Este trabalho observacional teve como objetivo investigar os fatores associados com o desenvolvimento da malária ao longo da gestação e as implicações da infecção por Plasmodium no momento do parto e da malária clínica ao longo da gestação para o crescimento fetal e para o nível de hemoglobina materna no parto, em uma região de alta endemicidade para a doença, onde há cocirculação de P. falciparum e P. vivax, na Amazônia Brasileira. Ao todo 1.180 gestantes participaram das análises de fatores associados ao desenvolvimento de malária gestacional e 1.140 - as gestantes que tiveram filhos nascidos vivos não gêmeos - participaram das análises da associação entre ocorrência de malária gestacional e os desfechos gestacionais abordados neste estudo. A prevalência de malária clínica antenatal, diagnosticada por microscopia de gota espessa, foi de 8,0%, sendo 74,6% dos casos notificados como P. vivax; a prevalência de infecção por Plasmodium no momento do parto, diagnosticada por qPCR, foi de 7,5% - ao todo 12,5% das gestantes que participaram deste estudo tiveram malária clínica antenatal ou infecção por Plasmodium no parto. A grande maioria (89,9%) das infecções por Plasmodium no parto foram assintomáticas. Morar em área rural foi o principal fator associado à malária gestacional na população deste estudo. No que se refere ao impacto da malária para os desfechos de crescimento fetal e nível de hemoglobina no parto, observou-se que malária antenatal provocou redução média de 0,36 (intervalo de confiança [IC] 95%, - 0,57 - -0,14 p = <0,01) no escore z de peso ao nascer, de 0,31 (IC 95%, - 0,54 - -0,08, p = 0,01) no escore z de comprimento ao nascer, e de 0,34 g/100 mL (IC 95%, -0,62 - -0,05 p = 0,02) na concentração de hemoglobina no momento do parto. Foi observado que um único caso de malária vivax antenatal foi suficiente para afetar negativamente o crescimento fetal e a concentração de hemoglobina materna. Quando foram analisados somente os casos de malária vivax repetidas, o efeito negativo foi ainda mais pronunciado. Entre as 637 amostras de cordão umbilical que tiveram diagnóstico molecular feito, 4 (0,6%) foram positivas para P. vivax e 2 (0,3%) para P. falciparum, totalizando uma prevalência de 0,9% de malária congênita na população de estudo. Apenas um dos casos de malária congênita apresentou sintomas. Foram observadas falhas de notificação no banco de dados do sistema de Informação Epidemiológica (SIVEP Malária), e há indicação de falhas no tratamento de malária na gestação no Brasil. Os resultados deste estudo confirmam que a malária vivax na gestação pode ter implicações graves para a saúde materno-fetal. No âmbito local os resultados deste estudo evidenciam a malária na gestação como problema de saúde pública nas regiões endêmicas do Brasil. / The main objectives of this observational study were to investigate the associations between malaria in pregnancy (MiP) and sociodemographic and biological variables of mothers and estimate its impact on birth weight and length and maternal hemoglobin in 1,180 women from Juruá Valley, the main malaria hotspot in Brazil. Antenatal malaria episodes, 74.6% of them due to Plasmodium vivax, were microscopically diagnosed in 8.0% of the women and were associated with an average reduction in birth weight z-scores of 0.36 (95% confidence interval [CI] -0.57 - -0.14 p = <0.01) and in birth length z-scores of 0.31 (CI 95%, - 0.54 - -0.08, p = 0.01), compared with malaria-free pregnancies. Affected mothers had a mean decrease in hemoglobin concentration at delivery of 0.34 g/100 mL (CI 95%, -0.62 - -0.05 p = 0.02). Although repeated antenatal vivax infections were associated with poorer birth outcomes, even a single vivax malaria episode was associated with a significant reduction in birth weight and length and maternal hemoglobin. Overall, 7.5% women had the parasites DNA found in peripheral blood at delivery. Most (83.1%) of these 89 perinatal infections were due to P. vivax and only 7.9% of them progressed to symptomatic disease after delivery. P. vivax and P. falciparum DNA was found in 0.6% and 0.3% of 637 cord blood samples examined, respectively, but only one newborn developed clinical neonatal malaria. Living in rural areas was the main factor associated with gestational malaria in the study population. Moreover, we found further evidence that health-care providers often fail to comply with the countrys malaria treatment guidelines for pregnant women in Brazil. We retrospectively found that Primaquine was prescribed for more than half of the antenatal P. vivax infections diagnosed during the study, not only in the first trimester (when the pregnancy status might be unknown) but also in infections correctly reported as MiP. Our results further challenge the notion that vivax malaria is relatively benign during pregnancy and call for better strategies for its prevention.

