lipidiques ordonnés appelés radeaux lipidiques. Ces microdomaines jouent un rôle central dans toutes les phases de l'hémostase médiées par les plaquettes. Les radeaux lipidiques sont essentiels pour le fonctionnement des récepteurs responsables de l'activation des plaquettes et de la transduction du signal. Le rôle des plaquettes dans la thrombose artérielle est crucial et explique l'intérêt continu de la recherche dans la thérapie antiplaquettaire. Dans ce contexte, nous avons cherché à étudier les radeaux lipidiques comme lieu d'assemblage principal des récepteurs membranaires. Nous avons également cherché à identifier des protéines impliquées dans la fonction des plaquettes, en vue de proposer de nouvelles cibles thérapeutiques. Nous avons utilisé des analyses lipidomiques et protéomiques ainsi que des analyses d'immunoblotting pour identifier les radeaux lipidiques de la membrane des plaquettes et étudier leur organisation dans les plaquettes non stimulées, stimulées et traitées par des antiagrégants plaquettaires. Des détergents, l'ultracentrifugation et les gradients de sucrase ont été utilisés principalement pour le fractionnement de la membrane et l'isolement des radeaux lipidiques. Les principaux résultats de notre travail sont: 1) Élaboration d'une méthodologie pour l'étude des radeaux lipidiques des plaquettes ; 2) Présentation d'un profil global de la composition lipidique et protéique des radeaux lipidiques ; 3) Démonstration de l'impact de l'activation plaquettaire et des antiagrégants plaquettaires sur la réorganisation des radeaux lipidiques ; Et 4) Proposition de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles par protéomique et identification de réseau interactif de protéines autour notamment du facteur XIII (FXIII) et de la phosphoprotéine stimulée par vasodilatateur (V ASP). Nos résultats montrent que les radeaux lipidiques peuvent potentiellement être considérés comme nouvelles cibles thérapeutiques pour la découverte de nouveaux antiagrégants plaquettaires. Les études "Omics" sont importantes pour élargir nos connaissances dans ce domaine / Latelets are blood ce lis at the crossroads of both haemostasis and thrombosis. The majority of platelet functions depend on their membrane, which contains numerous, ordered lipid microdomains named lipid rafts. These microdomains play a pivotai role in all phases of platelet­mediated haemostasis. Lipid rafts are a prerequisite for the functioning of receptors in charge of platelet activation and signal transduction. The role of platelets in thrombotic diseases is crucial, and underpins the continue research interest in antiplatelet therapy. ln this context, we aimed to study the lipid rafts of platelet membranes as the principal assembly place of known receptors, and likely also other, unknown elements that participate in the thrombotic function of platelets, with a view to proposing new therapeutic targets. We used lipidomics and proteomics as well as immunoblot analysis to identify lipid rafts and investigate the organization of lipid rafts in resting, stimulated and antiplatelet-treated platelets. Detergents, ultracentrifugation and sucrose gradients were used mainly for membrane fractionatio and isolation of lipid rafts. The main findings of our work are: 1) Development of a framework or guidelines for platelet lipid raft investigation; 2) Presentation of a global profile of the lipid and protein composition of plate let lipid rafts; 3) Demonstration of the impact of activators and inhibitors on the reorganization of platelet lipid rafts; and 4) Suggestion for potential new therapeutic targets by proteomics analysis through interactive network analyzing of coagulation factor XIII (FXIII) and Vasodilator-Stimulated Phosphoprotein (VASP). Our results show that lipid rafts have potential as new therapeutic targets in pharmacological research in antiplatelets. "Omics" studies are important to expand our knowledge in this field