O Antígeno 1 de Membrana Apical (AMA-1) tem sido sugerido como candidato a compor uma vacina contra estágios assexuados sanguíneos de Plasmodium. Recentemente nosso grupo identificou o domínio II (DII) de AMA-1 de Plasmodium vivax (PvAMA-1) como uma região altamente reconhecida por anticorpos IgG de indivíduos brasileiros infectados por P. vivax. No presente estudo avaliamos as propriedades imunogênicas da proteína recombinante DII, produzida a partir de Escherichia coli. Grupos de 6 camundongos fêmeas BALB/c foram imunizados quatro vezes com 10 &#181;g dessa proteína na presença de diferentes formulações de adjuvantes [Adjuvante Completo/Incompleto de Freund (ACF/AIF), MPL-TDM, TiterMax, Hidróxido de Alumínio (Alum), Quil A, QS-21 e CpG-ODN 1826], individualmente, ou em combinação (Alum + QS-21 ou Alum + CpG-ODN 1826)). Nosso objetivo foi avaliar comparativamente a resposta de anticorpos (IgM, IgG e isotipos de IgG), induzida pelos diferentes esquemas de imunizações, visando futuros estudos pré-clínicos em primatas não humanos. Os títulos de anticorpos IgG contra (o ectodomínio) PvAMA-1 foram determinados por ELISA, duas semanas após cada imunização. A presença de IgM e dos isotipos de IgG também foi avaliada após o final do esquema de imunizações. Nossos resultados demonstraram que a proteína recombinante DII foi altamente imunogênica em camundongos BALB/c quando administrada na presença dos adjuvantes testados. Altos títulos de IgG1, IgG2a e IgG2b foram observados na maioria dos grupos (com exceção do adjuvante Alum), sugerindo uma resposta mista Th1/Th2. Finalmente, demonstramos que anticorpos monoclonais e policlonais anti-DII reconheceram a proteína nativa expressa na superfície de merozoítas de P. vivax, por imunofluorescência. Em conclusão, nossos resultados mostraram que a proteína recombinante o domínio II de PvAMA-1 (DII) foi imunogênico em camundongos BALB/c quando administrado na presença das diferentes formulações de adjuvantes testadas, sugerindo que esse antígeno possa ser utilizado como uma vacina de subunidade contra a malária vivax. / The Apical Membrane Antigen 1 (AMA-1) has been considered a malaria vaccine candidate against asexual blood stages of Plasmodium. Recently, we identified the domain II (DII) of Plasmodium vivax AMA-1 (PvAMA-1) as a region highly recognized by IgG antibodies from Brazilian individuals infected by P. vivax. In the present study, we evaluated the immunogenic properties of a bacterial recombinant PvAMA-1 DII. Groups of 6 female BALB/c were immunized four times with 10 &#181;g of recombinant protein in the presence of different adjuvant formulations [Complete/Incomplete Freunds Adjuvant (CFA/IFA), MPL-TDM, TiterMax, Aluminum hydroxide (Alum), Quil A, QS-21, CpG-ODN 1826] separately or in combination (Alum + QS-21 or Alum + CpG-ODN 1826). Our goal was to compare the antibody response (IgM, IgG and IgG subclass) induced by different protocols of immunization aiming at future pre-clinical studies in non-human primates. The IgG antibody titers against PvAMA-1 were determined by ELISA two weeks after each immunizing dose. The presence of IgM and IgG subclass were evaluated after the end of immunizations schedule. We found that the recombinant DII was highly immunogenic in BALB/c mice when administered in the presence of all adjuvant tested. High titers of IgG1, IgG2a and IgG2b were observed in all groups (except for Alum adjuvant), suggesting a mixed Th1/Th2 response. Finally, we demonstrated that monoclonal and polyclonal antibodies against DII recognized the native protein expressed on the P. vivax merozoite surface parasites by immunofluorescence. Together, our data demonstrated that the recombinant PvAMA-1(DII) was immunogenic in mice when administered in different adjuvant formulations, suggesting that this protein can be used as part of a sub-unit vaccine against malaria vivax.

O avanço no desenvolvimento de uma vacina contra o Plasmodium vivax exige a identificação de antígenos capazes de induzir uma resposta imune protetora contra a malária. O presente estudo avalia o potencial da proteína-3 da superfície de merozoítos de P. vivax (PvMSP-3), como candidata a vacina. As proteínas recombinantes representando a região C-terminal da MSP-3&#945; e diferentes regiões (N e C-terminal e proteína inteira) da MSP-3&#946; de P. vivax foram utilizadas como antígeno. A imunogenicidade destas proteínas recombinantes foi avaliada em camundongos BALB/c, utilizando adjuvantes agonistas de TLR (flagelina FliC de Salmonella Typhimurium e CpG ODN) ou adjuvantes convencionais, tais como hidróxido de alumínio, saponinas, TiterMax Gold e adjuvante incompleto de Freund. Os títulos de anticorpos IgG foram determinados por ELISA utilizando soros de camundongos coletados duas semanas após cada dose de imunização. Nossos resultados demonstraram que a MSP-3&#945; e a MSP-3&#946; foram capazes de induzir altos títulos de anticorpos em camundongos na presença de diferentes adjuvantes, incluindo agonistas de TLR. Dentre as formulações testadas, aquelas contendo os adjuvantes CPG ODN 1826, Quil A, TiterMax e adjuvante incompleto de Freund foram mais imunogênicas e, portanto, mais promissoras para os ensaios pré-clínicos em primatas não-humanos. Usando camundongos TLR-4 KO, nós demonstramos que a proteína MSP-3&#946; tem uma propriedade adjuvante intrínseca que é independente do TLR4 e que a contaminação por LPS na proteína purificada não desempenha qualquer papel no nosso sistema. / The advance in the development of a vaccine against Plasmodium vivax requires the identification of immunodominant antigens able to induce a protective immune response against malaria. The present study evaluates the potential of the Merozoite Surface Protein 3 of P. vivax (PvMSP-3) as vaccine candidate. Recombinant proteins representing the C-terminal region of MSP-3&#945; and different regions of MSP-3&#946; (N and C-terminal and full-length protein) of P. vivax were used as antigen. The immunogenicity of these recombinants was evaluated in BALB/c mice using as adjuvant TLR agonists (FliC flagellin of Salmonella Typhimurium and CpG motif-containing DNA) or conventional adjuvants such as Aluminum hidroxide, Saponins, TiterMax Gold and Incomplete Freund\'s Adjuvant. The IgG antibodies were determined by ELISA in sera from mice two weeks after each immunizing dose. Our results demonstrated that MSP-3&#945; and MSP-3&#946; were able to induce high antibody titres in mice in the presence of different adjuvants, including TLR agonists. Among the tested formulations, the adjuvants CPG ODN 1826, Quil A, TiterMax and Incomplete Freund\'s Adjuvant were more immunogenic, therefore more promising for pre-clinical trials in non-human primates. Using TLR-4 KO mice, we demonstrated that the MSP-3&#946; protein has an intrinsic adjuvant property that is independent of TLR4 and that contaminating LPS in the purified protein did not play any role in our system.

O Antígeno 1 de Membrana Apical (AMA-1) é um dos mais promissores candidatos a vacina contra a fase sanguínea da malária. No presente estudo, geramos uma nova proteína recombinante baseada no ectodomínio de AMA-1 de P. vivax (PvAMA-1) a partir do gene sintético com códon otimizado para expressão secretada na levedura Pichia pastoris. Por ELISA, a proteína PvAMA-1 foi reconhecida por 62,5% dos soros de pacientes da Amazônia brasileira infectados por P. vivax. A imunogenicidade de PvAMA-1 foi avaliada em camundongos BALB/c, utilizando protocolos homólogos e heterólogos de indução e reforço com DNA plasmidial e/ou proteína recombinante, emulsificada em Adjuvante de Freund. Os resultados mostraram que a eficiência da imunização é dependente da presença da proteína emulsificada em adjuvante forte. As imunizações subseqüentes foram realizadas com a proteína recombinante emulsificada em diferentes adjuvantes: sais de alumínio (Alum), Monophosphoryl Lipid A (MPLA) de Bordetella pertussis, flagelina FliC de Salmonella Typhimurium, saponina Quil A e Adjuvante Incompleto de Freund (AIF). Os resultados demonstraram que as imunizações na presença de Quil A e AIF foram capazes de induzir altos títulos de anticorpos IgG e uma resposta de isotipos de IgG mais balanceada, caracterizando um padrão do tipo Th1/Th2. Títulos de anticorpos mais baixos, mas também expressivos, foram obtidos na presença de Alum, MPLA, Alum + MPLA e Alum + FliC. A análise da resposta proliferativa, por citometria de fluxo utilizando marcação com CFSE, mostrou que células esplênicas CD3+CD4+, assim como CD3+CD8+, de animais imunizados com PvAMA-1 na presença dos adjuvantes Alum, Alum + MPLA, Quil A e AIF foram capazes de proliferar especificamente in vitro. Por imunofluorescência, soros policlonais de camundongos imunizados com o antígeno na presença de MPLA e Quil A foram capazes de reconhecer a proteína nativa expressa em isolados de P. Vivax da Ásia. Visando futuros testes pré clínicos em primatas não humanos, a proteína PvAMA-1 foi produzida em boas práticas de laboratório (BPL) por uma companhia especializada e o potencial imunogênico da proteína foi confirmado em imunizações posteriores. Em conjunto, nossos resultados demonstram que PvAMA-1 é um antígeno promissor para ser explorado em protocolos de imunização contra malária vivax, individualmente, ou em combinação com outros antígenos. / The Apical Membrane Antigen 1 (AMA-1) is one of the most promissing vaccine candidates against the erythrocytic stage of malaria. In the present study we generated a new recombinant protein based on AMA-1 ectodomain of P. vivax (PvAMA-1) using a synthetic codon optimized gene for yeast secreted expression. By ELISA, the protein PvAMA-1 was recognized by 62,5% of the sera from Brazilian Amazonia patients infected by P. vivax. The immunogenicity of PvAMA-1 was evaluated in BALB/c mice using homologous and heterologous protocols of prime and boost with plasmidial DNA and/or recombinant protein emulsified in Freund adjuvant. The results showed that the efficiency of immunization is dependent on the presence of a strong adjuvant. The following immunizations were conducted using the protein emulsified in different adjuvants: aluminium salts (Alum), Monophosphoryl Lipid A (MPLA) of Bordetella pertussis, flagelin FliC of Salmonella Typhimurium, saponin Quil A and Incomplete Freund\'s Adjuvant (IFA). The results showed that immunizations in the presence of Quil A e IFA were able to induce high IgG titers and a more balanced IgG isotypes response, featuring a standard type Th1/Th2. Lower antibody titers, but also significant, were obtained in the presence of Alum, MPLA, Alum + MPLA and Alum + FliC. The proliferative cellular analysis, by flow cytometry using CFSE staining, showed that splenic cells CD3+CD4+, as well as CD3+CD8+ from immunized mice that received PvAMA-1 with Alum, Alum + MPLA, Quil A and IFA were specifically able to proliferate in vitro. By immunofluorescence, the polyclonal sera from mice immunized with the antigen in the presence of MPLA and Quil A were able to recognize native protein expressed in Asian P. vivax isolates. Aiming future pre-clinical assays in non-human primates, the protein PvAMA-1 was produced in good laboratory practices (GLP) conditions by a specialized company and its immunogenic efficiency was confirmed in later immunizations. Altogether, our results showed that PvAMA-1 is a promissor antigen to be explored in immunization protocols against vivax malaria, individually, or combined with other antigens.

O Plasmodium vivax é a espécie causadora de malária de maior distribuição mundial e maior prevalência nas Américas. A complexidade do ciclo de vida do parasito e sua extensa diversidade antigênica têm dificultado a obtenção de uma vacina eficaz e inferem que seja pouco provável que este objetivo seja alcançado utilizando um único antígeno. Neste contexto, a combinação de regiões imunodominantes de antígenos de um ou mais estágios do ciclo de vida do Plasmodium pode ser uma estratégia com melhor prognóstico na indução de resposta imune protetora e duradoura contra a atividade parasitária. Este trabalho avaliou a imunogenicidade, em camundongos, de uma formulação vacinal composta pela mistura dos antígenos CSP, pré-eritrocítico e AMA-1, o qual é expresso em ambos os estágios, préeritrocítico e eritrocítico assexuado. A proteína quimérica yPvCSAllFL, que contém epítopos para células B da região central (repeats) das 3 variantes alélicas PvCSP-VK210, PvCSP-VK247 e PvCSP-P. vivax-like fusionados, e a yPvAMA-1 foram expressas com sucesso em leveduras Pichia pastoris e purificadas por métodos cromatográficos para a imunização de camundongos BALB/c e C57BL/6, na presença do adjuvante Poly(I:C), agonista de TLR3. Por ELISA, foram determinados os títulos de anticorpos, as subclasses de IgG e a avidez destes pelas proteínas indutoras, administradas isoladamente ou em combinação. A resposta de anticorpos anti-yPvCSAllFL mostrou ser linhagem dependente, tendo sido observado altos títulos de anticorpos IgG (106) em C57BL/6, os quais se mantiveram elevados por até 6 meses após a última dose. Os anticorpos anti-yPvCSAllFL, predominantemente IgG1, foram capazes de reconhecer proteínas representando as 3 variantes alélicas. No geral, a coadministração dos antígenos yPvCSAllFL e yPvAMA-1 não comprometeu a resposta de anticorpos individual. Utilizando este protocolo de vacinação não foi possível detectar resposta proliferativa de células TCD3+TCD4+ ou TCD3+TCD8+ específicas após a estimulação com yPvCSAllFL. Os índices de proliferação (8,31%) e o padrão de secreção das citocinas IFN-&#947;, IL-2, TNF-&#945; e IL-10, associados à yPvAMA-1, sofreram redução com a coadministração de antígenos (6,33%) e alteração, com elevação de IL-2 em detrimento das demais citocinas. Os dados gerados no estudo das formulações vacinais apresentadas neste trabalho podem ser úteis para o desenvolvimento de uma vacina anti-P. vivax, principalmente por explorarem estratégias de combinação e fusão de antígenos. / Plasmodium vivax is the species of malaria more widely distributed worldwide and with higher prevalence in the Americas. The complexity of the parasite life cycle and its extensive antigenic diversity have hampered the achievement of an effective vaccine and infer that it is unlikely that this goal will be achieved using a single antigen. In this context, the combination of immunodominant regions of antigens of one or more stages of the Plasmodium life cycle can be a strategy with better prognosis at inducing protective and durable immune responses against this parasite. Our study assessed the immunogenicity of vaccine formulations consisting of mixture of antigens CSP, pre-erythrocytic and AMA-1, which is expressed in the both stages, pre-erythrocytic and erythrocytic asexual, in mice. The chimeric protein yPvCSAllFL, which contains B-cell epitopes of the central region (repeats) of the 3 allelic variants PvCSP-VK210, PvCSP-VK247 and PvCSP-P. vivax-like fused, and the yPvAMA-1 were successfully expressed in the yeast Pichia pastoris and purified by chromatographic methods for immunization of BALB/c and C57BL/6 mice in the presence of the adjuvant Poly(I:C), a TLR3 agonist. By ELISA, we determined the titles, IgG subclasses and the avidity of the antibodies to these proteins, administered alone or in combination. The immune response to yPvCSAllFL proved to be dependent on mouse strain, having been observed high titers of IgG antibodies (106) in C57BL/6, which remained high for up to 6 months after the last dose. Anti-yPvCSAllFL antibodies, predominantly IgG1, were able to recognize proteins representing the 3 allelic variants. In general, the co-administration of yPvCSAllFL and yPvAMA-1 antigens did not compromise the individual antibodies response. Using this vaccination protocol, we could not detect cell specific proliferative responses of TCD3+TCD4+ or TCD3+TCD8+ after stimulation with yPvCSAllFL. The proliferation (8.31%) and the pattern of secretion of cytokines IFN-&#947;, IL-2, TNF-&#945; and IL-10, associated with the yPvAMA-1, were reduced during the co-administration (6.33%) and compensated by the elevation of IL-2. The data generated on the study of vaccine formulations presented in this thesis may be useful for the development of a vaccine anti-P. vivax, mainly by exploiting strategies of combination and fusion of antigens.

Malária é um problema de saúde pública global. No Brasil, Plasmodium vivax é o causador de 85% dos 142 mil casos de malária relatados em 2013. Estudos genômicos tem o potencial de complementar os estudos in vitro, provendo novas oportunidades para o descobrimento de alvos para vacinas e drogas, além de auxiliar em testes de expressão de genes. Deste modo, este projeto teve como objetivos, a partir do sequenciamento de 9 genomas nucleares de isolados simpátricos brasileiros de P. vivax coletados entre 2012 e 2013, avaliar: (a) os níveis e os potenciais mecanismos de geração de diversidade genética utilizando polimorfismos de base única (SNPs), (b) os níveis de estrutura populacional na população brasileira simpátrica em comparação com outras regiões da América, (c) os loci sob pressão seletiva. Utilizamos técnicas de sequenciamento de nova geração associadas à identificação de marcadores moleculares do tipo SNPs e análises subsequentes de diversidade, estrutura populacional e de evidências de seleção natural. Nossos resultados mostraram a população do Brasil compartilhando mais ancestrais com a do Peru, bem como a da Colômbia compartilhando mais ancestrais com a do México. Genes de famílias previamente descritas como hipervariáveis foram observados com os maiores valores de diversidade; alguns genes envolvidos com a interação parasitohospedeiro apresentaram evidência de seleção balanceada, a partir do valor D de Tajima. A alta frequência de recombinação meiótica encontrada em amostras das populações de parasitos, apesar da baixa transmissão local de malária, resultou no declínio do desequilíbrio de ligação entre pares de SNPs situados em uma distância de 50 pares de bases ao longo do mesmo cromossomo. Os dados apresentados corroboram com dados prévios de análises com uso de SNPs, complementando as informações sobre diversidade em escala genômica de populações de P. vivax nas Américas. / Malaria is a public health problem worldwide. In Brazil, Plasmodium vivax is responsible for 85% of the 142 thousand malaria cases reported in 2013. Genomic studies complement in vitro experiments, providing new opportunities for the discovery of targets for vaccines and drugs, as well as enabling gene expression tests. Our objectives for this project, using genome sequences from 9 P. vivax Brazilian sympatric isolates collected between 2012 and 2013, were to evaluate the: a) genetic diversity levels and potential generating mechanisms using single nucleotide polymorphisms (SNPs); b) population structure levels in the Brazilian population in comparison with other regions in America; c) loci under selective pressure. We used new generation sequencing techniques in association with the identification of SNPs as molecular markers, and subsequent analysis of diversity , population structure and natural selection. Our results show the Brazilian population sharing more ancestrals with Peru, and in addition Colombia sharing more ancestrals with Mexico. Families of genes previously described as hyper variable were observed to have the same diversity values and some genes involved in the host-parasite interaction presented evidences of positive selection, considering Tagima`s D. The high meiotic recombination frequency found in the parasite population samples, despite local low transmission, produced a decrease in the linkage disequilibrium between SNPs pairs located in the same chromosome at a 50 base pairs distance.The results presented here corroborate previous results using SNPs analysis, complementing knowledge on diversity at a genomic scale of P. vivax in the Americas.

Plasmodium vivax é o parasita causador de malária humana com maior distribuição global, responsável pela redução da qualidade de vida de milhões de pessoas ao redor do mundo. O objetivo geral do trabalho foi contribuir, através de metodologias estatísticas e de bioinformática, para o entendimento do mecanismo de escape da eliminação pelo baço do hospedeiro utilizado por P. vivax. Para isso, primeiramente realizou-se a análise estatística de um experimento de transcritômica, através de microarrays. Esse experimento foi conduzido previamente pelo grupo de colaboradores do presente estudo, utilizando um modelo animal, Aotus lemurinus griseimembra, com o objetivo de identificar genes de P. vivax expressos somente em parasitas retirados de macacos que possuíam o baço intacto. Em uma segunda fase, foi projetado um tiling array contendo todos os éxons e as regiões 5UTR e 3UTR disponíveis do genoma de P. vivax, que será utilizado para a realização de mais investigações a respeito da influência da presença do baço na expressão gênica de P. vivax. Na última etapa, foi conduzida uma melhoria na anotação funcional do genoma de P. vivax, através de uma metodologia automática, com o objetivo de adicionar informações para auxiliar na interpretação biológica dos resultados obtidos anteriormente e em estudos futuros. / Plasmodium vivax is the parasite that causes the human malaria type with the largest global distribution and it is responsible for quality of life impairment of millions of people around the world. The general purpose of this study was contribute to understand the mechanism used by P. vivax to scape from the host spleen elimination, through statistical methodologies and bioinformatics. First of all, we carried out statistical analysis of a microarray experiment conducted earlier by the collaborators of this study, using Aotus lemurinus griseimembra as model organism, in order to identify genes of P. vivax expressed only in parasites extracted from monkeys with intact spleen. In the second step, we designed a tiling array containing 5\'UTR, 3\'UTR and all the exons of the P. vivax genome, which will be used to perform more experiments to investigate the role of the spleen on the parasite gene expression. In the last step, we add information to the functional annotation of P. vivax genome, through an automated methodology, to improve the biological interpretation of the results previously obtained and in future studies.

Nos últimos anos, estudamos vários aspectos da resposta imune naturalmente adquirida em indivíduos de diferentes áreas endêmicas da Região Amazônica expostos à malária. Para isso, utilizamos proteínas recombinantes baseadas em antígenos de formas sanguíneas de P. vivax, os quais têm sido considerados candidatos à vacina contra a malária vivax. No presente trabalho, nossos estudos imunoepidemiológicos concentraram-se em 396 indivíduos de uma comunidade rural da Amazônia ocidental brasileira, localizada no Estado do Acre, com o objetivo de realizar um estudo transversal e longitudinal da resposta de anticorpos contra um painel de proteínas recombinantes derivadas de merozoítos de P. vivax (MSP119, AMA-1, MSP3&#945; e MSP3&#946;). Para isso, os soros desses indivíduos foram testados por ELISA quanto ao reconhecimento das quatro proteínas recombinantes. As proporções de indivíduos na linha de base com anticorpos IgG contra MSP119, AMA- 1, MSP3&#945; e MSP3&#946; foram de 59,8%, 50,0%, 23,5% e 26,5%, respectivamente. Dentre esses indivíduos, apenas 10,9% tinham infecções por P. vivax, P. falciparum ou malária mista. No grupo de infectados por P. vivax, a proporção de respondedores foi maior para as proteínas recombinantes MSP119 e AMA-1, atingindo 78,6%, em ambos os casos. A proporção de indivíduos com anticorpos para cada uma das proteínas associou-se com o maior tempo de exposição à malária, exceto para a MSP3&#946;. Além disso, a positividade foi mais alta nas áreas de maior risco de transmissão. Não observamos associações relevantes entre o genótipo do antígeno Duffy dos indivíduos e presença de anticorpos para as proteínas estudadas. No estudo longitudinal, observamos um aumento da prevalência de respondedores durante a parasitemia patente, sendo de 81,9%, 80,9%, 31,9% e 48,9% para a MSP119, AMA-1, MSP3&#945; e MSP3&#946;, respectivamente. Em conclusão, nossos resultados confirmam a alta antigenicidade dessas proteínas, o que pode ser de grande importância para futuros ensaios clínicos na região. / In recent years we studied various aspects of the naturally acquired immune response in individuals from different endemic areas of the Amazon region exposed to malaria. For this purpose we used recombinant proteins based on P. vivax blood stage antigens considered candidates for a vaccine against vivax malaria. In the present study, we focused on 396 individuals from a rural community in western Brazilian Amazon located at the state of Acre. We conducted a transversal and longitudinal study of the antibody response to a panel of recombinant proteins representing P. vivax merozoites surface antigens (MSP119, AMA-1, MSP3&#945; and MSP3&#946;). The sera of these individuals were tested by ELISA for the recognition of the four antigens mentioned above. The proportions of individuals at the baseline with IgG antibodies to MSP119, AMA-1, MSP3&#945; and MSP3&#946; were 59.8%, 50.0%, 23.5% and 26.5%, respectively. Among these individuals, 10.9% had patent malaria infections with either P. vivax or P. falciparum or both. Among individuals with patent P. vivax infection, the frequency of responders was high for MSP119 and AMA-1, (78.6% in both cases). Except in the case of MSP3&#946;, the proportion of individuals with antibodies to each protein correlated with the time of malaria exposure. Also, the positivity was higher in areas of higher transmission levels. No relevant association was found between the Duffy genotypes and presence of antibodies to the different antigen. In longitudinal study, we observed an increased prevalence of responders during patent parasitemia, 81.9% 80.9% 31.9% and 48.9% to MSP119, AMA-1, MSP3&#945; and MSP3&#946;, respectively. In conclusion, our results confirm the high antigenicity of these proteins, which can be of great importance for future clinical trials in the region.

A malária é um problema de saúde pública no Brasil e no mundo. Em 2016, o número de casos estimado pela Organização Mundial de Saúde foi de 216 milhões. Plasmodium falciparum é a espécie mais prevalente e responsável pelo maior número de mortes no mundo, sobretudo no continente africano. Por outro lado, o Plasmodium vivax é conhecido por sua ampla distribuição geográfica, sendo a espécie que predomina nas Américas, incluindo o Brasil. Nos últimos 20 anos, nosso grupo tem gerado e caracterizado diversas proteínas recombinantes baseadas em antígenos imunodominantes de P. vivax que podem servir como base para o desenvolvimento de uma vacina contra malária. Entre os antígenos de merozoítas, uma das principais proteínas em estudo pelo nosso grupo é o Antígeno 1 de Membrana Apical de P. vivax (PvAMA-1), caracterizado previamente como altamente imunogênico em infecções naturais e em camundongos imunizados, na presença de diferentes adjuvantes. O objetivo do presente estudo foi investigar o efeito da diversidade antigênica dessa proteína no reconhecimento por anticorpos específicos e na indução de imunidade contra o parasita. Para isso, foram geradas seis novas proteínas representando diferentes alelos descritos na natureza: PvAMA-1-Belem, PvAMA-1-Sal-I, PvAMA-1-Chesson-I, PvAMA-1-SK0814-apical, PvAMA-1-Indonesia-XIX e PvAMA-1-PNG_62_MU. As proteínas recombinantes foram expressas em leveduras Pichia pastoris e purificadas em duas etapas cromatográficas. Em seguida, as imunizações em camundongos C57BL/6 foram realizadas com as proteínas administradas de forma isolada, ou em combinação, na presença do adjuvante agonista de TLR3 (Poly I:C). Por ELISA, observamos que todas as formulações foram capazes de induzir anticorpos IgG contra as proteínas homólogas e heterólogas, o que sugere que a diversidade antigênica entre as formas alélicas não compromete o reconhecimento. Os dados gerados no presente trabalho sugerem que uma formulação contendo mistura de diferentes alelos representando a proteína AMA-1 pode ser explorada para o desenvolvimento de uma vacina de ampla cobertura contra o P. vivax. / Malaria is a public health problem in Brazil and throughout the world. In 2016, the World Health Organization estimated there were 216 million cases of malaria. Plasmodium falciparum is the most prevalent species and is responsible for the largest number of deaths, especially in the African continent. However, Plasmodium vivax is known for its wide geographic distribution, being the species that prevails in the Americas, including Brazil. In the last 20 years, our group has generated and characterized several recombinant proteins based on immunodominant antigens of P. vivax that can serve as a basis for the development of a malaria vaccine. Among the merozoite antigens, one of the main proteins studied by our group is P. vivax apical membrane antigen-1 (PvAMA-1), previously characterized as highly immunogenic in natural infections and immunized mice, in the presence of different adjuvants. The objective of this study was to investigate the effect of antigenic diversity of this protein in the recognition of specific antibodies and the induction of immunity against the parasite. For this, six new proteins were generated representing different alleles described in nature: PvAMA-1-Belem, PvAMA-1-Sal-i, PvAMA-1-Chesson-i, PvAMA-1-SK0814-apical, PvAMA-1-Indonesia-XIX, and PvAMA-1-PNG_62_MU. Recombinant proteins were expressed in Pichia pastoris yeast and purified by two chromatographic stages. Then, C57BL/6 mice were immunized with these proteins administered in isolation or in combination, in the presence of the TLR3 agonist adjuvant, Poly I:C. Using an enzyme-linked immunosorbent assay, we observed that all formulations induced IgG antibodies against homologous and heterologous proteins. This indicates that antigenic diversity between allele forms does not compromise recognition. This finding suggests that a formulation containing a mixture of different alleles representing the PvAMA-1 protein can be exploited for developing of a wide coverage vaccine against P. vivax.

Poucos estudos descrevem os aspectos histopatológicos da malária placentária em áreas de transmissão instável para Plasmodium vivax. Pretendemos identificar as alterações histopatológicas e suas intensidades, avaliar o impacto de fatores clínicos e epidemiológicos e a associação dos níveis de citocinas e anafilatoxinas relacionadas à malária placentária causada por Plasmodium vivax. Um estudo longitudinal foi realizado em Cruzeiro do Sul (Acre), com seleção de gestantes não infectadas e infectadas. A prevalência de malária placentária detectada por histologia foi de 13,5%. Não foram encontradas evidências microscópicas da adesão por P. vivax no sinciciotrofoblasto, porém esta espécie ocasionou danos placentários semelhantes aos observados na malária gestacional por P. falciparum, porém com intensidade menor do que a observada em áreas de alta transmissão. As alterações ocasionadas podem ser decorrentes de distúrbios locais e sistêmicos que contribuem para um desfecho desfavorável durante a malária gestacional e placentária ocasionadas por P. vivax. / Few studies describe histopathological aspects of placental malaria in unstable transmission areas for Plasmodium vivax. The objectives of the present work were to identify histopathological alterations and their intensities by assessing the impact of clinical and epidemiologic factors and the association of cytokines and anaphylatoxin levels related to gestational and placental malaria caused by the Plasmodium vivax. A longitudinal study was performed in Cruzeiro do Sul (Acre) by selecting non-infected and infected pregnant. No microscopic evidence of adhesion were found for that species in the syncytiotrophoblast, but this species cause similar placental damage to those seen in P. falciparum malaria, but with lower intensity than that observed in high transmission areas. Finally, the alterations caused in the placental environment can concomitantly result from local and systemic disturbances that jointly contribute to an unfavorable outcome upon the gestational and placental malaria caused by the P. vivax.